Контраст соответствия моющего средства в малых угол нейтронного рассеяния экспериментов мембраной протеина структурного анализа и моделирования Ab Initio

Мембранные белки кодируются с примерно 30% от всех генов¹ и представляют собой значительное большинство целей для современных лекарственных препаратов. ² эти белки выполняют множество жизненно важных клеточных функций,³ , но несмотря на обилие и важности — представляют только около 1% от общей структуры, депонируется в совместную исследований для протеина структурного биоинформатики (RCSB) Банк данных. ⁴ из-за их частично гидрофобная природа, структурные определения белков мембранных привязкой был чрезвычайно сложным. ^{5 , 6 , 7}

Как многие биофизические методы требуют монодисперсных частиц в растворе для измерения, изолируя мембранных белков из родной мембраны и стабилизации этих белков в растворимые мнемосхемы родной мембран был активной областью исследований в последние годы десятилетия. ^{8 , 9 , 10} эти исследования привели к разработке многих Роман амфифильных сборок солюбилизировать последнего мембранных белков, таких как nanodiscs,^11,12,13 bicelles,^14,15 и amphipols. ^{16 , 17} однако, использование моющего средства мицеллы остается одним из наиболее распространенных и простой подходов для удовлетворения требований растворимость данного белка. ^{18 , 19 , 20 , 21 , 22 , 23 , 24 , 25} к сожалению, нет единого моющего средства или Волшебная смесь моющих средств в настоящее время существует удовлетворяющего всех мембранных белков; Таким образом эти условия должны проверяться эпирически для уникальных потребностей каждого белка. ^{26 , 27}

Моющие средства самостоятельно собрать в растворе выше их концентрации мицеллообразования критической форме статистические структуры, называемые мицеллы. Мицеллы состоят из многих стиральный порошок мономеров (обычно начиная от 20-200) с гидрофобным алкил цепи, образуя ядром мицеллы и гидрофильные головы группы организованы в слое оболочки мицеллы, стоящих перед водного растворителя. Поведение моющих средств и формирования мицеллы классически был описан Чарльзом Tanford Гидрофобным эффектом,²⁸ и размеров и формы мицелл из часто используемых моющих средств в мембранных белков исследования были характеризуется, с помощью малых угол рассеяния. ^{29 , 30} моющего средства Организации о мембранных белков также были изучены, и образование комплексов протеина-моющее средство (PDC) ожидается молекулами моющего средства, окружающих белка в договоренность, которая напоминает аккуратно моющего средства Мицеллы. ³¹

Один добавил, что преимущество использования моющих средств, что результирующая мицеллы свойств может быть манипулирован включения других моющих средств. Многие моющие средства экспонат идеальное смешивание, и выберите пункт Свойства смешанные мицеллы даже может быть предсказано от компонентов и соотношение смешивания. ²² однако, присутствие моющего средства может по-прежнему создают проблемы для биофизические характеристики, способствуя общий сигнал. Например с рентгеновской и рассеяние света методы, сигнал от моющих средств в PDC практически неотличима от белка. ³² с одной частицы крио электронной микроскопии (крио ЭМ) расследования обычно полагаются на ловушку частицы (замороженных); структурные детали белка по-прежнему скрываются определенного моющих средств или высокой концентрации моющего средства, который добавляет к фону. ³³ альтернативные подходы к интерпретации полную структуру PDC (включая моющих средств) были сделаны через вычислительных методов, которые стремятся восстановить моющее вокруг данной мембранный белок. ³⁴

В случае рассеяния нейтронов ядро оболочка расположение моющего средства в мицеллы производит форм-фактор, который способствует наблюдаемых рассеяния. К счастью компоненты решения могут быть изменены таким образом, что они не способствуют чистой наблюдаемых рассеяния. Этот процесс «контраст соответствия» достигается путем замены дейтерия для водорода для достижения рассеяния длина плотности, что соответствует фона (буфер). Разумный выбор моющего средства (с доступных транс коллегами) и их соотношение смешивания должны рассматриваться. Для моющего средства мицеллы эта замена могут выполняться с использованием моющих средств с той же головы группы, но имеющие транс алкильной цепи (d хвост вместо h хвост). Так как моющие средства перемешанных,³⁵ их агрегатов будет иметь рассеяния длина плотности, что моль фракция взвешенный средний из двух компонентов (h хвосты и d хвосты). Когда этот контраст средней согласуется с этим глава группы, чтобы удалить все взносы в наблюдаемых рассеяния единообразные статистические структуры могут совпасть полностью.

Мы представляем здесь протокол манипулировать нейтронов контраст стиральный порошок мицелл, включив химически идентичны стиральный порошок молекул дейтерия меченых алкильной цепи. ^{19 , 36 , 37} это позволяет полный Одновременный контраст соответствия мицеллы ядро и оболочка, которая является уникальной возможностью рассеяния нейтронов. ^{35 , 38} с этим значительно изысканный уровнем детализации, контраст соответствия можно включить иначе неосуществимым исследования мембранных белков структур. Кроме того этот контраст соответствующий подход может быть распространен на другие системы, связанные с моющим средством, например полимер обмен реакции³⁹ и нефть вода диспергентов,⁴⁰ или даже другие solubilizing агентов, таких как bicelles,⁴¹ nanodiscs,⁴² или блок сополимеры. Аналогичный подход ⁴³ A как указано в этой рукописи, но применение одного вида моющего средства с частичным дейтерия замен на алкильной цепи и/или руководитель группы, был недавно опубликован. ³⁷ в то время как это можно ожидать улучшения случайное распределение водорода и дейтерия во всем моющего средства по сравнению с подходом, представленные здесь, ограниченное количество доступных позиций на моющее средство для замещения и двухступенчатый стиральный порошок синтеза требуются создает дополнительные проблемы для рассмотрения.

Шаги 1 и 2 протокола подробно ниже часто перекрываются, так как начальный эксперимент планирование должно быть сделано представить предложение качества. Однако, считается представления предложений здесь как первый шаг, чтобы подчеркнуть, что этот процесс должен быть запущен задолго до начала эксперимента нейтронов. Следует также отметить, что необходимого шага, который должно быть подкреплено предложение, должен иметь биохимические и физические характеристики (в том числе чистоту и стабильности) образца, поддерживая необходимость нейтронных исследований. Общее обсуждение малых угол нейтронного рассеяния (SANS) выходит за рамки этой статьи. Краткий, но тщательное введение доступен в работе ссылка, которую Характеризация материалов Кауфман,⁴⁴ и всеобъемлющий учебник сосредоточена на биологических малых угол решение рассеяния недавно был опубликован. ⁴⁵ далее рекомендовал чтение приводится в разделе обсуждения. Малоуглового рассеяния использует так называемые рассеяния вектора Q в качестве центральной количество, которое описывает процесс рассеяния. Эта статья использует широко признанного определения Q = 4π sin (θ) / λ, где θ — половина угол между входящей и рассеянного пучка и λ является длина волны нейтронного излучения в ангстремы. Существуют другие определения, что использовать различные символы, такие как ‘ вектор рассеяния и что могут отличаться 2π фактор или с помощью нанометров вместо Ангстрем (см. также обсуждение рис. 10).