התאמת ניגודיות דטרגנט בניסויים פיזור ניוטרון זווית קטנה עבור ניתוח מבנה של חלבון ממברנה ומודלים Initio אלב

קרום חלבונים מקודדים של % 30 המשוערת של גנים כל¹ , מייצגים את רוב מטרות עבור תרופות מרפא מודרניים חזקים. ² חלבונים אלה לבצע מגוון רחב של פונקציות חיוני הסלולר,³ אך למרות שפע וחשיבות שלהם – מייצג רק כ 1% של מבנים הכולל שהופקדו Collaboratory המחקר עבור חלבון ביואינפורמטיקה מבנית (RCSB) בנק מידע. ⁴ בשל טבעם הידרופובי חלקית, נחישות מבנית של חלבוני ממברנה מכורך כבר מאוד מאתגר. ^{5 , 6 , 7}

טכניקות רבות biophysical דרוש monodisperse חלקיקים בתמיסה למדידה, בידוד מהחלבונים ממברנה מקורית ממברנות וייצוב חלבונים אלה ב לחקות מסיסים של הממברנות מקורי היה שטח פעיל של מחקר האחרונים עשורים. ^{8 , 9 , 10} חקירות אלה הובילו לפיתוח של הרכבות amphiphilic הרומן רבים solubilize קרום חלבונים, כגון nanodiscs,^11,12,bicelles¹³ ,^14,15 , amphipols. ^{16 , 17} . עם זאת, השימוש הקזאין דטרגנט נשאר לאחת הגישות הנפוצות ביותר וברור מספק את הדרישות מסיסות של חלבון נתון. ^{18 , 19 , 20 , 21 , 22 , 23 , 24 , 25} . למרבה הצער, אין סבון יחיד או תערובת הקסם של דטרגנטים כיום קיימת המקיים את כל החלבונים ממברנה; לפיכך, התנאים האלה בטח מדעית שיוקרנו הדרישות הייחודיות של כל חלבון. ^{26 , 27}

חומרי ניקוי עצמי להרכיב בפתרון מעל שלהם ריכוז קריטי מיצלה למבנים צבירה טופס שנקרא הקזאין. הקזאין המורכבות הרבה מונומרים דטרגנט (בדרך כלל בטווח שבין 20-200) עם שרשראות הידרופוביות אלקיל ויוצרים גרעין מיצלה וקבוצות ראש הידרופילית מסודרים בשכבה מעטפת מיצלה מול הממס מימית. ההתנהגות של חומרי ניקוי, היווצרות מיצלה שתיארנו בסגנון קלאסי על ידי צ’ארלס Tanford אפקט הידרופובי,²⁸ , גדלים, צורות של הקזאין של דטרגנטים נפוץ במחקרים חלבון ממברנה היה מאופיין באמצעות פיזור זווית קטנה. ^{29 , 30} דטרגנט הארגון על קרום חלבונים גם נחקר, וצפויה היווצרות של חלבונים-דטרגנט מתחמי (שיתפקדו) עם מולקולות דטרגנט המקיפים את החלבון בהסדר הדומה הנוזל מסודר הקזאין. ³¹

אחד הוסיף היתרון בשימוש חומרי ניקוי היא כי ניתן לטפל המאפיינים מיצלה הנוצרת על-ידי שילוב חומרי ניקוי אחרות. חומרי ניקוי רבים שהפגינו ערבוב אידיאלי, אפילו ניתן לחזות בחר מאפייני הקזאין מעורבות מן הרכיבים ואת יחס של ערבוב. ²² . עם זאת, הנוכחות של דטרגנט יכול עדיין להציג אתגרים אפיוני biophysical בתרומה לחברה האות הכללית. לדוגמה, עם צילום רנטגן וטכניקות פיזור אור, האיתות דטרגנט ב PDC הוא כמעט להבחין מגניחותיה חלבון. ³² חקירות עם מיקרוסקופ יחיד-חלקיקים הקפאה-אלקטרונים (הקפאה-EM) בדרך כלל לסמוך על לכוד חלקיקים (קפואים); פרטים מבניים של החלבון מעורפלים. עדיין דטרגנטים מסוימים או ריכוז גבוה של חומרי ניקוי המוסיף הרקע. ³³ גישות חלופיות לקראת פענוח המבנה PDC מלאה (כולל הנוזל) נעשו באמצעות שיטות אשר מבקשים לשחזר הנוזל סביב חלבון ממברנה נתון. ³⁴

