Häufige Schwanzspitze Blutabnahme bei Mäusen zur Beurteilung der pulsierender Luteinisierendes Hormon-Sekretion
Summary
Hier präsentieren wir ein Schwanzspitze Blut-Probenahme-Protokoll für häufige Musterkollektion in hemmungslose Mäuse. Diese Methode ist nützlich für die Beurteilung der Muster der pulsierender Luteinisierendes Hormon-Sekretion und könnte für die Analyse von anderen zirkulierenden Faktoren angepasst werden.
Abstract
In vielen Hormonsystem zirkulierende Faktoren oder Hormone werden nicht kontinuierlich freigesetzt, aber als diskrete Impuls als Reaktion auf ein Releasing-Faktor sezerniert werden. Einpunkt-Probenahme Maßnahmen ausreichen, um die biologische Bedeutung der sekretorischen Muster von pulsierender Hormonen unter normalen physiologischen Bedingungen oder bei Dysregulation verstehen. Luteinisierendes Hormon (LH) ist durch den vorderen Hypophyse Gonadotrope Zellen synthetisiert und abgesondert in eine pulsierende Muster, die häufige Sammlung von Blutproben für Puls Beurteilung erfordert. Dies ist nicht möglich bei Mäusen bis vor kurzem durch die Entwicklung eines hochempfindliche LH Assays gewesen und Fortschritt in der Technik für die häufigen leise Musterkollektion, zunächst von Steyn und Kollegen beschrieben. 1 hier beschreiben wir ein Protokoll für die Probeentnahme häufige peripherem Blut von Mäusen mit ausreichend Umgang mit Akklimatisation pulsatile Sekretion von LH zu erkennen. Das aktuelle Protokoll beschreibt eine erweiterte Eingewöhnungszeit, die Beurteilung der robusten und kontinuierliche Impulse von LH über mehrere Stunden ermöglicht. In diesem Protokoll die Schwanzspitze wird abgeschnitten und Blut wird aus der Rute mit einer handgeführten Pipette gesammelt. Für die Beurteilung der pulsatile LH bei Gonadectomized Mäusen, serielle Proben sind gesammelt alle 5-6 Minuten für 90-180 min. wichtiger ist, die Ansammlung von Blut und Messung der robuste Impulse von LH in wach, frei Verhalten Mäusen gegeben angemessenen Umgang mit erreicht werden können Akklimatisierung und um Umweltstressfaktoren zu minimieren. Ausreichende Akklimatisierung kann innerhalb von 4 bis 5 Wochen vor der Blutentnahme erreicht werden. Dieses Protokoll zeigt Fortschritte in der Methodik zu Vollblut Probenahmen zur Beurteilung der pulsatile LH-Sekretion Muster über mehrere Stunden in der Maus, eine mächtige Tiermodell für neuroendokrine Forschung zu gewährleisten.
Introduction
Gonade Funktion bei Säugetieren ist abhängig von Gonadotropin-Sekretion, Luteinisierendes Hormon (LH) und Follikel-stimulierendes Hormon aus der Hypophyse. Die Gonadotropine werden in entweder ein pulsierender oder Welle Muster als Reaktion auf hypothalamische Sekretion von Gonadotropin – Releasing Hormon (GnRH) abgesondert. Die Synthese und Sekretion von LH und FSH sind durch endokrine, Parakrine und Autokrine handeln aus einer Vielzahl von Molekülen einschließlich Hypothalamus GnRH, Gonaden Steroidhormone und Activin Inhibin Follistatin-System sowie eine Vielzahl von geregelt. physiologischen Bedingungen einschließlich Stress und Energiebilanz. 2
Das pulsierende Muster von LH im Blut entspringt eher plötzliche Entlastung von LH in peripherem Blut, gefolgt von ungefähr exponentiellen Beseitigung. Wichtige Merkmale des Musters die Frequenz jeder LH-Entleerung und die Amplitude der LH Antwort sind, sind beide, teilweise durch die Freisetzung von GnRH gebührend zu Schwierigkeiten bei der Hypothalamus-Hypophysen Portal Blutentnahme zur Messung von diktiert pulsatile GnRH, Probenahme und Messung von LH dient als Proxy für GnRH Verordnung der Hypothalamus-Hypophysen-Gonaden-Achse. Daher wird kritische Information kodiert in Frequenz und Amplitude der LH Impulse, die aus einer einzigen Probe nicht ermittelt werden kann.
