Weefsel-specifieke miRNA expressie profilering in muis hart secties gebruiken In Situ hybridisatie
Summary
Micro-RNAs (miRNAs) zijn korte en zeer homologe RNA-sequenties, post-transcriptional regulatoren van messenger RNAs (mRNAs) bijeenkomen. Huidige miRNA detectiemethoden verschillen in gevoeligheid en specificiteit. We beschrijven een protocol dat in situ hybridisatie en immunokleuring voor gelijktijdige detectie van miRNA en eiwit moleculen op muis hart weefselsecties combineert.
Abstract
Micro-RNAs (miRNAs) zijn single-stranded RNA afschriften die binden aan messenger RNAs (mRNAs) en hun vertaling remmen of bevorderen van hun afbraak. Tot op heden zijn miRNAs betrokken bij een groot aantal biologische en ziekte processen, die de behoefte aan betrouwbare detectiemethoden van miRNA afschriften heeft aangegeven. Hier beschrijven we een gedetailleerd protocol voor heksenkruid-label (DIG) vergrendeld Nucleic Acid (LNA) sonde gebaseerde miRNA detectie, gecombineerd met eiwit immunokleuring op muis hart secties. Voor het eerst, we een in situ hybridisatie techniek met behulp van de sonde te identificeren van miRNA-182 expressie in hart secties van controle en hypertrofie van het hart muizen uitgevoerd. Vervolgens hebben we uitgevoerd immunokleuring voor cardiale troponine T (cTnT) eiwit, op dezelfde baanvakken, mede lokaliseren miRNA-182 met de cardiomyocyte cellen. Met behulp van dit protocol, waren wij kundig voor speurder miRNA-182 via een alkalische fosfatase gebaseerd colorimetrische bepaling, en cTnT door middel van fluorescerende vlekken. Dit protocol kan worden gebruikt om de uitdrukking van een miRNA van belang door DIG-geëtiketteerden LNA sondes, en relevante eiwit expressie op muis hart weefselsecties te detecteren.
Introduction
Micro-RNAs (miRNAs) zijn korte (18-25 nucleotiden), single-stranded, noncoding RNAs die als negatieve regelgevers van genexpressie op post-transcriptional niveau functioneren door remming van de boodschapper-RNA (mRNA) vertaling en/of bevordering van de aantasting van het mRNA 1. miRNAs zijn transcriptie van introns of exons van codering of noncoding genen en zijn in de nucleus door DROSHA, aan de voorloper van miRNAs (pre-miRNAs), die korte stam-lus structuren van 70 nucleotiden2gekloofd. Na cytoplasmatische exporteren, pre-miRNAs zijn verder verwerkt door DICER tot volwassen miRNAs die zich uitstrekken van 18-25 nucleotiden3,4. Vervolgens neemt het RNA-geïnduceerde silencing complex (RISC) deze miRNAs als single-stranded RNAs, die het mogelijk voor hun binding aan de 3′ niet-vertaalde regio (3′-UTR) van hun doel mRNAs maakt te onderdrukken hun expression3,5 .
Binnen de laatste drie decennia, aangezien ze voor het eerst werden geïdentificeerd, miRNAs opgedoken aan meester regelgevers van genexpressie, wiens eigen expressie niveaus strak gecontroleerde6 zijn. Rollen voor miRNAs zijn beschreven in orgel ontwikkeling7,8,9,10,11,12, onderhoud van homeostase13,14 , evenals ziekte contexten waarin neurologische15,16,17,18,19, cardiovasculaire20, auto-immune voorwaarden21 ,22, kankers23,24, e.a.25. De toenemende appreciatie voor de relevantie van miRNA expressiepatronen heeft de behoefte aan betrouwbare detectiemethoden van miRNA afschriften naar voren gebracht. Dergelijke methoden omvatten Real Time PCR, microarrays, het noordelijke bevlekken, in situ hybridisatie en anderen, die in de gevoeligheid, specificiteit en kwantitatieve macht, overwegend verschillen wijten aan het feit dat de miRNA Transcripten bestaan uit korte en zeer homologe reeksen6.
Onlangs meldden wij een belangrijke rol voor miRNA-182 in de ontwikkeling van de myocardiale hypertrofie26, een aandoening met een beschrijving van de structurele aanpassing van het hart in reactie op verhoogde hemodynamische eisen27,28. Hypertrofie van het hart wordt gekenmerkt door de toename van de myocardiale massa, die indien gekoppeld maladaptieve remodelleert29, kan leiden tot verhoogd risico op hartfalen, een aandoening die goed voor 8,5% van alle sterfgevallen toe te schrijven aan cardiovasculaire ziekte30.
Hier beschrijven we onze protocol dat in situ hybridisatie combineert met een heksenkruid-label (DIG) vergrendeld Nucleic Acid (LNA) sonde en immunokleuring voor de gelijktijdige detectie van miRNA en eiwit moleculen op muis hart weefselsecties, in onze model voor hypertrofie van het hart.
