Kontrast-passende Reinigungsmittel im Small-Angle Neutron Streuexperimente für Membrane Protein strukturelle Analyse und Modellierung von Ab Initio

Membranproteine sind um schätzungsweise 30 % aller Gene¹ codiert und repräsentieren eine deutliche Mehrheit der Ziele für die modernen Arzneimitteln. ² diese Proteine führen eine Vielzahl von lebenswichtigen Zellfunktionen,³ aber trotz ihrer Fülle und ihrer Bedeutung – nur etwa 1 % der gesamten Strukturen hinterlegt in der Forschung Collaboratory für strukturelle Bioinformatik (RCSB) Protein darstellen Daten Bank. ⁴ aufgrund ihrer teilweise hydrophoben Natur, Strukturaufklärung von Proteinen, Membrane-springen überaus schwierig wurde. ^{5 , 6 , 7}

Wie viele biophysikalische Techniken Monodisperse Partikel in Lösung für die Messung erforderlich, wurde Membranproteine von native Membranen zu isolieren und stabilisiert diese Proteine in eine lösliche Mimik der native Membranen ein aktives Gebiet der Forschung in den letzten Jahren Jahrzehnten. ^{8 , 9 , 10} diese Untersuchungen zur Entwicklung der vielen neuartigen AMPHIPHILE Baugruppen führten zu solubilisieren Membranproteine, wie Nanodiscs,^11,12,13 Bicelles^14,15 und Amphipols. ^{16 , 17} bleibt jedoch die Verwendung von Reinigungsmittel Micellen einer der am weitesten verbreitete und einfache Ansätze für die Erfüllung der Anforderungen der Löslichkeit eines gegebenen Proteins. ^{18 , 19 , 20 , 21 , 22 , 23 , 24 , 25} leider gibt es kein einziges Reinigungsmittel oder magische Mischung von Reinigungsmitteln derzeit, die alle Membranproteine gerecht wird; Diese Bedingungen müssen daher empirisch für die individuellen Anforderungen jedes Protein kontrolliert werden. ^{26 , 27}

Reinigungsmittel selbst-zusammenbauen in Lösung über ihre kritischen Micelle Konzentration zu aggregieren Strukturen Mizellen genannt. Mizellen bestehen aus vielen Waschmittel Monomere (in der Regel im Bereich von 20-200) mit hydrophoben Alkyl-Ketten bilden eine Micelle Kern- und hydrophilen Kopfgruppen angeordnet in einem Micelle Shell Layer mit Blick auf das wässrige Lösungsmittel. Das Verhalten von Waschmitteln und Micelle Bildung wurde von Charles Tanford in Der hydrophobe Effekt,²⁸ und Größen klassisch beschrieben und Formen von Micellen aus häufig verwendeten Reinigungsmittel in Membran-Protein-Studien wurden mit kleinen Winkel Streuung charakterisiert. ^{29 , 30} Waschmittel Organisation über Membranproteine wurde ebenfalls untersucht, und die Bildung von Protein-Reinigungsmittel-komplexen (PDCs) dürfte mit Waschmittel Moleküle, die rund um das Protein in einer Anordnung, die das ordentliche Waschmittel ähnelt Mizellen. ³¹

Eine hinzugefügte Vorteil bei der Verwendung von Reinigungsmitteln ist, dass die resultierenden Micelle Eigenschaften bearbeitet werden können, durch die Integration von anderen Waschmitteln. Viele Waschmittel weisen ideale mischen, und wählen Sie Eigenschaften von gemischten Micellen können sogar vorhergesagt werden, von den Komponenten und Verhältnis zu mischen. ²² jedoch kann das Vorhandensein von Waschmittel noch für biophysikalische Charakterisierungen Herausforderungen beitragen, das gesamte Signal. Signal von Waschmittel in der PDC ist beispielsweise mit Röntgen- und Lichtstreuung Techniken, praktisch nicht von Protein. ³² Untersuchungen mit einzelnen Teilchen Kryo-Elektronenmikroskopie (Cryo-EM) verlassen in der Regel auf eingeschlossene Partikel (gefroren); strukturelle Details des Proteins sind noch verdeckt durch bestimmte Reinigungsmittel oder eine hohe Konzentration des Reinigungsmittels, der Hintergrund verleiht. ³³ alternative Ansätze zur Interpretation der vollen PDC-Struktur (inklusive Waschmittel) durch Berechnungsmethoden wurden unternommen, die darauf abzielen, das Waschmittel um einen bestimmten Membranprotein zu rekonstruieren. ³⁴

