拍動性の黄体形成ホルモンの分泌の評価のためマウス尾先端採血を頻繁に
Summary
ここで気ままなマウスで頻繁にサンプル コレクションの尻尾先端血液サンプリング プロトコルを提案します。このメソッドは、拍動性の黄体形成ホルモンの分泌の評価パターンに対して有用です、他の循環要因の分析のために合わせることができます。
Abstract
多くの内分泌システム、継続的に放出されていない循環の要因やホルモンが放出因子の応答の離散パルスとして分泌されます。シングル ポイント サンプリング対策は通常生理学的な条件の下でまたは不全の条件時に拍動性ホルモンの分泌のパターンの生物学的意義を十分に理解して適切です。黄体形成ホルモン (LH) が下垂体前葉の gonadotrope 細胞によって合成・ パルスの評価のための血液サンプルを頻繁に回収を必要とする拍動パターンで分泌されます。これは、マウスで最近まで高感度 LH 測定法の開発は、可能なされていないとの技術の進歩は、低ボリュームのサンプル コレクション、最初ジムと同僚によって記述を頻繁に。1ここで LH の律動性分泌を検出する十分な処理環境に順応マウスから頻繁に末梢血サンプルのコレクションのためのプロトコルについて述べる。現在のプロトコルは、複数時間にわたって LH の堅牢で連続パルスの評価を可能にする拡張の馴化期間を詳しく説明します。このプロトコルでは尾の先端がクリップされて、手持ちピペットを使用して尻尾からは採血します。シリアルのサンプルは、ごきぶりマウスで拍動の LH の評価のため重要なは、90-180 分に 5-6 分毎に収集血のコレクションと LH の堅牢なパルスの測定は、十分な処理を与え目を覚まし、自由行動下のマウスで行うことが順化および環境ストレスを最小限にするため。十分な馴化は、採血前に 4-5 週間以内に達成できます。このプロトコルはマウス神経内分泌研究の強力な動物モデルの複数の時間にわたって拍動の LH 分泌パターンの評価の全血試料の収集を確保するための方法論の進歩を強調表示します。
Introduction
哺乳類の生殖腺機能、性腺刺激ホルモン分泌、黄体形成ホルモン (LH)、卵胞刺激ホルモンは、脳下垂体からによって異なります。性腺刺激ホルモン放出ホルモン (GnRH) の視床下部分泌への応答での拍動やサージ パターンで、性腺刺激ホルモンが分泌されます。合成と LH と FSH の分泌、視床下部 GnRH、生殖腺ステロイド ホルモン、アクチビン-インヒビン-フォリスタチン システムとの無数を含む分子の様々 な内分泌、パラクリンやオートクリン アクションによって規制されています。生理的ストレスとエネルギーのバランスを含みます。2
血液中の LH 拍動パターンはおよそ指数除去に続いて、末梢血に lh ではなく急激な放電から発生します。重要なパターンの各 LH 放電の頻度と LH 反応の振幅が備わって、どちらのによって決定されます、一部、視床下部下垂体門脈血の測定のための収集の難しさに GnRH。 期限のリリース拍動の GnRH、サンプリングと LH の測定は、視床下部-下垂体-性腺軸の GnRH 調節のプロキシとして使用されます。そのため、重要な情報は、周波数と振幅、LH のパルスは、1 つのサンプルからは判断できないのでエンコードされます。
LH の律動性分泌の解析とその大規模な血液量と頻繁に血液検体採取許容のための大型哺乳類 (ヒト、霊長類、羊) に限定されてきました。齧歯動物、頻繁に採血はラットに限られていたし、心房カテーテルを留置することでいます。3,4比較的低コストと遺伝の可用性 (例えばcre lox、CRISPR) し、複雑な神経回路 (例えばオプトジェネティクス、chemogenetics) 操作するマウス魅力的なモデル有機体;しかし、頻繁に血液サンプルの達成と LH 濃度の後続の分析まで最近、実証してとらえどころのないです。この記念碑的なタスクは、スタインと協力者によって開拓されました。1以来、いくつかのラボは、頻繁に採血と様々 な実験パラダイムの拍動性の LH 分泌を評価する超高感度の LH アッセイを利用し始めています。5,6,7,8,9に留意は道に沿って作った複数の改良と、少なくとも 40 年10に対して進行中のマウスから複数の血液サンプルを集めることの実用的な方法の追求がされていること。11,12
LH パルス パターン (すなわち周波数、振幅) の評価は、この遺伝的扱いの動物モデルの基底のゴナドトロピン分泌の監視の主要な改良を表します。従来、単一の血液サンプルにマウスで LH 濃度を測定しました。シングル ポイントのサンプルの 1 つの弱点は、LH 濃度は、当然のことながら各パルス中に変動非常に可変データ セット。もう一つの弱点は、孤立した測定は本質的に lh パルスのパターンによって伝えられる重要な情報を逃すことです。したがって、自由行動下で頻繁に血液サンプルを集めるための方法、気ままなマウス (サンプリング中に穏やかな処理) を除いて、拡張情報を提供し、有用性拍動性ホルモンの規則を調べる多くの研究所を。
ここでは、頻繁のコレクションのためのプロトコルについて述べる (6 分毎) 血液サンプル目を覚まし、気ままなマウスから。重要なは、我々 は、処理を含める全血試料中の拍動の LH 分泌の堅牢で連続検出は、事前および事後評価急性チャレンジにする時間の長さを決定することができますで収集できる順化プロトコルなど固定化と抑制の心理社会的ストレスに対する応答です。全血中 LH 濃度の効果的なアッセイが以前に記載されています。1この議定書は LH パルス測定のための血液サンプルを集めるための方法に焦点を当てた。
Protocol
Representative Results
Discussion
ここで全血尻尾先端サンプル マウスの拍動の LH 分泌の評価のための頻繁に血のコレクションのためのプロトコルについて述べる。このプロトコルは、心理社会的ストレスへの暴露に続く拍動の LH 分泌の急性変化の検出のためのサンプルの収集を有効し、LH パルスの他の急性または慢性の操作の評価に適しています。
このプロトコル LH パルスの信頼性と堅牢性のプロフ?…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
著者は、夫妻ジェニファー ヤンとアレクサンダー (サーシャ) カウフマンの多くの有用な重要な議論と同様に、この手法でテクニカル サポートをありがとうございます。血清ホルモン アッセイは、再現リガンド アッセイ研究解析コア、ユーニス · ケネディ · シュライバー NICHD/NIH (NCTRI) グラント P50 HD28934 によってサポートされているヴァージニアの大学センターで 2017 ヤンら、によって行われました。
研究支援の源: R01 NICHD 86100 (巴)、RBM T32 NICHD 007203 によって支えられました。
Materials
| Biosaftey cabinet | Lab Products Inc | L/F-B | |
| Bovine serum albumin | Sigma | A5403 | |
| Tween-20 | Sigma | P2287 | |
| KCl | Sigma | P9333 | |
| NaCl | Sigma | S7653 | |
| Na2HPO4 (anhydrous) | Sigma | S7907 | |
| KH2PO4 | Sigma | P5655 | |
| Ultrapure water | Millipore | Purified and filtered water | |
| Broome Rodent Restraint Device | Harvard Apparatus | 52-0460 | Not necessary for blood collection, but were used in the collection of representative data. |
| DynPeak | n/a | n/a | http://journals.plos.org/plosone/article?id=10.1371/journal.pone.0039001 |
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