Analyse der pulsatile LH-Sekretion seit jeher auf große Säugetiere (Schafe, Menschen und Primaten) aufgrund ihrer großen Blutvolumen und Toleranz für die häufige Blutentnahme Probe beschränkt. Bei Nagetieren häufige Blutentnahme beschränkte sich auf die Ratte und erreicht über Innewohnung Vorhofflimmern Katheter. 3 , 4 die relativ niedrigen Kosten und Verfügbarkeit von genetischen (z. B. Cre-Lox, CRISPR) und komplexen neuronalen Schaltung (z.B. optogenetik, Chemogenetics) Manipulationen machen Mäuse ein attraktives Modellorganismus; jedoch erreichen von häufigen Blutproben und anschließende Analyse der LH-Konzentrationen bis vor kurzem schwer fassbaren bewährt. Diese gewaltige Aufgabe wurde erstmals von Steyn und Mitarbeitern. 1 , da dann mehrere Labore haben damit begonnen, häufige Blutentnahme und ultra-sensitive LH-Assays einzuschätzen pulsatile LH-Sekretion in einer Vielzahl von experimentellen Paradigmen zu nutzen. 5 , 6 , 7 , 8 , 9 es sei darauf hingewiesen, dass das Streben nach einer praktischen Methode des Sammelns mehrere Blutproben von Mäusen für mindestens 40 Jahre10 mit mehreren Verbesserungen auf den Weg machte ausgeführt wurde. 11 , 12
Bewertung des LH Pulsmuster (d. h. Frequenz und Amplitude) stellt eine wichtige Verfeinerung bei der Überwachung der basalen Gonadotropin-Sekretion in dieser genetisch gefügig Tiermodell. Traditionell wurden die LH-Konzentrationen in den Mäusen in einer einzigen Blutprobe bestimmt. Eine Schwäche des Einpunkt-Proben ist ein sehr variabel Datensatz weil LH-Konzentrationen sind natürlich bei jedem Impuls schwankt. Eine weitere Schwäche ist, dass isolierte Messungen von Natur aus wichtige Informationen vermittelt durch die Muster des LH-Puls-Sekretion verpassen. So eine Methode zum Sammeln von häufigen Blutproben in frei verhält, hemmungslose Mäuse (außer schonender Umgang während der Probenahme) Erweiterte Informationen und für viele Labors untersucht pulsatile Hormon Verordnung als nützlich erweisen.
Wir beschreiben hier, ein Protokoll für die Sammlung von häufigen (alle 6 min) Blutproben von wach, hemmungslose Mäuse. Wichtig ist, sind wir ein Handling Akklimatisation Protokoll, das ermöglicht eine stabile und kontinuierliche Erkennung der pulsatile LH-Sekretion in Vollblut-Proben eine Länge der Zeit, in der Pre- und Post-Beurteilung auf eine akute Herausforderung bestimmt werden kann gesammelt, wie die Antwort auf die psychosozialen Belastung der Immobilisierung und Zurückhaltung. Ein effektive Assay für die LH-Konzentrationen von Vollblut-Proben wurde zuvor beschrieben; 1 dieses Protokoll auf eine Methode zur Erfassung der Blutproben für LH Pulsmessung ausgerichtet ist.
Protocol
Representative Results
Discussion
Hier beschreiben wir ein Protokoll für die häufige Blutentnahme Vollblut Schwanzspitze Proben für die Bewertung der pulsatile LH-Sekretion in den Mäusen. Dieses Protokoll ermöglicht die Entnahme von Proben für die Erkennung von akuten Veränderungen in pulsatile LH-Sekretion nach Exposition gegenüber psychosozialer Stress und eignet sich gut zur Beurteilung der LH Impulse unter anderen akuten oder chronischen Manipulationen.
Ein wesentlicher Bestandteil dieses Protokolls für zuverläss…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Die Autoren danken Dr. Jennifer Yang und Alexander (Sasha) Kauffman technische Unterstützung für diese Technik sowie zahlreiche hilfreiche und kritische Diskussionen. Serum-Hormon-Assays wurden von Yang Et Al., 2017 an die University of Virginia Center for Research in Reproduktion Liganden Assay und Analyse-Kern, unterstützt von Eunice Kennedy Shriver NICHD/NIH (NCTRI) Grant P50-HD28934 durchgeführt.
Quellen der Forschungsförderung: R01 NICHD 86100 (KMB), RBM von T32 NICHD 007203 unterstützt wurde.
Materials
| Biosaftey cabinet | Lab Products Inc | L/F-B | |
| Bovine serum albumin | Sigma | A5403 | |
| Tween-20 | Sigma | P2287 | |
| KCl | Sigma | P9333 | |
| NaCl | Sigma | S7653 | |
| Na2HPO4 (anhydrous) | Sigma | S7907 | |
| KH2PO4 | Sigma | P5655 | |
| Ultrapure water | Millipore | Purified and filtered water | |
| Broome Rodent Restraint Device | Harvard Apparatus | 52-0460 | Not necessary for blood collection, but were used in the collection of representative data. |
| DynPeak | n/a | n/a | http://journals.plos.org/plosone/article?id=10.1371/journal.pone.0039001 |
References
- Steyn, F. J., et al. Development of a methodology for and assessment of pulsatile luteinizing hormone secretion in juvenile and adult male mice. Endocrinology. 154 (12), 4939-4945 (2013).
