Pulsatil luteinizan hormon salgısı değerlendirilmesi için kuyruk ucu kan örnekleme farelerde sık
Summary
Burada kontrolsüz farelerde sık örnek koleksiyon için bir kuyruk ucu kan örnekleme iletişim kuralı mevcut. Bu yöntem, pulsatil luteinizan hormon salgısı değerlendirilmesi desenleri yararlıdır ve dolaşımdaki diğer faktörleri analiz için adapte.
Abstract
Birçok endokrin sistemlerinde, dolaşımdaki faktörler veya hormonlar sürekli serbest bırakılmaz, ancak yanıt releasing faktör olarak ayrık bir darbe olarak salgılanan. Tek-noktaya örnekleme önlemler tamamen pulsatil hormonlarının normal fizyolojik koşullar altında veya bozukluk koşulları sırasında salgı desen biyolojik önemini anlamak yetersizdir. Luteinizan hormon (LH) anterior hipofiz gonadotrope hücreleri tarafından sentezlenen ve sık sık kan örnekleri topluluğu için nabız değerlendirme gerektiren pulsatil desen salgılanan. İçin bir teknik gelişme sık düşük hacimli örnek koleksiyon, başlangıçta Steyn ve meslektaşları tarafından açıklanan ve bu kadar yüksek-duyarlı LH tahlil gelişimi nedeniyle son zamanlarda, farelerde mümkün olmamıştır. 1 burada tarif biz sık periferik kan örnek koleksiyonundan pulsatil LH salgılanmasını algılamaya yeterli işleme iklimlendirme ile fareler için bir iletişim kuralı. Geçerli protokol LH sağlam ve sürekli darbeleri değerlendirilmesi üzerinde birden fazla saat izin veren bir genişletilmiş iklimlendirme dönemi ayrıntıları. Bu iletişim kuralı, kuyruk ucu kırpılır ve kan el bir pipet kullanarak kuyruk toplanır. Gonadectomized farelerde pulsatil LH değerlendirmesi için seri örneklerdir önemlisi, her 5-6 min 90-180 dakika süreyle toplanan kan toplanması ve LH sağlam darbeleri ölçülmesi yeterli işleme verilen uyanık, özgürce davranmaya farelerde başarılı İklimlendirme ve çevre stresler en aza indirmek için çaba. Yeterli iklimlendirme kan toplama önce 4-5 hafta içinde elde edilebilir. Bu iletişim kuralı tam kan örnekleri pulsatil LH salgılanmasını desenleri değerlendirmesi Mouse, nöroendokrin araştırma için güçlü bir hayvan modeli birden çok saat üzerinde toplama sağlamak için metodoloji gelişmeler vurgulamaktadır.
Introduction
Erbezi işlevi memelilerde gonadotropin salgısını, luteinizan hormon (LH) ve folikül uyarıcı hormon, hipofiz bezi üzerine bağlıdır. Gonadotropins yanıt-e doğru hipotalamik gonadotropin – releasing hormon (GnRH) salgılanmasını pulsatil veya akım desende salgılanan. Sentez ve LH ve FSH salgılanmasını molekülleri hipotalamik GnRH, gonad steroid hormonlar ve aktivin-inhibin-follistatin sisteminin yanı sıra çok sayıda dahil olmak üzere çeşitli endokrin, parakrin ve otokrin eylem ile düzenlenmektedir stres ve enerji dengesi dahil olmak üzere fizyolojik koşullar. 2
LH pulsatil desen kan yaklaşık üstel eleme tarafından takip periferik kana LH oldukça ani bir deşarj doğar. Önemli her LH deşarj frekans ve genlik LH yanıtının Özellikler desen, ikisi de, kısmen, GnRH. son sürüme hipofiz hipotalamik portal kan ölçümü için toplama zorluk tarafından dikte pulsatil GnRH, örnekleme ve LH ölçümü bir proxy olarak hipofiz gonad hipotalamik eksen GnRH düzenlenmesi için kullanılır. Bu nedenle, önemli bilgileri tek bir örnek belirlenemiyor LH bakliyat genliği ve sıklığı kodlanmış olduğunu.
