MiRNA רקמות ספציפיות ביטוי פרופיל בהלב העכבר באמצעות סעיפים באתרו של הכלאה
Summary
מיקרו-RNAs (miRNAs) הם רצפי RNA הומולוגי מאוד וקצר, הגשה הרגולטורים post-transcriptional RNAs שליח (mRNAs). שיטות איתור miRNA הנוכחית להשתנות רגישות. אנו מתארים פרוטוקול המשלבת בחיי עיר הכלאה immunostaining לגילוי בו-זמניות של מולקולות miRNA וחלבון במקטעי רקמת הלב העכבר.
Abstract
מיקרו-RNAs (miRNAs) הן תעתיקים RNA חד-גדילי לאגד RNAs שליח (mRNAs) ו לעכב את התרגום שלהם או לקדם את שפלותם. עד כה, miRNAs היו מעורבים מספר רב של תהליכים ביולוגיים ומחלות, אשר יש למסומן את הצורך בשיטות זיהוי אמין של תעתיקים miRNA. כאן, אנו מתארים את פרוטוקול מפורט לגילוי התווית על-ידי digoxigenin (מחדירים) נעולים חומצת גרעין (מגבר קדם) המבוסס על בדיקה miRNA, בשילוב עם חלבון immunostaining על העכבר לב חלקים. ראשית, אנו לבצע בחיי עיר הכלאה טכניקה באמצעות המכשיר לזיהוי miRNA-182 ביטוי בסעיפים הלב של שליטה ועכברים היפרטרופיה. הבא, נוכל לבצע immunostaining לב החלבונים טרופונין T (cTnT), על הסעיפים זהה, כדי להתאים לשפה משותפת miRNA-182 עם תאי cardiomyocyte. באמצעות פרוטוקול זה, היינו מסוגלים לזהות miRNA-182 דרך phosphatase אלקליין המבוסס על ערכי צבע מוחלטים assay, cTnT דרך מכתים פלורסנט. פרוטוקול זה יכול לשמש כדי לזהות את הביטוי של כל miRNA עניין באמצעות מגבר קדם התווית על-ידי החפירה הגששים, וביטוי חלבון הרלוונטיים במקטעי רקמת הלב העכבר.
Introduction
מיקרו-RNAs (miRNAs) הם קצרים (18 – 25 נוקלאוטידים), RNAs חד-גדילי, noncoding המתפקדים הרגולטורים שלילי של ביטוי גנים ברמת post-transcriptional על ידי עיכוב תרגום RNA שליח (mRNA) ו/או קידום mRNA השפלה 1. miRNAs הם עיבד אינטרונים או exons של קידוד או noncoding גנים והם ביקע בגרעין על-ידי DROSHA, כדי קודמן miRNAs (pre-miRNAs), אשר הם גזע-לולאת מבנים של נוקלאוטידים 702. בעקבות cytoplasmic לייצא, pre-miRNAs מעובדים נוספים על ידי לטעמים לתוך miRNAs בוגרת המתפרסים על פני 18 – 25 נוקלאוטידים3,4. לאחר מכן, המתחם שתיקה RNA-induced (RISC) משלבת miRNAs האלה כמו RNAs חד-גדילי, המאפשר את הכריכה שלהם לאזור 3′ לא מתורגם (3′-UTR) של mRNAs היעד שלהם כדי לדכא את הביטוי3,5 .
בתוך שלושה עשורים, מאז שהם זוהו קודם, miRNAs הופיעו על הרגולטורים מאסטר של ביטוי גנים, רמות הביטוי האישי שלו הם מגבילים6. תפקידים miRNAs תוארו אורגן פיתוח7,8,9,10,11,12, תחזוקה של הומאוסטזיס13,14 , כמו גם מחלות בהקשרים הכוללים נוירולוגיות15,16,17,18,19,20לב וכלי דם, מחלות אוטואימוניות21 ,22,23,סרטן24ועוד25. הערכה הגוברת על הרלוונטיות של דפוסי ביטוי miRNA הביא קדימה את הצורך בשיטות זיהוי אמין של הפרוטוקולים miRNA. שיטות כאלה כוללות PCR בזמן אמת, מיקרו-מערכים, סופג בצפון, הכלאה בחיי עיר ועוד, אשר להשתנות רגישות, ירידה לפרטים, ובכוחו כמותית, בעיקר בשל העובדה כי miRNA תעתיקים המורכב מעובדים קצר ו רצפים הומולוגיים מאוד6.
לאחרונה דווח כאן תפקיד חשוב עבור miRNA-182 בפיתוח של שריר הלב היפרטרופיה26, מצב המתארת הסתגלות מבנית של הלב בתגובה לדרישות מוגברות בגרימת27,28. היפרטרופיה מאופיין על-ידי הגדלת מסת שריר הלב, אשר, אם המשויך שיפוץ maladaptive29, יכול להוביל לסיכון מוגבר לאי ספיקת לב, תנאי החשבונאי 8.5% ממקרי המוות כל המיוחס לב וכלי דם מחלת30.