Für den Fall der Neutronenstreuung produziert die Kern-Schale-Anordnung der Reinigungsmittel in der Micelle einen Formfaktor die beobachtete Streuung beiträgt. Glücklicherweise können Lösungskomponenten geändert werden, so dass sie nicht zu den net beobachtete Streuung beitragen. Dabei “Kontrast passend” erfolgt durch Substitution von Deuterium für Wasserstoff, eine Streuung Länge Dichte zu erreichen, die den Hintergrund (Puffer) übereinstimmt. Eine vernünftige Auswahl an Reinigungsmittel (mit verfügbaren deuterierte Gegenstücke) und ihr Verhältnis zu mischen müssen berücksichtigt werden. Für Waschmittel Micellen kann diese Substitution mit einem Waschmittel mit der gleichen Kopf Gruppe aber eine deuterierte Alkyl Kette (d-Tail statt h-Tail) durchgeführt werden. Da das Waschmittel gut gemischt sind,³⁵ ihrer Aggregate haben eine Streuung Länge Dichte, die Mole-Fraktion gewichtete Durchschnitt der beiden Komponenten (h-Schwänzen und d-Tails). Wenn diese durchschnittliche Kontrast mit derjenigen der Kopfgruppe konsistent ist, können einheitlichen aggregierten Strukturen voll abgestimmt werden, um alle Beiträge zu beobachtete Streuung zu entfernen.

Wir stellen Ihnen hier ein Protokoll, um das Neutron Kontrast von Waschmittel Micellen zu manipulieren, durch den Einbau von chemisch identisch Waschmittel Moleküle mit Deuterium-Label Alkyl-Ketten. ^{19 , 36 , 37} das komplette Simultankontrast Anpassung der Micelle Kern und Schale, die eine einzigartige Fähigkeit der Neutronenstreuung ist erlaubt. ^{35 , 38} mit dieser deutlich verfeinert Detailebene, passender Kontrast aktivieren kann sonst nicht machbar Studien von Membran-Protein-Strukturen. Darüber hinaus könnte dieser Kontrast-matching-Ansatz auf andere Systeme mit Waschmittel wie Polymer Austausch Reaktionen³⁹ und Öl-Wasser-Dispergiermittel,⁴⁰ oder sogar andere solubilizing Mittel, wie Bicelles,⁴¹ ausgeweitet werden Nanodiscs,⁴² oder Block-Copolymere. ⁴³ A ähnlicher Ansatz wie in dieser Handschrift, aber mit einer einzigen Waschmittel Spezies mit teilweise Deuterium Substitutionen auf die Alkylgruppe Kette und/oder Kopf wurde vor kurzem veröffentlicht. ³⁷ während dies erwartet werden kann, um die zufällige Verteilung von Wasserstoff und Deuterium in das Waschmittel zu verbessern im Vergleich zu der hier vorgestellte Ansatz der begrenzten Anzahl der verfügbaren Positionen auf das Waschmittel für Substitution und in zwei Schritten Waschmittel Synthese benötigt zusätzliche Herausforderungen für die Prüfung.

Schritte 1 und 2 des Protokolls unten oft überschneiden sich da erstes Experiment Planung erfolgen muss, um eine Qualität Vorschlag zu unterbreiten. Antragstellung gilt jedoch hier als der erste Schritt zu betonen, dass dieser Prozess im Vorfeld ein Neutron-Experiment gestartet werden soll. Anzumerken ist, dass ein erforderlicher Schritt, der durch den Vorschlag nachgewiesen werden sollte, ist, biochemischen und physikalischen Charakterisierung (einschließlich Reinheit und Stabilität) der Probe die Notwendigkeit Neutron Untersuchungen zu unterstützen. Eine allgemeine Diskussion über kleine Winkel Neutronen-Streuung (SANS) sprengt den Rahmen dieses Artikels. Eine kurze, aber gründliche Einführung gibt es in der Referenzarbeit, die Charakterisierung der Materialien von Kaufmann,⁴⁴ und eine umfassende Lehrbuch konzentrierte sich auf biologische kleine Winkel Lösung Streuung vor kurzem veröffentlicht worden. ⁴⁵ weitere Buchempfehlungen ist im Abschnitt Diskussion gegeben. Kleine Winkel Streuung verwendet die so genannten Streuung Vektor Q als zentrale Menge, die die Streuung Prozess beschreibt. Dieser Artikel verwendet die allgemein akzeptierte Definition Q = 4π Sünde (θ) / λ, wo θ halbe Winkel zwischen eingehenden und verstreuten Strahl und λ ist ist die Wellenlänge der Neutronenstrahlung in Angström. Andere Definitionen existieren, verwenden Sie verschiedene wie z. Symbole b. die “für die Streuung Vektor, und dass durch einen Faktor 2π oder mithilfe von Nanometern anstelle von Angstrom abweichen kann (siehe auch Diskussion der Abbildung 10).