منصة ميكروفيسيولوجيك للدهون البشرية: تقع في الأنسجة الدهنية البيضاء
Summary
وقد الأنسجة الدهنية البيضاء (وات) أوجه القصور الهامة في نماذجها الثقافة الأولية الحالية، التي تعوق التنمية الدوائية والدراسات الأيضية. نقدم هنا، بروتوكولا لإنتاج نظام ميكروفيسيولوجيكال الدهنية بوات يقحم بين الأوراق من الخلايا اللحمية. يوفر هذا بناء منصة مستقرة وقابلة للتكيف للابتدائي وات الثقافة.
Abstract
الأنسجة الدهنية البيضاء (وات) يلعب دوراً حاسما في تنظيم الصحة الوزن وكل يوم. مع ذلك، هناك قيود كبيرة على نماذج الثقافة الأولية المتاحة، التي أخفقت في إخلاص الخص المكروية الدهنية أو تمديد صلاحية وات بعد أسبوعين. عدم وجود نموذج الثقافة الأولية موثوقة يعوق بشدة البحث في الأيض وات وتطوير الأدوية. وتحقيقا لهذه الغاية أننا استخدمت معايير المعاهد الوطنية للصحة لنظام ميكروفيسيولوجيك لوضع منهاج جديد للثقافة الأولية وات دعا ‘سوات’ (تقع الأنسجة الدهنية البيضاء). نتغلب على الطفو الطبيعي adipocytes التي يقحم مفروم وات مجموعات بين الأوراق من الخلايا اللحمية المستمدة من الدهنية. في هذا البناء، عينات وات قابلة للاستمرار أسابيع ما يزيد على ثمانية في الثقافة. وتحتفظ سوات ECM سليمة وخلية إلى جهات الاتصال، والضغوط المادية في فيفو ظروف وات؛ بالإضافة إلى ذلك، تحتفظ سوات تشكيل جانبي النسخي قوية، وحساسية للإشارات الكيميائية خارجية المنشأ، ووظيفة الأنسجة كاملة. سوات يمثل طريقة بسيطة واستنساخه وفعالة لثقافة الدهنية الأساسية. يحتمل أن تكون، أنها منبر المطبقة على نطاق واسع للبحوث في علم وظائف الأعضاء وات والفيزيولوجيا المرضية، والايض وتطوير الأدوية.
Introduction
الأنسجة الدهنية هي الجهاز الأساسي للسمنة، التي تحمل التكاليف الطبية السنوية المباشرة بين مبلغ 147 بیلیون ومبلغ 210 بیلیون في الولايات المتحدة1. كما يسهم تراكم الأنسجة الدهنية الأخرى الأسباب الرئيسية للوفاة مثل أمراض القلب والنوع الثاني من السكري، وأنواع معينة من السرطان2. في المختبر نماذج الثقافة ضرورية للدراسات الأيضية وتطوير الأدوية، لكن النماذج البحثية الحالية في الأنسجة الدهنية لأوجه القصور الرئيسية. Adipocytes هي هشة، وازدهار، والميؤوس من شفائهم متباينة الخلايا التي لم تنضم إلى خلية ثقافة البلاستيك، ولذلك لا يمكن أن يكون مثقف على استخدام أساليب الثقافة التقليدية الخلية. ومنذ السبعينات، استخدمت عدة أساليب في محاولات للتغلب على هذه العوائق، بما في ذلك استخدام الزجاج كوفيرسليبس وسقف الثقافة وثقافة الوقف ومصفوفات خارج الخلية3،،من45، 6 , 7-ومع ذلك، لقد اتسمت هذه الأساليب بموت الخلايا وديديفيرينتييشن، ويتم استخدامها عادة للا يزيد عن فترة دراسة أسبوعين. وعلاوة على ذلك، لا تحاول هذه النماذج الخص المكروية الدهنية الأصلية كما أنها لا تحتفظ بالمحتوى سليمة، دعم التفاعلات بين adipocytes و stromal خلايا، ولا خلايا قوات الهوس بذل كل منهما على الآخر في الحية في وات.
نظراً لغياب أسلوب الثقافة الدهنية الأساسية معيار الذهب، اعتمدت البحوث الدهنية أساسا على adipocytes المسبق متباينة (ديفدس). ديفدس مولتيلوكولار وملتصقة أيضي نشطة. على النقيض من ذلك، adipocytes الأبيض الأساسي نوناديرينت، والثلاجات، وتثبت الأيض منخفضة نسبيا. ومن المرجح عدم النماذج الدهنية الثقافة الحالية للخص فسيولوجيا الأنسجة الدهنية ناضجة صحية عاملاً رئيسيا في عدم وجود الأدوية التي وافقت عليها إدارة الأغذية والعقاقير التي تستهدف مباشرة adipocytes. في الواقع، عدم وجود الفسيولوجية في المختبر نماذج الجهاز مشكلة كبيرة عبر معظم الأجهزة والمرض.