כאן, אנו מתארים את הפרוטוקול שלנו המשלבת בחיי עיר הכלאה עם התווית על-ידי digoxigenin בדיקה (מחדירים) נעולים חומצת גרעין (מגבר קדם), immunostaining איתור בו-זמניות של מולקולות miRNA וחלבון במקטעי רקמת הלב העכבר, ב שלנו דגם של היפרטרופיה.
Protocol
Representative Results
Discussion
זיהוי תעתיק miRNA יכולה להיות מושגת באמצעות טכניקות שונות המשתנות רגישות, ירידה לפרטים, כוח כמותית. . הנה, נדגים את צימוד miRNA בחיי עיר הכלאה עם immunostaining. ומתארות פרוטוקול המאפשר להערכת בו-זמניות של רמות הביטוי של מולקולות miRNA, חלבון, על הלב הנוכשה. אנו הראשונים מראים כיצד לבצע בחיי עיר ?…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
ברצוננו להודות אנטאנאסיוס Papangelis, על תגובות ביקורתיות על כתב היד. FM נתמך על-ידי ביוטכנולוגיה ו מחקר מדעי הביולוגיה המועצה (BBSRC; BB/M009424/1). IP נתמך על ידי האמריקאי הלב האגודה מדען פיתוח המענק (17SDG33060002).
Materials
| Diethylpyrocarbonate | Sigma Aldrich | D5758 | DEPC |
| Phosphate buffered saline | Sigma Aldrich | P4417 | PBS |
| Tween-20 | American Bioanalytical | AB02038 | non-ionic surfactant |
| Histoclear | National Diagnostics | HS-200 | |
| Proteinase K, recombinant, PCR Grade | Sigma Aldrich | 3115879001 | ProK |
| Paraformaldehyde | Sigma Aldrich | P6148 | PFA |
| Sodium Chloride | ThermoFisher | S271 | NaCl |
| Magnesium Chloride Hexahydrate | ThermoFisher | M33 | MgCl2 |
| Tris | Sigma Aldrich | T6066 | |
| Hydrochloric Acid Solution, 1 N | ThermoFisher | SA48 | HCl |
| Hydrochloric Acid Solution, 12 N | ThermoFisher | S25358 | HCl |
| 1-Methylimidazole | Sigma Aldrich | 336092 | |
| N-(3-Dimethylaminopropyl)-N′-ethylcarbodiimide hydrochloride | Sigma Aldrich | 39391 | EDC |
| Hydrogen peroxide solution H2O2 | Sigma Aldrich | 216763 | H2O2 |
| Trisodium citrate dihydrate | Sigma Aldrich | S1804 | Sodium Citrate |
| miRCURY LNA miRNA ISH Buffer Set (FFPE) | Qiagen | 339450 | scramble miRNA/U6 snRNA |
| miRCURY LNA mmu-miR-182 detection probe | QIagen | YD00615701 | 5'-DIG and 3'-DIG labelled |
| Levamisol hydrochloride | Sigma Aldrich | 31742 | |
| Bovine Serum Albumin | Sigma Aldrich | A9647 | BSA |
| NBT/BCIP Tablets | Sigma Aldrich | 11697471001 | NBT-BCIP |
| Potassium Chloride | ThermoFisher | P217 | KCl |
| DAPI solution (1mg/ml) | ThermoFisher | 62248 | DAPI |
| Glass coverslip | ThermoFisher | 12-545E | Glass coverslip |
| Plastic coverslip | Grace Bio-Labs | HS40 22mmX40mmX0.25mm | RNA-ase free plastic coverslip |
| Anti-Digoxigenin-AP, Fab fragments | Sigma Aldrich | 11093274910 | DIG antibody |
| Hydrophobic barrier pen | Vector Laboratories | H-4000 | Pap pen |
| Anti-Cardiac Troponin T antibody | Abcam | ab92546 | cTnT antibody |
| Goat anti-Rabbit IgG (H+L) Cross-Absorbed Secondary Antibody, Alexa Fluor 568 | ThermoFisher | A-11011 | anti-rabbit-568 antibody |
| Dako Fluorescence Mounting Medium | DAKO | S3023 | mounting medium |
| Sheep serum | Sigma Aldrich | S3772 | |
| Goat serum | Sigma Aldrich | G9023 | |
| Deionized Formamide | American Bioanalytical | AB00600 | |
| Hybridization Oven | ThermoFisher | UVP HB-1000 Hybridizer |
References
- Bartel, D. P. MicroRNAs: genomics, biogenesis, mechanism, and function. Cell. 116, 281-297 (2004).
- Denli, A. M., Tops, B. B., Plasterk, R. H., Ketting, R. F., Hannon, G. J. Processing of primary microRNAs by the Microprocessor complex. Nature. 432, 231-235 (2004).
- Hutvagner, G., Zamore, P. D. A microRNA in a multiple-turnover RNAi enzyme complex. Science. 297, 2056-2060 (2002).