Protocol
Representative Results
Discussion
miRNA transcript detectie kan worden bereikt door middel van verschillende technieken die in de gevoeligheid, specificiteit en kwantitatieve macht verschillen. Hier tonen we de koppeling van miRNA in situ hybridisatie met immunokleuring en beschrijven een protocol waarmee voor gelijktijdige beoordeling van de niveaus van de expressie van miRNA en eiwit moleculen, op de dezelfde baanvakken van het hart. Eerst laten we zien hoe u kunt uitvoeren in situ hybridisatie aan DIG-geëtiketteerden LNA miRNA sonde…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Wij wil Athanasios Papangelis, dank voor kritische opmerkingen over het manuscript. FM wordt ondersteund door de biotechnologie en de biologische Sciences Research Council (BBSRC; BB/M009424/1). IP wordt ondersteund door de American Heart Association wetenschapper ontwikkeling Grant (17SDG33060002).
Materials
| Diethylpyrocarbonate | Sigma Aldrich | D5758 | DEPC |
| Phosphate buffered saline | Sigma Aldrich | P4417 | PBS |
| Tween-20 | American Bioanalytical | AB02038 | non-ionic surfactant |
| Histoclear | National Diagnostics | HS-200 | |
| Proteinase K, recombinant, PCR Grade | Sigma Aldrich | 3115879001 | ProK |
| Paraformaldehyde | Sigma Aldrich | P6148 | PFA |
| Sodium Chloride | ThermoFisher | S271 | NaCl |
| Magnesium Chloride Hexahydrate | ThermoFisher | M33 | MgCl2 |
| Tris | Sigma Aldrich | T6066 | |
| Hydrochloric Acid Solution, 1 N | ThermoFisher | SA48 | HCl |
| Hydrochloric Acid Solution, 12 N | ThermoFisher | S25358 | HCl |
| 1-Methylimidazole | Sigma Aldrich | 336092 | |
| N-(3-Dimethylaminopropyl)-N′-ethylcarbodiimide hydrochloride | Sigma Aldrich | 39391 | EDC |
| Hydrogen peroxide solution H2O2 | Sigma Aldrich | 216763 | H2O2 |
| Trisodium citrate dihydrate | Sigma Aldrich | S1804 | Sodium Citrate |
| miRCURY LNA miRNA ISH Buffer Set (FFPE) | Qiagen | 339450 | scramble miRNA/U6 snRNA |
| miRCURY LNA mmu-miR-182 detection probe | QIagen | YD00615701 | 5'-DIG and 3'-DIG labelled |
| Levamisol hydrochloride | Sigma Aldrich | 31742 | |
| Bovine Serum Albumin | Sigma Aldrich | A9647 | BSA |
| NBT/BCIP Tablets | Sigma Aldrich | 11697471001 | NBT-BCIP |
| Potassium Chloride | ThermoFisher | P217 | KCl |
| DAPI solution (1mg/ml) | ThermoFisher | 62248 | DAPI |
| Glass coverslip | ThermoFisher | 12-545E | Glass coverslip |
| Plastic coverslip | Grace Bio-Labs | HS40 22mmX40mmX0.25mm | RNA-ase free plastic coverslip |
| Anti-Digoxigenin-AP, Fab fragments | Sigma Aldrich | 11093274910 | DIG antibody |
| Hydrophobic barrier pen | Vector Laboratories | H-4000 | Pap pen |
| Anti-Cardiac Troponin T antibody | Abcam | ab92546 | cTnT antibody |
| Goat anti-Rabbit IgG (H+L) Cross-Absorbed Secondary Antibody, Alexa Fluor 568 | ThermoFisher | A-11011 | anti-rabbit-568 antibody |
| Dako Fluorescence Mounting Medium | DAKO | S3023 | mounting medium |
| Sheep serum | Sigma Aldrich | S3772 | |
| Goat serum | Sigma Aldrich | G9023 | |
| Deionized Formamide | American Bioanalytical | AB00600 | |
| Hybridization Oven | ThermoFisher | UVP HB-1000 Hybridizer |
References
- Bartel, D. P. MicroRNAs: genomics, biogenesis, mechanism, and function. Cell. 116, 281-297 (2004).
- Denli, A. M., Tops, B. B., Plasterk, R. H., Ketting, R. F., Hannon, G. J. Processing of primary microRNAs by the Microprocessor complex. Nature. 432, 231-235 (2004).
- Hutvagner, G., Zamore, P. D. A microRNA in a multiple-turnover RNAi enzyme complex. Science. 297, 2056-2060 (2002).
- Krol, J., et al. Structural features of microRNA (miRNA) precursors and their relevance to miRNA biogenesis and small interfering RNA/short hairpin RNA design. Journal of Biological Chemistry. 279, 42230-42239 (2004).