- McArdle, C. A., Roberson, M. S., Plant, T. M., Zeleznik, A. J. . Knobil and Neill’s Physiology of Reproduction. , (2015).
- Parasuraman, S., Raveendran, R., Kesavan, R. Blood sample collection in small laboratory animals. Journal of Pharmacology and Pharmacotherapy. 1 (2), 87-93 (2010).
- Steiner, R. A., Bremner, W. J., Clifton, D. K. Regulation of luteinizing hormone pulse frequency and amplitude by testosterone in the adult male rat. Endocrinology. 111 (6), 2055-2061 (1982).
- Moore, A. M., Prescott, M., Marshall, C. J., Yip, S. H., Campbell, R. E. Enhancement of a robust arcuate GABAergic input to gonadotropin-releasing hormone neurons in a model of polycystic ovarian syndrome. Proceedings of National Academy of Science U S A. 112 (2), 596-601 (2015).
- Czieselsky, K., et al. Pulse and Surge Profiles of Luteinizing Hormone Secretion in the Mouse. Endocrinology. 157 (12), 4794-4802 (2016).
- Campos, P., Herbison, A. E. Optogenetic activation of GnRH neurons reveals minimal requirements for pulsatile luteinizing hormone secretion. Proceedings of National Academy of Science U S A. 111 (51), 18387-18392 (2014).
- Yang, J. A., et al. Acute Psychosocial Stress Inhibits LH Pulsatility and Kiss1 Neuronal Activation in Female Mice. Endocrinology. 158 (11), 3716-3723 (2017).
- Clarkson, J., et al. Definition of the hypothalamic GnRH pulse generator in mice. Proceedings of National Academy of Science U S A. 114 (47), E10216-E10223 (2017).
- Lewis, V. J., Thacker, W. L., Mitchell, S. H., Baer, G. M. A new technic for obtaining blood from mice. Laboratory Animal Science. 26 (2 Pt 1), 211-213 (1976).
- Abatan, O. I., Welch, K. B., Nemzek, J. A. Evaluation of saphenous venipuncture and modified tail-clip blood collection in mice. Journal of the American Association of Laboratory Animal Science. 47 (3), 8-15 (2008).
- Durschlag, M., Wurbel, H., Stauffacher, M., Von Holst, D. Repeated blood collection in the laboratory mouse by tail incision–modification of an old technique. Physiology and Behavior. 60 (6), 1565-1568 (1996).
- Goodman, R. L., Karsch, F. J. Pulsatile secretion of luteinizing hormone: differential suppression by ovarian steroids. Endocrinology. 107 (5), 1286-1290 (1980).
- Clarke, I. J., Cummins, J. T. Increased gonadotropin-releasing hormone pulse frequency associated with estrogen-induced luteinizing hormone surges in ovariectomized ewes. Endocrinology. 116 (6), 2376-2383 (1985).
- Vidal, A., Zhang, Q., Medigue, C., Fabre, S., Clement, F. DynPeak: an algorithm for pulse detection and frequency analysis in hormonal time series. PLoS One. 7 (7), e39001 (2012).
- Merriam, G. R., Wachter, K. W. Algorithms for the study of episodic hormone secretion. American Journal of Physiology. 243 (4), E310-E318 (1982).
- Xie, T. Y., et al. Effect of Deletion of Ghrelin-O-Acyltransferase on the Pulsatile Release of Growth Hormone in Mice. Journal of Neuroendocrinology. 27 (12), 872-886 (2015).
- Koch, C. E., Leinweber, B., Drengberg, B. C., Blaum, C., Oster, H. Interaction between circadian rhythms and stress. Neurobiology of Stress. 6, 57-67 (2017).
- Tuli, J. S., Smith, J. A., Morton, D. B. Corticosterone, adrenal and spleen weight in mice after tail bleeding, and its effect on nearby animals. Laboratory Animal. 29 (1), 90-95 (1995).
- . Animal Welfare Inspection Guide Available from: https://www.aphis.usda.gov/animal_welfare/downloads/Animal-Care-Inspection-Guide.pdf (2017)
- Steyn, F. J., et al. Development of a method for the determination of pulsatile growth hormone secretion in mice. Endocrinology. 152 (8), 3165-3171 (2011).