Pulsatil LH salgılanmasını Analizi tarihsel olarak büyük kan hacmi ve sık sık kan örnek koleksiyon için tolerans nedeniyle büyük memeliler (insan, primatlar ve koyun) için sınırlı olmuştur. Kemirgenler, sık sık kan örnekleme fare sınırlıydı ve atriyal kateter kalıcı yolu ile elde. 3 , 4 nispeten düşük maliyet ve genetik kullanılabilirliği (Örneğin cre-lox, CRISPR) ve karmaşık sinir devresi (Örneğin optogenetics, chemogenetics) manipülasyon yapmak fareler bir çekici model organizma; Ancak, sık sık kan örnekleri kazanma ve LH konsantrasyonu daha sonraki analiz kadar son zamanlarda, zor olduğu kanıtlandı. Bu anıtsal görev Steyn ve iş arkadaşları tarafından öncülük. 1 beri o zaman, birkaç labs sık kan örnekleme ve pulsatil LH salgılanmasını deneysel paradigmalar çeşitli değerlendirmek için Ultra-duyarlı LH deneyleri kullanmaya başladı. 5 , 6 , 7 , 8 , 9 bu fareler birden fazla kan örnekleri toplama pratik bir yöntem takip için en az 40 yıl10 yol boyunca yapılan birden fazla iyileştirmeler ile sürdürülen olmuştur belirtilmelidir. 11 , 12
Değerlendirmesi LH darbe desenleri (yani frekans ve genlik), bazal gonadotropin salgısını genetik olarak uysal bu hayvan modelinde izlenmesinde önemli bir arıtma gösterir. Geleneksel olarak, LH konsantrasyonu farelerde tek kan örneği belirlenmiştir. LH konsantrasyonu doğal olarak her darbe sırasında dalgalanıyor çünkü tek nokta örneklerinin bir zayıflık bir son derece değişken veri kümesidir. İzole ölçümleri doğal olarak kritik bilgi LH darbe salgı desenleri tarafından aktarılmaktadır özledim başka bir zayıflıktır. Böylece, özgürce davranmaya içinde sık sık kan örnekleri toplamak için bir yöntemi (dışında nazik işleme sırasında örnekleme) sınırsız fareler gelişmiş bilgi sağlamak ve pulsatil hormon düzenleme araştıran birçok laboratuvarlar için yararlı.
Burada, biz sık topluluğu için bir iletişim kuralı tanımlamak (her 6 dk) kan örnekleri uyanık, yasayı, fareler. Önemlisi, biz bir işleme dahil hangi öncesi ve sonrası değerlendirme akut bir meydan okuma için bir süre kararlı, tam kan örneklerinde pulsatil LH salgılanmasını sağlam ve sürekli tespiti üzerine toplanan için izin veren iklimlendirme Protokolü psiko-sosyal stres immobilizasyon ve kısıtlama yanıt gibi. Etkili bir tahlil LH konsantrasyonu tam kan örneklerinden için daha önce açıklanan; 1 bu protokolü LH nabız ölçümü için kan örnekleri toplamak için bir yöntemi üzerinde duruldu.
Protocol
Representative Results
Discussion
Burada tarif biz pulsatil LH salgılanmasını farelerde değerlendirilmesi için tam kan kuyruk ucu örnekleri sık sık kan toplanması için bir iletişim kuralı. Bu iletişim kuralı örnekleri akut değişiklikler psikososyal stres maruz takip pulsatil LH salgılanmasını algılanması için toplama sağlar ve LH darbeleri altında diğer akut veya kronik manipülasyonlar değerlendirilmesi için uygundur.
Yükleme-boşaltma kritik bileşenidir LH bakliyat güvenilir ve sağlam profille…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Yazarlar Drs. Jennifer Yang ve Alexander (Sasha) Kauffman yanı sıra çok sayıda yararlı ve önemli tartışmalar bu tekniği ile teknik destek için teşekkür ederiz. Serum hormon testleri tarafından Yang vd., 2017 üreme Ligand tahlil ve analiz çekirdek, Eunice Kennedy Shriver NICHD/NIH (NCTRI) Grant P50-HD28934 tarafından desteklenen araştırma için Virginia Üniversitesi Merkezi’nde yapıldı.
Araştırma Destek kaynakları: R01 NICHD 86100 (KMB), RBM T32 NICHD 007203 tarafından desteklenen.
Materials
| Biosaftey cabinet | Lab Products Inc | L/F-B | |
| Bovine serum albumin | Sigma | A5403 | |
| Tween-20 | Sigma | P2287 | |
| KCl | Sigma | P9333 | |
| NaCl | Sigma | S7653 | |
| Na2HPO4 (anhydrous) | Sigma | S7907 | |
| KH2PO4 | Sigma | P5655 | |
| Ultrapure water | Millipore | Purified and filtered water | |
| Broome Rodent Restraint Device | Harvard Apparatus | 52-0460 | Not necessary for blood collection, but were used in the collection of representative data. |
| DynPeak | n/a | n/a | http://journals.plos.org/plosone/article?id=10.1371/journal.pone.0039001 |
References
- Steyn, F. J., et al. Development of a methodology for and assessment of pulsatile luteinizing hormone secretion in juvenile and adult male mice. Endocrinology. 154 (12), 4939-4945 (2013).