- Lim, L. P., Glasner, M. E., Yekta, S., Burge, C. B., Bartel, D. P. Vertebrate microRNA genes. Science. 299, 1540 (2003).
- Tian, T., Wang, J., Zhou, X. A review: microRNA detection methods. Organic and Biomolecular Chemistry. 13, 2226-2238 (2015).
- Fineberg, S. K., Kosik, K. S., Davidson, B. L. MicroRNAs potentiate neural development. Neuron. 64, 303-309 (2009).
- Ivey, K. N., et al. MicroRNA regulation of cell lineages in mouse and human embryonic stem cells. Cell stem cell. 2, 219-229 (2008).
- Houbaviy, H. B., Murray, M. F., Sharp, P. A. Embryonic stem cell-specific MicroRNAs. Developmental cell. 5, 351-358 (2003).
- Kasper, D. M., et al. MicroRNAs Establish Uniform Traits during the Architecture of Vertebrate Embryos. Developmental cell. 40, 552-565 (2017).
- Liu, N., Olson, E. N. MicroRNA regulatory networks in cardiovascular development. Developmental cell. 18, 510-525 (2010).
- Xiao, C., Rajewsky, K. MicroRNA control in the immune system: basic principles. Cell. 136, 26-36 (2009).
- Hartig, S. M., Hamilton, M. P., Bader, D. A., McGuire, S. E. The miRNA Interactome in Metabolic Homeostasis. Trends in endocrinology and metabolism: TEM. 26, 733-745 (2015).
- Ying, W., et al. Adipose Tissue Macrophage-Derived Exosomal miRNAs Can Modulate In Vivo and In Vitro Insulin Sensitivity. Cell. 171, 372-384 (2017).
- Perkins, D. O., et al. microRNA expression in the prefrontal cortex of individuals with schizophrenia and schizoaffective disorder. Genome biology. 8, R27 (2007).
- Miller, B. H., et al. MicroRNA-132 dysregulation in schizophrenia has implications for both neurodevelopment and adult brain function. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 109, 3125-3130 (2012).
- Xu, B., Hsu, P. K., Stark, K. L., Karayiorgou, M., Gogos, J. A. Derepression of a neuronal inhibitor due to miRNA dysregulation in a schizophrenia-related microdeletion. Cell. 152, 262-275 (2013).
- Hu, Y., Ehli, E. A., Boomsma, D. I. MicroRNAs as biomarkers for psychiatric disorders with a focus on autism spectrum disorder: Current progress in genetic association studies, expression profiling, and translational research. Autism research : official journal of the International Society for Autism Research. 10, 1184-1203 (2017).
- Wu, Y. E., Parikshak, N. N., Belgard, T. G., Geschwind, D. H. Genome-wide, integrative analysis implicates microRNA dysregulation in autism spectrum disorder. Nature neuroscience. 19, 1463-1476 (2016).
- Ikeda, S., et al. Altered microRNA expression in human heart disease. Physiological genomics. 31, 367-373 (2007).
- Mann, M., et al. An NF-kappaB-microRNA regulatory network tunes macrophage inflammatory responses. Nature Communications. 8, 851 (2017).
- O’Connell, R. M., et al. MicroRNA-155 promotes autoimmune inflammation by enhancing inflammatory T cell development. Immunity. 33, 607-619 (2010).
- Chan, E., Prado, D. E., Weidhaas, J. B. Cancer microRNAs: from subtype profiling to predictors of response to therapy. Trends in Molecular Medicine. 17, 235-243 (2011).
- He, L., et al. A microRNA component of the p53 tumour suppressor network. Nature. 447, 1130-1134 (2007).
- Kloosterman, W. P., Plasterk, R. H. The diverse functions of microRNAs in animal development and disease. Developmental cell. 11, 441-450 (2006).
- Li, N., et al. miR-182 Modulates Myocardial Hypertrophic Response Induced by Angiogenesis in Heart. Science Reports. 6, 21228 (2016).
- Meerson, F. Z. Compensatory hyperfunction of the heart and cardiac insufficiency. Circulation Research. 10, 250-258 (1962).
- Tardiff, J. C. Cardiac hypertrophy: stressing out the heart. Journal of Clinical Investigation. 116, 1467-1470 (2006).
- Burchfield, J. S., Xie, M., Hill, J. A. Pathological ventricular remodeling: mechanisms: part 1 of 2. Circulation. 128, 388-400 (2013).
- Benjamin, E. J., et al. Heart Disease and Stroke Statistics-2017 Update: A Report From the American Heart Association. Circulation. 135, e146-e603 (2017).
- Pena, J. T., et al. miRNA in situ hybridization in formaldehyde and EDC-fixed tissues. Nature Methods. 6, 139-141 (2009).
