Tessuto-specifici miRNA Expression Profiling in Mouse cuore sezioni mediante ibridazione In Situ
Summary
micro-RNA (Mirna) è brevi e altamente omologhi sequenze di RNA, che serve come regolatori trascrizionali di RNA messaggeri (mRNA). Attuali metodi di rilevazione di miRNA variano nella sensibilità e specificità. Descriviamo un protocollo che unisce l’ibridazione in situ e immunostaining per il rilevamento simultaneo di miRNA e proteina molecole su sezioni di tessuto di cuore di topo.
Abstract
micro-RNA (Mirna) è trascritti di RNA singolo filamento che associare a RNA messaggeri (mRNA) e inibiscono la loro traduzione o promuovono la loro degradazione. Ad oggi, i miRNA sono stati implicati in un gran numero di processi biologici e malattia, che ha significato la necessità per i metodi di rilevamento affidabile delle trascrizioni di miRNA. Qui, descriviamo un protocollo dettagliato per la rilevazione basata su probe miRNA (DIG) Locked Nucleic Acid (LNA) digoxigenin-etichettati, combinati con proteine immunostaining su sezioni di cuore di topo. In primo luogo, abbiamo effettuato una tecnica in situ di ibridazione con la sonda per identificare espressione di miRNA-182 in sezioni di cuore da controllo e ipertrofia cardiaca nei topi. Successivamente, abbiamo effettuato immunostaining per la proteina cardiaca troponina T (cTnT), sulle stesse sezioni, a co-localizzano miRNA-182 con le cellule del cardiomyocyte. Usando questo protocollo, siamo stati in grado di rilevare miRNA-182 attraverso una fosfatasi alcalina basato su analisi colorimetrica e cTnT attraverso colorazione fluorescente. Questo protocollo può essere usato per rilevare l’espressione di qualsiasi miRNA di interesse attraverso sonde Scavare-contrassegnate LNA e l’espressione della proteina rilevanti su sezioni di tessuto di cuore di topo.
Introduction
micro-RNA (Mirna) è brevi (18 – 25 nucleotidi), singolo filamento, non codificanti RNA che fungono da regolatori negativi della espressione genica a livello post-trascrizionale inibendo la traduzione di RNA messaggero (mRNA) e/o promuovere la degradazione di mRNA 1. i miRNA sono trascritti da introni o essoni di codifica o di geni non codificanti e sono spaccati nel nucleo di DROSHA, al precursore Mirna (pre-miRNA), che sono strutture di breve gambo-ciclo di 70 nucleotidi2. Seguendo citoplasmico esportare, pre-miRNA vengono ulteriormente elaborati con DICER in Mirna maturi che si estendono su 18 – 25 nucleotidi3,4. Successivamente, il complesso di silenziamento indotto da RNA (RISC) incorpora questi miRNA come single-stranded RNA, che per il loro legame la regione 3′ non tradotta (3′-UTR) del loro mRNA bersaglio consente di sopprimere la loro espressione3,5 .
Negli ultimi tre decenni, poiché in primo luogo sono stati identificati, Mirna sono emerse al Maestro regolatori dell’espressione genica, i cui livelli di espressione sono strettamente controllato6. Ruoli per i miRNA sono stati descritti in organo sviluppo7,8,9,10,11,12, mantenimento della omeostasi13,14 , così come contesti di malattia che includono neurologico15,16,17,18,19, cardiovascolare20, patologie autoimmuni21 ,22, cancri23,24e altri25. Il crescente apprezzamento per la rilevanza dei modelli di espressione di miRNA ha portato avanti la necessità di metodi di rilevazione affidabili delle trascrizioni di miRNA. Tali metodi includono la Real Time PCR, microarray, Northern Blotting, ibridazione in situ e altri, che variano per la sensibilità, la specificità e la potenza quantitativa, principalmente dovuto al fatto che miRNA trascrizioni sono costituite da brevi e sequenze altamente omologhe6.
Recentemente abbiamo segnalato un importante ruolo dei miRNA-182 nello sviluppo dell’ipertrofia del miocardio26, una condizione che descrive l’adeguamento strutturale del cuore in risposta a richieste emodinamiche elevati27,28. L’ipertrofia cardiaca è caratterizzata dall’aumento della massa miocardica, che, se associato con rimodellamento maladattativo29, può condurre al rischio aumentato per insufficienza cardiaca, una condizione pari al 8,5% di tutti i decessi attribuibili a cardiovascolare malattia30.