- McArdle, C. A., Roberson, M. S., Plant, T. M., Zeleznik, A. J. . Knobil and Neill’s Physiology of Reproduction. , (2015).
- Parasuraman, S., Raveendran, R., Kesavan, R. Blood sample collection in small laboratory animals. Journal of Pharmacology and Pharmacotherapy. 1 (2), 87-93 (2010).
- Steiner, R. A., Bremner, W. J., Clifton, D. K. Regulation of luteinizing hormone pulse frequency and amplitude by testosterone in the adult male rat. Endocrinology. 111 (6), 2055-2061 (1982).
- Moore, A. M., Prescott, M., Marshall, C. J., Yip, S. H., Campbell, R. E. Enhancement of a robust arcuate GABAergic input to gonadotropin-releasing hormone neurons in a model of polycystic ovarian syndrome. Proceedings of National Academy of Science U S A. 112 (2), 596-601 (2015).
- Czieselsky, K., et al. Pulse and Surge Profiles of Luteinizing Hormone Secretion in the Mouse. Endocrinology. 157 (12), 4794-4802 (2016).
- Campos, P., Herbison, A. E. Optogenetic activation of GnRH neurons reveals minimal requirements for pulsatile luteinizing hormone secretion. Proceedings of National Academy of Science U S A. 111 (51), 18387-18392 (2014).
- Yang, J. A., et al. Acute Psychosocial Stress Inhibits LH Pulsatility and Kiss1 Neuronal Activation in Female Mice. Endocrinology. 158 (11), 3716-3723 (2017).
- Clarkson, J., et al. Definition of the hypothalamic GnRH pulse generator in mice. Proceedings of National Academy of Science U S A. 114 (47), E10216-E10223 (2017).
- Lewis, V. J., Thacker, W. L., Mitchell, S. H., Baer, G. M. A new technic for obtaining blood from mice. Laboratory Animal Science. 26 (2 Pt 1), 211-213 (1976).
- Abatan, O. I., Welch, K. B., Nemzek, J. A. Evaluation of saphenous venipuncture and modified tail-clip blood collection in mice. Journal of the American Association of Laboratory Animal Science. 47 (3), 8-15 (2008).
- Durschlag, M., Wurbel, H., Stauffacher, M., Von Holst, D. Repeated blood collection in the laboratory mouse by tail incision–modification of an old technique. Physiology and Behavior. 60 (6), 1565-1568 (1996).
- Goodman, R. L., Karsch, F. J. Pulsatile secretion of luteinizing hormone: differential suppression by ovarian steroids. Endocrinology. 107 (5), 1286-1290 (1980).
- Clarke, I. J., Cummins, J. T. Increased gonadotropin-releasing hormone pulse frequency associated with estrogen-induced luteinizing hormone surges in ovariectomized ewes. Endocrinology. 116 (6), 2376-2383 (1985).
- Vidal, A., Zhang, Q., Medigue, C., Fabre, S., Clement, F. DynPeak: an algorithm for pulse detection and frequency analysis in hormonal time series. PLoS One. 7 (7), e39001 (2012).
- Merriam, G. R., Wachter, K. W. Algorithms for the study of episodic hormone secretion. American Journal of Physiology. 243 (4), E310-E318 (1982).
- Xie, T. Y., et al. Effect of Deletion of Ghrelin-O-Acyltransferase on the Pulsatile Release of Growth Hormone in Mice. Journal of Neuroendocrinology. 27 (12), 872-886 (2015).
- Koch, C. E., Leinweber, B., Drengberg, B. C., Blaum, C., Oster, H. Interaction between circadian rhythms and stress. Neurobiology of Stress. 6, 57-67 (2017).
- Tuli, J. S., Smith, J. A., Morton, D. B. Corticosterone, adrenal and spleen weight in mice after tail bleeding, and its effect on nearby animals. Laboratory Animal. 29 (1), 90-95 (1995).
- . Animal Welfare Inspection Guide Available from: https://www.aphis.usda.gov/animal_welfare/downloads/Animal-Care-Inspection-Guide.pdf (2017)
- Steyn, F. J., et al. Development of a method for the determination of pulsatile growth hormone secretion in mice. Endocrinology. 152 (8), 3165-3171 (2011).
