Microphysiologic платформа для человеческого жира: зажатой белой жировой ткани
Summary
Белой жировой ткани (Ват) имеет критические недостатки в его текущей модели основной культуры, препятствуют развитию фармакологического и метаболических исследованиях. Здесь мы представляем протокол для получения жировых microphysiological системы сэндвич Ват между листами стромальных клеток. Эта конструкция обеспечивает стабильной и гибкой платформой для первичного Ват культуры.
Abstract
Белой жировой ткани (Ват) играет решающую роль в регулировании веса и повседневной здоровья. Тем не менее существуют значительные ограничения для моделей доступны основной культуры, все из которых не удалось точно охарактеризовать жировой микроокружения или продлить жизнеспособность Ват за две недели. Отсутствие надежной первичной культуры модели серьезно препятствует исследования в Ват метаболизм и разработки лекарств. С этой целью мы использовали стандарты NIH в microphysiologic системы для разработки Роман платформы для Ват основной культуры под названием «SWAT» (слоеное белой жировой ткани). Мы преодолеть естественным плавучести адипоцитов сэндвич фарша Ват кластеры между листами жировой производные стромальных клеток. В этой конструкции Ват образцы являются жизнеспособной более чем восемь недель в культуре. SWAT сохраняет нетронутыми ECM, к ячейке контактов и физического давления в естественных условиях Ват условий; Кроме того Сват поддерживает надежные транскрипционный анализ профиля, чувствительность к экзогенных химических сигналов и функция цельной ткани. SWAT представляет простой, воспроизводимые и эффективный метод первичной жировой культуры. Потенциально это широко применимые платформы для научных исследований в физиологии Ват, Патофизиология, метаболизм и фармацевтических разработок.
Introduction
Жировой ткани является основным органом, ожирения, которая осуществляет прямые ежегодные медицинские расходы между 147 миллиардов долларов и 210 миллиардов долларов в США1. Накопления жировой ткани также способствует других ведущих причин смерти, такие как болезни сердца, диабета II типа и некоторых видов рака2. В vitro культуры модели необходимы для метаболических исследований и разработки лекарств, но текущие исследования модели жировой ткани имеют серьезные недостатки. Адипоцитов хрупкие, жизнерадостный и неизлечимо дифференцированных клеток, которые не будут придерживаться пластмассы культуры клеток и поэтому не может быть культивировали, с использованием обычных клеток культуры методов. Начиная с 1970-х годов были использованы в попытках несколько методов для преодоления этих препятствий, включая использование стекла coverslips, потолок культуры, подвеска культуры и внеклеточной матрицы3,4,5, 6 , 7. Однако, эти методы были отмечены гибель клеток и дифференцировке, и они обычно используются для не более чем в течение двух недельного исследования. Кроме того, эти модели не пытайтесь повторить родной жировой микроокружения, поскольку они не поддерживают нетронутыми ECM, поддержки взаимодействия между адипоциты и стромальные клетки, ни клетки сократительной силы оказывают друг на друга в в естественных условиях Ват.
В отсутствие метода золотой стандарт начального жировой культуры жировой исследования опирается главным образом на дифференцированной предварительно адипоцитов (diffAds). DiffAds многокамерный, сторонником и метаболически активные. Напротив основной белый адипоцитов однокамерные, nonadherent и демонстрируют сравнительно низкий метаболизм. Текущего жировых культуры моделей неспособность пилки физиологии здоровых зрелых жировой ткани, вероятно, основным фактором в отсутствие утвержденных FDA лекарства, которые непосредственно нацелены адипоцитов. В самом деле отсутствие физиологического в vitro моделей органа является серьезной проблемой на большинство органов и болезни.
