Contrasto-Matching detergente in esperimenti di Scattering di neutroni Small-Angle per Ab Initio modellazione e analisi strutturale di proteine di membrana

Proteine di membrana sono codificati di circa il 30% di tutti i geni¹ e rappresentano una forte maggioranza di bersagli per farmaci medicinali moderni. ² queste proteine svolgono una vasta gamma di funzioni cellulari vitali,³ ma nonostante la loro abbondanza e importanza — rappresentano solo circa l’1% del totale strutture depositato nel Research Collaboratory per bioinformatica strutturale (RCSB) proteina Banca dati. ⁴ a causa della loro natura parzialmente idrofobo, determinazione strutturale delle proteine di membrana-limita è stato estremamente impegnativo. ^{5 , 6 , 7}

Come molte tecniche biofisiche richiedono particelle monodisperse in soluzione per la misurazione, isolando le proteine di membrana dalle membrane native e queste proteine in un mimic solubile delle membrane native di stabilizzazione è stato un’area attiva di ricerca negli ultimi decenni. ^{8 , 9 , 10} queste indagini hanno portato allo sviluppo di molti romanzo anfifilici assembly per solubilizzare le proteine di membrana, come nanodiscs,^11,12,13 bicelles,^14,15 e amphipols. ^{16 , 17} tuttavia, l’uso di detergenti micelle rimane uno degli approcci più comuni e semplici per soddisfare le esigenze di solubilità di una data proteina. ^{18 , 19 , 20 , 21 , 22 , 23 , 24 , 25} purtroppo, nessun singolo detersivo o la magica miscela di detergenti attualmente esiste che soddisfa tutte le proteine di membrana; così, queste condizioni devono essere schermate empiricamente per le esigenze specifiche di ogni proteina. ^{26 , 27}

Detergenti, auto-assemblarsi in soluzione sopra loro concentrazione micellare critica per formare le strutture aggregati chiamate micelle. Micelle sono composte di molti monomeri detergente (in genere che vanno da 20-200) con catene idrofobiche alchiliche formando un nucleo di micelle e gruppi testa idrofiliche disposti in uno strato di guscio micella affrontando il solvente acquoso. Il comportamento di detergenti e formazione di micelle è stato classicamente descritto da Charles Tanford in The effetto idrofobico,²⁸ e dimensioni e forme delle micelle dai detergenti comunemente utilizzati negli studi di proteine di membrana sono stati caratterizzata mediante scattering ad angolo piccolo. ^{29 , 30} organizzazione detersivo sulle proteine di membrana è stato anche studiato, e la formazione di complessi proteina-detergente (PDC) è previsto con detergente molecole circostanti la proteina in un arrangiamento che ricorda il detergente pulito micelle. ³¹

Uno ha aggiunto vantaggio nell’utilizzo di detergenti è che le proprietà di micella risultante possono essere manipolate incorporando altri detergenti. Molti detergenti per mostre di miscelazione ideale, e selezionare proprietà delle micelle miste possono anche essere prevedute dal componenti e rapporto di miscelazione. ²² tuttavia, la presenza di detersivo può ancora presentare sfide per caratterizzazioni biofisiche contribuendo al segnale complessivo. Ad esempio, con tecniche di dispersione della luce e raggi x, segnale da detersivo in PDC è praticamente indistinguibile dalla proteina. ³² le indagini con singola particella cRIO-microscopia elettronica (cryo-EM) in genere si basano su particelle intrappolate (congelate); dettagli strutturali della proteina sono ancora oscurati da taluni detersivi o un’alta concentrazione di detersivo che aggiunge allo sfondo. ³³ approcci alternativi verso interpretando la completa struttura PDC (compreso il detersivo) sono state fatte attraverso metodi computazionali che cercano di ricostruire il detersivo intorno una proteina di membrana determinato. ³⁴