- Krol, J., et al. Structural features of microRNA (miRNA) precursors and their relevance to miRNA biogenesis and small interfering RNA/short hairpin RNA design. Journal of Biological Chemistry. 279, 42230-42239 (2004).
- Lim, L. P., Glasner, M. E., Yekta, S., Burge, C. B., Bartel, D. P. Vertebrate microRNA genes. Science. 299, 1540 (2003).
- Tian, T., Wang, J., Zhou, X. A review: microRNA detection methods. Organic and Biomolecular Chemistry. 13, 2226-2238 (2015).
- Fineberg, S. K., Kosik, K. S., Davidson, B. L. MicroRNAs potentiate neural development. Neuron. 64, 303-309 (2009).
- Ivey, K. N., et al. MicroRNA regulation of cell lineages in mouse and human embryonic stem cells. Cell stem cell. 2, 219-229 (2008).
- Houbaviy, H. B., Murray, M. F., Sharp, P. A. Embryonic stem cell-specific MicroRNAs. Developmental cell. 5, 351-358 (2003).
- Kasper, D. M., et al. MicroRNAs Establish Uniform Traits during the Architecture of Vertebrate Embryos. Developmental cell. 40, 552-565 (2017).
- Liu, N., Olson, E. N. MicroRNA regulatory networks in cardiovascular development. Developmental cell. 18, 510-525 (2010).
- Xiao, C., Rajewsky, K. MicroRNA control in the immune system: basic principles. Cell. 136, 26-36 (2009).
- Hartig, S. M., Hamilton, M. P., Bader, D. A., McGuire, S. E. The miRNA Interactome in Metabolic Homeostasis. Trends in endocrinology and metabolism: TEM. 26, 733-745 (2015).
- Ying, W., et al. Adipose Tissue Macrophage-Derived Exosomal miRNAs Can Modulate In Vivo and In Vitro Insulin Sensitivity. Cell. 171, 372-384 (2017).
- Perkins, D. O., et al. microRNA expression in the prefrontal cortex of individuals with schizophrenia and schizoaffective disorder. Genome biology. 8, R27 (2007).
- Miller, B. H., et al. MicroRNA-132 dysregulation in schizophrenia has implications for both neurodevelopment and adult brain function. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 109, 3125-3130 (2012).
- Xu, B., Hsu, P. K., Stark, K. L., Karayiorgou, M., Gogos, J. A. Derepression of a neuronal inhibitor due to miRNA dysregulation in a schizophrenia-related microdeletion. Cell. 152, 262-275 (2013).
- Hu, Y., Ehli, E. A., Boomsma, D. I. MicroRNAs as biomarkers for psychiatric disorders with a focus on autism spectrum disorder: Current progress in genetic association studies, expression profiling, and translational research. Autism research : official journal of the International Society for Autism Research. 10, 1184-1203 (2017).
- Wu, Y. E., Parikshak, N. N., Belgard, T. G., Geschwind, D. H. Genome-wide, integrative analysis implicates microRNA dysregulation in autism spectrum disorder. Nature neuroscience. 19, 1463-1476 (2016).
- Ikeda, S., et al. Altered microRNA expression in human heart disease. Physiological genomics. 31, 367-373 (2007).
- Mann, M., et al. An NF-kappaB-microRNA regulatory network tunes macrophage inflammatory responses. Nature Communications. 8, 851 (2017).
- O’Connell, R. M., et al. MicroRNA-155 promotes autoimmune inflammation by enhancing inflammatory T cell development. Immunity. 33, 607-619 (2010).
- Chan, E., Prado, D. E., Weidhaas, J. B. Cancer microRNAs: from subtype profiling to predictors of response to therapy. Trends in Molecular Medicine. 17, 235-243 (2011).
- He, L., et al. A microRNA component of the p53 tumour suppressor network. Nature. 447, 1130-1134 (2007).
- Kloosterman, W. P., Plasterk, R. H. The diverse functions of microRNAs in animal development and disease. Developmental cell. 11, 441-450 (2006).
- Li, N., et al. miR-182 Modulates Myocardial Hypertrophic Response Induced by Angiogenesis in Heart. Science Reports. 6, 21228 (2016).
- Meerson, F. Z. Compensatory hyperfunction of the heart and cardiac insufficiency. Circulation Research. 10, 250-258 (1962).
- Tardiff, J. C. Cardiac hypertrophy: stressing out the heart. Journal of Clinical Investigation. 116, 1467-1470 (2006).
- Burchfield, J. S., Xie, M., Hill, J. A. Pathological ventricular remodeling: mechanisms: part 1 of 2. Circulation. 128, 388-400 (2013).
- Benjamin, E. J., et al. Heart Disease and Stroke Statistics-2017 Update: A Report From the American Heart Association. Circulation. 135, e146-e603 (2017).
- Pena, J. T., et al. miRNA in situ hybridization in formaldehyde and EDC-fixed tissues. Nature Methods. 6, 139-141 (2009).