В своем позиционном документе, объявив о создании своей программы Microphysiological системы (MPS) национальные институты здравоохранения (NIH) сообщили, что 2013 успеха во всех фармацевтических клинические испытания на человеке только 18% для этапа II и 50% для фазы III Клинические испытания8. Программе MPS предназначена для непосредственного решения неспособность в vitro монокультуры модели физиологии человека. НИЗ определяет MPSs как культура системы, состоящей из человека первичной или стволовых клеток многоклеточного 3D конструкций, которые пилки функционирования органа. В отличие от модели редукционистской однородной, увековечен клеточных культур MPSs должен точно модель ячеек, наркотиков клеток, лекарственного препарата и орган наркотиков взаимодействий9. В отличие от краткосрочных методов первичной культуры низ стандартов диктовать м/с устойчивости более 4 недель культуры8. Более подробная информация о программе MPS можно найти на низ RFAs (#RFA-TR-18-001)10.
Мы разработали простой, Роман, адаптации, и недорогой жировой м/с называют «зажатая белой жировой ткани» (SWAT)11. Мы преодолеть естественным плавучести адипоциты, «сэндвич» рубленый первичной жировой ткани между листами жировой производные стромальных клеток (ADSCs) (рис. 1). Результирующая 3D конструкции резюмирует контакт ячеек и родной жировой микроокружения, окружая Зрелые адипоцитов с населением клетки естественным Адипоцит поддержки. SWAT протестирована, демонстрируя 8-недельного жизнеспособности, ответ на экзогенные сигнализации, секрецию АдипоКин и приживления в животной модели.
Protocol
Representative Results
Discussion
Этот протокол подробности использования ADSCs для сэндвич человека белой жировой ткани; человеческого ADSC клеточных линий могут быть изолированы через устоявшихся протоколы15. Однако система может быть адаптирована для удовлетворения потребностей индивидуальных исследова?…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Авторы хотели бы признать институциональной поддержки, оказываемой LSU медицинских наук центр, который финансировал проект.
Materials
| 10x HBSS | Thermofisher | 14185052 | |
| Gelatin | Sigma-aldrich | G9391 | |
| Collagenase | Sigma-aldrich | C5138 | |
| Adenosine | Sigma-aldrich | A9251 | |
| DMEM | Thermofisher | 11995065 | |
| M199 Media | Thermofisher | 11043023 | Phenol red-free |
| 250µm Mesh Filter | Pierce | 87791 | |
| 0.2µm Syringe Filter | Celltreat | 229747 | |
| 5mL Luer-Lok syringes | BD | 309646 | |
| Metal Washers | These are simple metal washers and can be bought at any hardware store. They simply add leight weight to the backs of the plugers to ensure even contact between cells and gelatin, while being easy to stock and sterilize. Approximate mass: 6.3g | ||
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Heated Equipment | |||
| Incubated Orbital Shaker | VWR | 10020-988 | Samples should be pitched at 45° angle to facilitate collagenase digestion |
| Heat Block | Set to 37-40°C and placed under Biosafety Cabinet | ||
| Water Bath | Set to ~75°C | ||
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Specialized Plastics | |||
| Upcell Dishes 6cm of 6-multiwell | Nunc | 174902 or 174901 | These are commerically available pNIPAAm-coated dishes which can be used to grow the upper sheet of ADSCs. Alternatively, pNIPAAm-coated plates can be produced in-lab. diameter: <6cm for 6cm dish, <3.5cm for 6-well plate; approximate mass: 6.7g for 6cm dish, 5.1g for 6-well plate |
| Plastic Plunger Apparatus | These can be fashioned to fit within desired pNIPAAm-coated plastics (multiwell plates, petri dishes). They are comprised of a simple stem attached to a circular disk. They can be produced in-lab or by any facility that can fashion acrylic plastics |
References
- Cawley, J., Meyerhoefer, C. The medical costs of obesity: An instrumental variables approach. Journal of Health Economics. 31 (1), 219-230 (2012).
- Pi-Sunyer, X. The Medical Risks of Obesity. Postgraduate Medicine. 121 (6), 21-33 (2009).