Per il caso di scattering di neutroni, la disposizione di nucleo-guscio di detersivo nella micella produce un fattore di forma che contribuisce alla dispersione osservata. Fortunatamente, i componenti della soluzione possono essere alterati tale che non contribuiscono alla dispersione osservata netta. Questo processo di “contrasto di corrispondenza” si ottiene sostituendo deuterio per l’idrogeno ottenere una densità di lunghezza di dispersione che corrisponde a quello dello sfondo (buffer). Deve essere considerate una scelta giudiziosa di detergente (con controparti deuterati disponibile) e il loro rapporto di miscelazione. Per detergente micelle, questa sostituzione può essere eseguita usando un detersivo con lo stesso gruppo di testa ma avendo una catena alchilica deuterato (d-coda invece di h-coda). Dato che i detergenti sono ben miscelati,³⁵ loro aggregati avrà una densità di lunghezza di dispersione è la frazione molare ponderata medio dei due componenti (h-code e d-code). Quando questo contrasto medio è coerenza con quella del gruppo di testa, le strutture di aggregazione uniforme possono essere abbinate completamente per rimuovere tutti i contributi alla dispersione osservata.

Presentiamo qui un protocollo per manipolare il contrasto di neutroni di micelle detergente incorporando molecole chimicamente identici detersivi con catene alchiliche deuterio-etichettati. ^{19 , 36 , 37} ciò consente il completo contrasto simultaneo di corrispondenza della micella core e shell, che è una capacità unica di scattering di neutroni. ^{35 , 38} con questo significativamente raffinato livello di dettaglio, contrasto di corrispondenza può attivare studi altrimenti irrealizzabile di strutture di proteine di membrana. Inoltre, questo approccio di contrasto di corrispondenza potrebbe essere esteso ad altri sistemi che coinvolgono detergente, come polimero cambio reazioni³⁹ e olio-acqua disperdenti,⁴⁰ o anche altri agenti solubilizzanti, quali bicelles,⁴¹ nanodiscs,⁴² o blocco di copolimeri. ⁴³ A approccio simile come delineato in questo manoscritto, ma impiegando una singola specie di detersivo con sostituzioni di deuterio parziale sul gruppo alchilico catena e/o di testa, è stato recentemente pubblicato. ³⁷ mentre questo può essere previsto per migliorare la distribuzione casuale di idrogeno e deuterio in tutto il detersivo rispetto all’approccio qui presentato, il numero limitato di posti disponibili sul detersivo per sostituzione e in due fasi detergente sintesi necessari pone ulteriori sfide per l’esame.

I passaggi 1 e 2 del protocollo descritto di seguito spesso si sovrappongono poiché esperimento iniziale pianificazione deve essere fatto per presentare una proposta di qualità. Tuttavia, la presentazione delle proposte è considerato qui come il primo passo per sottolineare che questo processo deve essere iniziato in anticipo un esperimento di neutroni. Si noti inoltre che un passaggio dei prerequisiti, che dovrebbe essere dimostrato dalla proposta, è di avere la caratterizzazione biochimica e fisica (tra cui purezza e stabilità) del campione sostiene la necessità per gli studi di neutroni. Una discussione generale di small-angle neutron scattering (SANS) è oltre la portata di questo articolo. Un’introduzione breve ma completa è disponibile nella Caratterizzazione di materiali da Kaufmann,⁴⁴ e una soluzione completa di libro concentrata sul biologica small-angle scattering è stata recentemente pubblicata l’opera di riferimento. ⁴⁵ ulteriori letture consigliate sono riportate nella sezione discussione. Scattering di piccolo angolo utilizza il così chiamato vettore di dispersione Q come la quantità centrale che descrive il processo di dispersione. In questo articolo utilizza la definizione ampiamente accettata Q = 4 π sin (θ) / λ, dove θ è la metà dell’angolo tra fascio in ingresso e sparso e λ è la lunghezza d’onda della radiazione neutronica in Angstrom. Esistono altre definizioni che uso diverso simboli come di ‘ per il vettore di dispersione e che possono variare di un fattore 2 π o utilizzando nanometri al posto di Angstrom (Vedi anche la discussione di Figura 10).