في ورقة موقف يعلن إنشاء برنامجها لأنظمة ميكروفيسيولوجيكال (MPS)، والمعاهد الوطنية للصحة (NIH) أفادت أنه معدل نجاح 2013 عبر جميع التجارب السريرية البشرية الصيدلانية فقط 18% للمرحلة الثانية و 50% للمرحلة الثالثة 8من التجارب السريرية. تم تصميم برنامج MPS لمباشرة معالجة عجز الأحادية في المختبر لفسيولوجيا الإنسان النموذجي. المعاهد الوطنية للصحة يعرف مبس نظم الثقافة تتألف من الابتدائي البشرية أو الخلايا الجذعية في بني ثلاثية الأبعاد متعددة الخلايا التي الخص أداء الجهاز. خلافا للنماذج الاختزالية الثقافات الخلية متجانسة، مخلدة، ينبغي أن دقة نموذج مبس خلية خلية وخلية المخدرات والمخدرات-المخدرات والجهاز–المخدرات التفاعلات9. خلافا لأساليب الثقافة الأولية، قصيرة الأجل وتملي معايير المعاهد الوطنية للصحة الاستدامة النواب أكثر من 4 أسابيع في الثقافة8. يمكن الاطلاع على مزيد من التفاصيل عن البرنامج من أعضاء البرلمان في المعاهد الوطنية للصحة في رفاس (#RFA-أون-18-001)10.
ووضعنا رواية بسيطة وقابلة للتكيف، ووصف النواب الدهنية غير مكلفة “تقع في الأنسجة الدهنية البيضاء” (سوات)11. يمكننا التغلب على الطفو الطبيعي adipocytes بالانسجة الدهنية الأساسية مفروم “يقحم” بين الأوراق المشتقة من الدهنية الخلايا اللحمية (أدسكس) (الشكل 1). ويجمل بنية ثلاثية الأبعاد الناتجة عن جهة الاتصال خلية خلية والمكرويه الدهنية أصلي قبل adipocytes ناضجة مع عدد سكان خلية دعم adipocyte طبيعية المحيطة. وقد تم التحقق من صحة سوات بإثبات صلاحية 8 أسابيع، استجابة للخارجية مما يشير إلى إفراز أديبوكيني وانجرافتمينت في نموذج حيوان.
Protocol
Representative Results
Discussion
تفاصيل هذا البروتوكول استعمال أدسكس ساندويتش البيض الأنسجة الدهنية البشرية؛ خطوط الخلايا البشرية في آخر يمكن أن تكون معزولة عن طريق بروتوكولات راسخة15. ومع ذلك، يمكن تكييفها لمتطلبات البحوث فردية (مثل استخدام الخلايا 3T3L-1 إلى ساندويتش الماوس وات) النظام. تنطوي هذه العملية على…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
الكتاب تود أن تقر بالدعم المؤسسي المقدمة من مركز علوم الصحة LSU، التي تمول المشروع.
Materials
| 10x HBSS | Thermofisher | 14185052 | |
| Gelatin | Sigma-aldrich | G9391 | |
| Collagenase | Sigma-aldrich | C5138 | |
| Adenosine | Sigma-aldrich | A9251 | |
| DMEM | Thermofisher | 11995065 | |
| M199 Media | Thermofisher | 11043023 | Phenol red-free |
| 250µm Mesh Filter | Pierce | 87791 | |
| 0.2µm Syringe Filter | Celltreat | 229747 | |
| 5mL Luer-Lok syringes | BD | 309646 | |
| Metal Washers | These are simple metal washers and can be bought at any hardware store. They simply add leight weight to the backs of the plugers to ensure even contact between cells and gelatin, while being easy to stock and sterilize. Approximate mass: 6.3g | ||
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Heated Equipment | |||
| Incubated Orbital Shaker | VWR | 10020-988 | Samples should be pitched at 45° angle to facilitate collagenase digestion |
| Heat Block | Set to 37-40°C and placed under Biosafety Cabinet | ||
| Water Bath | Set to ~75°C | ||
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Specialized Plastics | |||
| Upcell Dishes 6cm of 6-multiwell | Nunc | 174902 or 174901 | These are commerically available pNIPAAm-coated dishes which can be used to grow the upper sheet of ADSCs. Alternatively, pNIPAAm-coated plates can be produced in-lab. diameter: <6cm for 6cm dish, <3.5cm for 6-well plate; approximate mass: 6.7g for 6cm dish, 5.1g for 6-well plate |
| Plastic Plunger Apparatus | These can be fashioned to fit within desired pNIPAAm-coated plastics (multiwell plates, petri dishes). They are comprised of a simple stem attached to a circular disk. They can be produced in-lab or by any facility that can fashion acrylic plastics |
References
- Cawley, J., Meyerhoefer, C. The medical costs of obesity: An instrumental variables approach. Journal of Health Economics. 31 (1), 219-230 (2012).
