Contrast-Matching wasmiddel in Small-Angle Neutron Scattering experimenten voor membraan eiwit structurele analyse en modellering van de Ab Initio

Membraaneiwitten worden gecodeerd door een naar schatting 30% van alle genen¹ en vertegenwoordigen een grote meerderheid van de doelen voor de moderne geneesmiddelen. ² deze eiwitten voeren een breed scala van vitale cellulaire functies,³ maar ondanks hun overvloed en belang — vertegenwoordigen slechts ongeveer 1% van de totale structuren die zijn neergelegd in de voor structurele Bioinformatics (RCSB) eiwit Collaboratory onderzoek Gegevens Bank. ⁴ vanwege hun gedeeltelijk hydrofobe aard, structurele bepaling van membraan-gebonden eiwitten is buitengewoon uitdagende. ^{5 , 6 , 7}

Zoals vele biofysische technieken monodispers deeltjes in oplossing voor meting vereisen, isoleren van membraaneiwitten van inheemse membranen en het stabiliseren van deze eiwitten in een oplosbare nabootsen van de inheemse membranen geweest een actief gebied van het onderzoek in de afgelopen decennia. ^{8 , 9 , 10} deze onderzoeken hebben geleid tot de ontwikkeling van vele nieuwe amfifiele samenstellingen aan membraaneiwitten, zoals nanodiscs,^11,12,13 bicelles,^{14,15 solubilize} en amphipols. ^{16 , 17} het gebruik van detergenten micellen blijft echter een van de meest voorkomende en eenvoudige manieren om te voldoen aan de eisen van de oplosbaarheid van een bepaald eiwit. ^{18 , 19 , 20 , 21 , 22 , 23 , 24 , 25} helaas geen enkele wasmiddel of magische mengsel van detergentia momenteel bestaat die voldoet aan alle membraaneiwitten; Dus, deze voorwaarden moeten empirisch worden gescreend voor de unieke vereisten van elke proteïne. ^{26 , 27}

Detergentia monteren zelf in oplossing boven hun kritische micel concentratie aan statistische structuren vorm genaamd micellen. Micellen zijn samengesteld uit vele wasmiddel monomeren (meestal variërend van 20-200) met hydrofobe alkyl-ketens vormen een micel kern en hydrofiele kop groepen gerangschikt in een micel shell laag geconfronteerd met de waterige oplosmiddelen. Het gedrag van detergentia en micel vorming is klassiek beschreven door Charles Tanford in The hydrofobe Effect,²⁸ en maten en vormen van micellen van veelgebruikte detergentia in membraan eiwit studies zijn gekenmerkt met behulp van kleine-hoek verstrooiing. ^{29 , 30} wasmiddel organisatie over membraaneiwitten is ook onderzocht, en de vorming van eiwit-wasmiddel complexen (PDC’s) met wasmiddel moleculen rond het eiwit in een rangschikking die lijkt op het keurige wasmiddel wordt verwacht micellen. ³¹

Een toegevoegd voordeel bij het gebruik van detergentia is dat de resulterende micel eigenschappen kunnen worden gemanipuleerd door de integratie van andere detergentia. Veel detergenten vertonen ideale mengen, en selecteer Eigenschappen van gemengde micellen kunnen zelfs worden voorspeld op grond van de onderdelen en de verhouding van het mengen. ²² echter de aanwezigheid van wasmiddel kan nog presenteren uitdagingen voor biofysische karakterisaties door bij te dragen aan de algehele signaal. Bijvoorbeeld met x-stralen en lichtverstrooiing technieken is signaal van wasmiddel in de PDC vrijwel niet te onderscheiden van eiwit. ³² onderzoeken met single-deeltje cryo-elektronenmicroscopie (cryo-EM) meestal rekenen op gevangen (bevroren) deeltjes; structurele details van het eiwit zijn nog steeds verduisterd door bepaalde wasmiddelen of een hoge concentratie van wasmiddel die wordt toegevoegd aan de achtergrond. ³³ alternatieve benaderingen naar het interpreteren van de volledige structuur van de PDC (met inbegrip van het wasmiddel) zijn aangebracht door middel van computationele methoden die willen reconstrueren het wasmiddel rond een bepaald membraan eiwit. ³⁴