- Smith, U. Morphologic studies of human subcutaneous adipose tissue in vitro. Anatomical Record. 169 (1), 97-104 (1971).
- Sugihara, H., Yonemitsu, N., Miyabara, S., Yun, K. Primary cultures of unilocular fat cells: characteristics of growth in vitro and changes in differentiation properties. Differentiation. 31 (1), 42-49 (1986).
- Sugihara, H., Yonemitsu, N., Toda, S., Miyabara, S., Funatsumaru, S., Matsumoto, T. Unilocular fat cells in three-dimensional collagen gel matrix culture. The Journal of Lipid Research. 29, 691-697 (1988).
- Hazen, S. A., Rowe, W. A., Lynch, C. J. Monolayer cell culture of freshly isolated adipocytes using extracellular basement membrane components. The Journal of Lipid Research. 36, 868-875 (1995).
- Fried, S. K., Kral, J. G. Sex differences in regional distribution of fat cell size and lipoprotein lipase activity in morbidly obese patients. International Journal of Obesity. 11 (2), 129-140 (1987).
- Sutherland, M. L., Fabre, K. M., Tagle, D. A. The National Institutes of Health. Microphysiological Systems Program focuses on a critical challenge in the drug discovery pipeline. Stem Cell Research and Therapy. 4, (2013).
- Wikswo, J. P. The relevance and potential roles of microphysiological systems in biology and medicine. Experimental Biology and Medicine. 239 (9), 1061-1072 (2014).
- . NIH-CASIS Coordinated Microphysiological Systems Program for Translational Research in Space (#RFA-TR-18-001) Available from: https://grants.nih.gov/grants/guide/rfa-files/RFA-TR-18-001.html (2017)
- Lau, F. H., Vogel, K., Luckett, J. P., Hunt, M., Meyer, A., Rogers, C. L., Tessler, O., Dupin, C. L., St Hilaire, H., Islam, K. N., Frazier, T., Gimble, J. M., Scahill, S. Sandwiched White Adipose Tissue: A Microphysiological System of Primary Human Adipose Tissue. Tissue Engineering Part C: Methods. 24 (3), (2018).
- Ebara, M., Hoffman, J. M., Stayton, P. S., Hoffman, A. S. Surface modification of microfluidic channels by UV-mediated graft polymerization of non-fouling and ‘smart’ polymers. Radiation Physics and Chemistry. 76, 1409-1413 (2007).
- Lin, J. B., Isenberg, B. C., Shen, Y., Schorsch, K., Sazonova, O. V., Wong, J. Y. Thermo-responsive poly(N-isopropylacrylamide) grafted onto microtextured poly(dimethylsiloxane) for aligned cell sheet engineering. Colloids and Surfaces B: Biointerfaces. 99, 108-115 (2012).
- Turner, W. S., Sandhu, N., McCloskey, K. E. Tissue Engineering: Construction of a Multicellular 3D Scaffold for the Delivery of Layered Cell Sheets. Journal of Visualized Experiments. (92), e51044 (2014).
- Bunnell, B., Flaat, M., Gagliardi, C., Patel, B., Ripoll, C. Adipose-derived stem cells: Isolation, expansion and differentiation. Methods. 45 (2), 115-120 (2008).
- Akiyama, Y., Kikuchi, A., Yamato, M., Okano, T. Ultrathin poly(N-isopropylacrylamide) grafted layer on polystyrene surfaces for cell adhesion/detachment control. Langmuir. 20 (13), 5506-5511 (2004).
- Fried, S. K., Russell, C. D., Grauso, N. L., Brolin, R. E. Lipoprotein lipase regulation by insulin and glucocorticoid in subcutaneous and omental adipose tissues of obese women and men. Journal of Clinical Investigation. 92 (5), 2191-2198 (1993).
- Keipert, S., Jastroch, M. Brite/beige fat and UCP1 – is it thermogenesis?. Biochimica et Biophysica Acta. 1837 (7), 1075-1082 (2014).