- Pi-Sunyer, X. The Medical Risks of Obesity. Postgraduate Medicine. 121 (6), 21-33 (2009).
- Smith, U. Morphologic studies of human subcutaneous adipose tissue in vitro. Anatomical Record. 169 (1), 97-104 (1971).
- Sugihara, H., Yonemitsu, N., Miyabara, S., Yun, K. Primary cultures of unilocular fat cells: characteristics of growth in vitro and changes in differentiation properties. Differentiation. 31 (1), 42-49 (1986).
- Sugihara, H., Yonemitsu, N., Toda, S., Miyabara, S., Funatsumaru, S., Matsumoto, T. Unilocular fat cells in three-dimensional collagen gel matrix culture. The Journal of Lipid Research. 29, 691-697 (1988).
- Hazen, S. A., Rowe, W. A., Lynch, C. J. Monolayer cell culture of freshly isolated adipocytes using extracellular basement membrane components. The Journal of Lipid Research. 36, 868-875 (1995).
- Fried, S. K., Kral, J. G. Sex differences in regional distribution of fat cell size and lipoprotein lipase activity in morbidly obese patients. International Journal of Obesity. 11 (2), 129-140 (1987).
- Sutherland, M. L., Fabre, K. M., Tagle, D. A. The National Institutes of Health. Microphysiological Systems Program focuses on a critical challenge in the drug discovery pipeline. Stem Cell Research and Therapy. 4, (2013).
- Wikswo, J. P. The relevance and potential roles of microphysiological systems in biology and medicine. Experimental Biology and Medicine. 239 (9), 1061-1072 (2014).
- . NIH-CASIS Coordinated Microphysiological Systems Program for Translational Research in Space (#RFA-TR-18-001) Available from: https://grants.nih.gov/grants/guide/rfa-files/RFA-TR-18-001.html (2017)
- Lau, F. H., Vogel, K., Luckett, J. P., Hunt, M., Meyer, A., Rogers, C. L., Tessler, O., Dupin, C. L., St Hilaire, H., Islam, K. N., Frazier, T., Gimble, J. M., Scahill, S. Sandwiched White Adipose Tissue: A Microphysiological System of Primary Human Adipose Tissue. Tissue Engineering Part C: Methods. 24 (3), (2018).
- Ebara, M., Hoffman, J. M., Stayton, P. S., Hoffman, A. S. Surface modification of microfluidic channels by UV-mediated graft polymerization of non-fouling and ‘smart’ polymers. Radiation Physics and Chemistry. 76, 1409-1413 (2007).
- Lin, J. B., Isenberg, B. C., Shen, Y., Schorsch, K., Sazonova, O. V., Wong, J. Y. Thermo-responsive poly(N-isopropylacrylamide) grafted onto microtextured poly(dimethylsiloxane) for aligned cell sheet engineering. Colloids and Surfaces B: Biointerfaces. 99, 108-115 (2012).
- Turner, W. S., Sandhu, N., McCloskey, K. E. Tissue Engineering: Construction of a Multicellular 3D Scaffold for the Delivery of Layered Cell Sheets. Journal of Visualized Experiments. (92), e51044 (2014).
- Bunnell, B., Flaat, M., Gagliardi, C., Patel, B., Ripoll, C. Adipose-derived stem cells: Isolation, expansion and differentiation. Methods. 45 (2), 115-120 (2008).
- Akiyama, Y., Kikuchi, A., Yamato, M., Okano, T. Ultrathin poly(N-isopropylacrylamide) grafted layer on polystyrene surfaces for cell adhesion/detachment control. Langmuir. 20 (13), 5506-5511 (2004).
- Fried, S. K., Russell, C. D., Grauso, N. L., Brolin, R. E. Lipoprotein lipase regulation by insulin and glucocorticoid in subcutaneous and omental adipose tissues of obese women and men. Journal of Clinical Investigation. 92 (5), 2191-2198 (1993).
- Keipert, S., Jastroch, M. Brite/beige fat and UCP1 – is it thermogenesis?. Biochimica et Biophysica Acta. 1837 (7), 1075-1082 (2014).