Voor het geval van neutronen verstrooiing produceert de rangschikking van de kern-shell van wasmiddel in de micel een form-factor die tot de waargenomen verstrooiing bijdraagt. Gelukkig, kunnen oplossing onderdelen worden gewijzigd, zodat ze niet aan de netto waargenomen verstrooiing bijdragen. Dit proces van “contrast overeenkomende” wordt bereikt door het vervangen van deuterium voor waterstof te bereiken een verstrooiing lengte dichtheid die overeenkomt met de achtergrond (buffer). Een verstandige keuze van wasmiddel (met beschikbare Halfzwaar tegenhangers) en hun verhouding van mengen moeten worden beschouwd. Voor detergentia micellen, kan deze vervanging worden uitgevoerd met een sopje met dezelfde hoofd groep maar met een Halfzwaar alkylketen (d-staart in plaats van h-staart). Aangezien de detergentia goed gemengd zijn,³⁵ hun aggregaten zal een soortelijke massa hebben verstrooiing lengte die is de mol-fractie gewogen gemiddelde van de twee componenten (h vliegengordijn en d vliegengordijn). Wanneer dit gemiddelde contrast consistent met die van de hoofd groep is, kunnen de uniforme statistische structuren gekoppeld worden volledig als u wilt verwijderen van alle bijdragen aan waargenomen verstrooiing.

Wij presenteren hier een protocol om te manipuleren het neutron contrast van wasmiddel micellen door integratie van chemisch identiek wasmiddel moleculen met deuterium-geëtiketteerden alkyl ketens. ^{19 , 36 , 37} dit toestaat volledige gelijktijdige contrast matching van micel kern en shell, dat een unieke mogelijkheid van neutronen verstrooiing is. ^{35 , 38} met deze aanzienlijk verfijnd detailniveau, contrast bijpassende kunnen anders onhaalbaar studies van membraan eiwit structuren. Bovendien, kan deze contrast-matching aanpak worden uitgebreid naar andere systemen waarbij wasmiddel, zoals polymeer uitwisseling reacties³⁹ en olie-water dispergeermiddelen,⁴⁰ of zelfs andere solubilizing agenten, zoals bicelles,⁴¹ nanodiscs,⁴² of blok copolymeren. ⁴³ A vergelijkbare aanpak zoals omschreven in dit manuscript, maar het tewerkstellen van een enkele wasmiddel soorten met gedeeltelijke deuterium substituties op de alkyl-keten en/of hoofd-groep, werd onlangs gepubliceerd. ³⁷ terwijl dit verwacht kan worden dat de willekeurige verdeling van waterstof en deuterium gedurende het wasmiddel verbeteren ten opzichte van de hier gepresenteerde benadering het beperkte aantal beschikbare posities over het wasmiddel voor vervanging en in twee stappen wasmiddel synthese vereist poses extra uitdagingen voor behandeling.

Stap 1 en 2 van het protocol hieronder vaak overlappen omdat eerste experiment plannen gebeuren moet een kwaliteit wijzigingsvoorstel in te dienen. Indiening van het voorstel is echter hier als de eerste stap om te benadrukken dat dit proces ruim van tevoren een neutron experiment moet worden gestart. Ook opgemerkt moet worden dat een vereiste stap, die moet worden aangetoond door het voorstel, is dat de biochemische en fysische karakterisering (met inbegrip van de zuiverheid en stabiliteit) van het monster ter ondersteuning van de noodzaak van studies van de neutron. Een algemene discussie van small-angle neutron verstrooiing (SANS) valt buiten het bestek van dit artikel. Een korte maar grondige inleiding is beschikbaar in het referentiewerk Karakterisering van materialen door Kaufmann,⁴⁴ en een leerboek gericht op biologische kleine-hoek totaaloplossing verstrooiing is onlangs verschenen. ⁴⁵ meer aanbevolen lectuur wordt verwezen in de sectie discussie. Kleine hoek verstrooiing gebruikt de zogenaamde verstrooiing vector Q als het centrale aantal dat het proces van de verstrooiing beschrijft. Dit artikel maakt gebruik van de algemeen aanvaarde definitie Q = 4π zonde (θ) / λ, waar θ de helft van de hoek tussen inkomende en verspreide lichtbundel en λ is de golflengte van de neutronenstraling in Angstroms is. Andere definities bestaan dat gebruik verschillende symbolen zoals de ‘ voor de verstrooiing vector, en die verschillen kunnen met een factor 2π of met behulp van nanometer in plaats van Angstrom (Zie ook bespreking van Figuur 10).