במקרה של פיזור ניוטרון, הסידור ליבה-קליפה של דטרגנט בתוך מיצלה מייצרת גורם טופס אשר תורמת פיזור התצפיות. למרבה המזל, ניתן לשנות רכיבי פתרון כזה כי הם לא תורמים פיזור התצפיות נטו. תהליך זה “חדות התאמת” מושגת על ידי החלפת דאוטריום מימן להשיג צפיפות אורך פיזור המתאים של הרקע (מאגר). יש לקחת בחשבון בחירה הביוספירה של דטרגנט (עם עמיתיהם deuterated זמין) ואת היחס של ערבוב. עבור הקזאין דטרגנט, החלפה זו יכולה להתבצע באמצעות חומר ניקוי עם אותה הקבוצה בראש אבל העובדה שרשרת אלקיל deuterated (d-הזנב במקום h-הזנב). מאז חומרי ניקוי היטב מעורבת,³⁵ אגרגטים שלהם יש צפיפות אורך פיזור זה השבר-השומה משוקלל ממוצע של שני הרכיבים (h-פלי ו d-פלי). כאשר זה הניגוד הממוצע של ראש הקבוצה, המבנים צבירה במדים ניתן להתאים באופן מלא כדי להסיר את כל התרומות כדי פיזור התצפיות.

אנו מציגים כאן פרוטוקול לתמרן את הניגוד ניוטרון של דטרגנט הקזאין על-ידי שילוב מולקולות דטרגנט מבחינה כימית זהה עם התווית על-ידי דאוטריום אלקיל שרשראות. ^{19 , 36 , 37} זה מתיר מהניגודים סימולטני התאמת מיצלה core ו- shell, אשר היא יכולת ייחודית של פיזור ניוטרון. ^{35 , 38} עם רמת פירוט מעודן באופן משמעותי, התאמת ניגודיות יכול לאפשר לימודים אחרת ישים מבני חלבון ממברנה. בנוסף, גישה זו התאמת ניגודיות אפשרות להאריך למערכות אחרות הקשורות דטרגנט, כגון פולימר חילופי תגובות³⁹ ו שמן מים dispersants,⁴⁰ או אפילו סוכנים אחרים, solubilizing, כגון bicelles,⁴¹ copolymers nanodiscs,⁴² או לחסום. גישה דומה ⁴³ א כמתואר כתב יד זה, אבל העסקת זן דטרגנט יחיד עם החלפות חלקיות דאוטריום-אלקיל שרשרת ו/או ראש הקבוצה, יצא לאור לאחרונה. ³⁷ בזמן זה צפויים לשפר את התפלגות אקראית של מימן, דאוטריום בכל רחבי הנוזל לעומת הגישה המובאת כאן, מספר מוגבל של משרות פתוחות על החומר ניקוי עבור החלפת ושני שלבים סינתזה דטרגנט נדרש מציבה אתגרים נוספים בתמורה.

שלבים 1 ו- 2 של פרוטוקול שיפורטו להלן לעתים קרובות חופפים מאז תכנון הניסוי הראשוני חייב להיעשות להגיש הצעה איכות. עם זאת, הצעת הגשה נחשב כאן בתור הצעד הראשון כדי להדגיש כי תהליך זה אמורה להתחיל הרבה לפני ניסוי ניוטרון. יש גם לציין כי צעד דרישה מוקדמת, אשר צריך ניתן להדגים על ידי ההצעה, הוא שתהיה הביוכימי ופיזית אפיון (כולל טוהר ויציבות) הדגימה התומכים בצורך לימודי ניוטרון. דיון כללי של זווית קטנה ניוטרון פיזור (SAN) חורג מהיקף מאמר זה. הקדמה קצרה אך יסודי זמין העבודה הפניה ואפיון של חומרים על ידי קאופמן,⁴⁴ וספר לימוד ממוקד ביולוגי זווית קטנה פתרון מקיף פיזור שפורסם לאחרונה. ⁴⁵ עוד המלצה לקריאה ניתנת במקטע דיון. זווית קטנה פיזור משתמש הווקטור פיזור שנקרא Q הכמות המרכזי המתאר את תהליך פיזור. מאמר זה משתמש בהגדרת נפוצה ומקובלת Q = חטא 4π (θ באמצעות) / λ, איפה θ באמצעות חצי הזווית בין קרן פזורים ונכנסות λ הוא אורך הגל של הקרינה ניוטרון ב אנגסטרום. הגדרות אחרות קיים שימוש שונה סמלים כגון של ‘ עבור וקטור פיזור, וכי עשויים להשתנות על ידי 2π פקטור או באמצעות ננומטר במקום אנגסטרום (ראה גם הדיון איור 10).