كثرة أخذ عينات الدم الذيل-نصيحة في الفئران للتقييم لإفراز الهرمون نابض
Summary
نقدم هنا بروتوكول أخذ عينات دم الذيل-نصيحة لجمع العينات متكررة في الفئران غير المقيد. هذا الأسلوب مفيداً لتقييم أنماط من إفراز الهرمون نابض ويمكن تكييفه لتحليل للعوامل الأخرى المتداولة.
Abstract
في العديد من أجهزة الغدد الصماء، تعميم العوامل أو الهرمونات لا يتم إصدارها بشكل مستمر، ولكن يتم ويفرز كنبض منفصلة في استجابة لعامل الإفراج. إجراءات أخذ العينات نقطة واحدة لا تكفي لنفهم تماما أهمية نمط الافرازية نابض الهرمونات أما في الظروف الفسيولوجية العادية أو أثناء ظروف التقلبات البيولوجية. الهرمون (LH) هو توليفها من قبل الخلايا جونادوتروبي الغدة النخامية الأمامية ويفرز في نمط نابض مما يتطلب كثرة جمع عينات الدم لتقييم النبض. هذا لم يكن ممكناً في الفئران حتى الآونة الأخيرة، نتيجة لتطور مقايسة LH حساسية عالية ووتيرة النهوض في تقنية لجمع عينة صغيرة الحجم، وفي البداية وصف ستاين والزملاء. 1 هنا يمكننا وصف بروتوكول لجمع عينة الدم المحيطي متكررة من الفئران مع تأقلم معالجة كافية للكشف عن إفراز LH نابض. تفاصيل البروتوكول الحالي فترة تأقلم موسعة التي تتيح تقييم لنبضات قوية ومستمرة من ناحية اليسار على مدى ساعات عدة. في هذا البروتوكول، ويتم قص غيض الذيل ويتم جمع الدم من الذيل باستخدام ماصة اليد. لتقييم LH نابض في الفئران جوناديكتوميزيد، المسلسل عينات جمعت كل دقيقة 5-6 ل 90-180 دقيقة الأهم من ذلك، يمكن أن يتم جمع الدم وقياس نبضات قوية من ناحية اليسار في الفئران مستيقظا، ويتصرف بحرية، نظراً لمعالجة كافية التأقلم والجهود المبذولة للحد من الإجهاد البيئي. تأقلم كافية يمكن أن يتحقق في غضون 4-5 أسابيع قبل جمع الدم. ويبرز هذا البروتوكول السلف في منهجية لضمان جمع عينات الدم كله لتقييم الأنماط إفراز LH نابض على مدى ساعات عدة في الماوس، نموذج حيوان قوية لأبحاث الغدد الصم العصبية.
Introduction
وظيفة الغدد التناسلية في الثدييات متوقفاً على إفراز تروج والهرمون (LH) والهرمون من الغدة النخامية جريب. هي يفرز gonadotropins أما نمط نابض أو الطفرة في الاستجابة لإفراز طائي تروج – الإفراج عن هرمون (GnRH). التوليف وإفراز LH و FSH وينظم عن طريق عمل الغدد الصماء، وباراكريني، وأوتوكريني من مجموعة متنوعة من الجزيئات بما فيها جنره طائي، وهرمونات الستيرويد جوندال، والنظام أضافت-إينهيبين-فوليستاتين، فضلا عن عدد وافر من الظروف الفسيولوجية بما في ذلك توازن الطاقة والإجهاد. 2
نمط نابض LH في الدم ينشأ من إبراء ذمة مفاجئ نوعا من LH في الدم المحيطي، تليها نحو أسي القضاء. هامة تتضمن الميزات نمط تكرار كل تفريغ LH والسعة للاستجابة LH، سواء منها التي تمليها، جزئيا، الإفراج عن جنره. الواجب إلى الصعوبة في جمع الدم طائي النخامية المدخل لقياس جنره نابض، أخذ العينات وقياس LH كوكيل للائحة جنره المحور طائي جوندال الغدة النخامية. ولذلك، يتم ترميز المعلومات الحاسمة في التردد والسعة من البقول LH، الذي لا يمكن تحديده من عينة واحدة.