Qui, descriviamo il nostro protocollo che combina l’ibridazione in situ con sonda di acido nucleico (DIG) bloccato (LNA) e immunostaining per la rilevazione simultanea di miRNA e proteina molecole su sezioni di tessuto di cuore di topo, digoxigenin-labeled in nostro modello dell’ipertrofia cardiaca.
Protocol
Representative Results
Discussion
rilevazione di miRNA trascrizione può essere raggiunto attraverso tecniche diverse che variano nella sensibilità, specificità e potere quantitativa. Qui, dimostriamo l’accoppiamento di miRNA ibridazione in situ con immunostaining e descrivere un protocollo che consente la valutazione simultanea dei livelli di espressione di miRNA e proteina molecole, le stesse sezioni di cuore. Abbiamo in primo luogo mostrano come eseguire ibridazione in situ di scavare-contrassegnato LNA miRNA sonde su sezioni di cu…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Vorremmo ringraziare Athanasios Papangelis, per osservazioni critiche sul manoscritto. FM è supportato dal Biotechnology and Biological Sciences Research Council (BBSRC; BB/M009424/1). IP è supportato da American Heart Association scienziato Development Grant (17SDG33060002).
Materials
| Diethylpyrocarbonate | Sigma Aldrich | D5758 | DEPC |
| Phosphate buffered saline | Sigma Aldrich | P4417 | PBS |
| Tween-20 | American Bioanalytical | AB02038 | non-ionic surfactant |
| Histoclear | National Diagnostics | HS-200 | |
| Proteinase K, recombinant, PCR Grade | Sigma Aldrich | 3115879001 | ProK |
| Paraformaldehyde | Sigma Aldrich | P6148 | PFA |
| Sodium Chloride | ThermoFisher | S271 | NaCl |
| Magnesium Chloride Hexahydrate | ThermoFisher | M33 | MgCl2 |
| Tris | Sigma Aldrich | T6066 | |
| Hydrochloric Acid Solution, 1 N | ThermoFisher | SA48 | HCl |
| Hydrochloric Acid Solution, 12 N | ThermoFisher | S25358 | HCl |
| 1-Methylimidazole | Sigma Aldrich | 336092 | |
| N-(3-Dimethylaminopropyl)-N′-ethylcarbodiimide hydrochloride | Sigma Aldrich | 39391 | EDC |
| Hydrogen peroxide solution H2O2 | Sigma Aldrich | 216763 | H2O2 |
| Trisodium citrate dihydrate | Sigma Aldrich | S1804 | Sodium Citrate |
| miRCURY LNA miRNA ISH Buffer Set (FFPE) | Qiagen | 339450 | scramble miRNA/U6 snRNA |
| miRCURY LNA mmu-miR-182 detection probe | QIagen | YD00615701 | 5'-DIG and 3'-DIG labelled |
| Levamisol hydrochloride | Sigma Aldrich | 31742 | |
| Bovine Serum Albumin | Sigma Aldrich | A9647 | BSA |
| NBT/BCIP Tablets | Sigma Aldrich | 11697471001 | NBT-BCIP |
| Potassium Chloride | ThermoFisher | P217 | KCl |
| DAPI solution (1mg/ml) | ThermoFisher | 62248 | DAPI |
| Glass coverslip | ThermoFisher | 12-545E | Glass coverslip |
| Plastic coverslip | Grace Bio-Labs | HS40 22mmX40mmX0.25mm | RNA-ase free plastic coverslip |
| Anti-Digoxigenin-AP, Fab fragments | Sigma Aldrich | 11093274910 | DIG antibody |
| Hydrophobic barrier pen | Vector Laboratories | H-4000 | Pap pen |
| Anti-Cardiac Troponin T antibody | Abcam | ab92546 | cTnT antibody |
| Goat anti-Rabbit IgG (H+L) Cross-Absorbed Secondary Antibody, Alexa Fluor 568 | ThermoFisher | A-11011 | anti-rabbit-568 antibody |
| Dako Fluorescence Mounting Medium | DAKO | S3023 | mounting medium |
| Sheep serum | Sigma Aldrich | S3772 | |
| Goat serum | Sigma Aldrich | G9023 | |
| Deionized Formamide | American Bioanalytical | AB00600 | |
| Hybridization Oven | ThermoFisher | UVP HB-1000 Hybridizer |
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