تحليل لإفراز LH نابض تاريخيا محدودة للثدييات الكبيرة (البشر والقرود والأغنام) نظراً لحجم كبير من الدم والتسامح لجمع عينة الدم المتكرر. في القوارض، أخذ عينات من الدم المتكرر تقتصر على الفئران ويتحقق عن طريق سكني القسطرة أذينية. 3 , 4 بتكلفة منخفضة نسبيا وتوافر الوراثية (مثل لجنة المساواة العرقية-لوكس، كريسبر) والتلاعب الدارة العصبية المعقدة (مثل أوبتوجينيتيكس، تشيموجينيتيكس) جعل الفئران كائن نموذج جذاب؛ ومع ذلك، تحقيق عينات الدم المتكررة والتحليل اللاحق لتركيزات LH حتى مؤخرا، أثبت بعيد المنال. كان رائدا في هذه المهمة الضخمة ستاين وزملاء العمل. وقد بدأت 1 منذ ذلك الحين، عدد من معامل الاستفادة من أخذ عينات من الدم المتكررة وفحوصات LH فائقة الحساسية لتقييم إفراز LH نابض في مجموعة متنوعة من النماذج التجريبية. 5 , 6 , 7 , 8 , 9 تجدر بالسعي إلى طريقة عملية لجمع عينات الدم متعددة من الفئران في التقدم لمالا يقل عن 40 سنة10 مع التحسينات المتعددة المقدمة على طول الطريق. 11 , 12
يمثل تقييم أنماط نبض LH (أي من التردد والسعة) صقل كبرى في رصد إفراز تروج القاعدية في هذا النموذج الحيواني يستهدف وراثيا. تقليديا، تم تحديد تركيزات LH في الفئران في عينة دم واحدة. إحدى نقاط الضعف لعينات نقطة واحدة مجموعة البيانات اختلافاً كبيرا نظراً لأن تركيزات LH بطبيعة الحال متقلبة خلال كل نبضة. ضعف آخر وأن القياسات المعزولة أصلاً افتقد المعلومات الحاسمة التي تنقلها إلى أنماط إفراز LH نبض. وهكذا، طريقة لجمع عينات الدم المتكرر في التصرف بحرية، الفئران غير المقيد (باستثناء معالجة لطيف أثناء أخذ العينات) ستوفر معلومات معززة وتكون مفيدة للعديد من مختبرات التحقيق في تنظيم هرمون نابض.
هنا، يمكننا وصف بروتوكول لجمع متكررة (كل دقيقة 6) الدم عينات من الفئران مستيقظا، غير المقيد. الأهم من ذلك، أننا تشتمل التعامل مع تأقلم البروتوكول الذي يسمح بالكشف عن القوى والمستمر لإفراز LH نابض في عينات الدم كله جمعت على مدى يمكن تحديد طول الوقت الذي ما قبل وما بعد التقييم التحدي حاد، مثل الاستجابة للإجهاد النفسي والاجتماعي لتجميد وضبط النفس. وقد وصفت مقايسة فعال لتركيزات LH من عينات الدم كله سابقا؛ 1 هذا البروتوكول وتركز على أسلوب لجمع عينات الدم لقياس نبض LH.
Protocol
Representative Results
Discussion
هنا يصف لنا وضع بروتوكول لجمع الدم المتكرر لعينات الدم كل طرف الذيل للتقييم لإفراز LH نابض في الفئران. هذا البروتوكول يتيح جمع العينات للكشف عن التغيرات الحادة في إفراز LH نابض عقب التعرض للإجهاد النفسي ومناسبة تماما لتقييم البقول LH تحت الأخرى التلاعب الحاد أو المزمن.
من عناص…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
يشكر المؤلفون الدكتور جنيفر يانغ وكوفمان ألكسندر (ساشا) لتقديم المساعدة التقنية مع هذا الأسلوب، فضلا عن العديد من المناقشات المفيدة والهامة. وأجريت فحوصات هرمون مصل حسب يانغ et al.، 2017 في “جامعة فيرجينيا” مركز للبحوث في الاستنساخ يجند الفحص والتحليل الأساسية، وتؤيد بمنحه يونيس كينيدي شرايفر NICHD/المعاهد الوطنية للصحة (نكتري) P50-HD28934.
مصادر لدعم البحوث: 86100 NICHD R01 (كمب)، والإدارة القائمة على النتائج وأيده T32 NICHD 007203.
Materials
| Biosaftey cabinet | Lab Products Inc | L/F-B | |
| Bovine serum albumin | Sigma | A5403 | |
| Tween-20 | Sigma | P2287 | |
| KCl | Sigma | P9333 | |
| NaCl | Sigma | S7653 | |
| Na2HPO4 (anhydrous) | Sigma | S7907 | |
| KH2PO4 | Sigma | P5655 | |
| Ultrapure water | Millipore | Purified and filtered water | |
| Broome Rodent Restraint Device | Harvard Apparatus | 52-0460 | Not necessary for blood collection, but were used in the collection of representative data. |
| DynPeak | n/a | n/a | http://journals.plos.org/plosone/article?id=10.1371/journal.pone.0039001 |
References
- Steyn, F. J., et al. Development of a methodology for and assessment of pulsatile luteinizing hormone secretion in juvenile and adult male mice. Endocrinology. 154 (12), 4939-4945 (2013).
- McArdle, C. A., Roberson, M. S., Plant, T. M., Zeleznik, A. J. . Knobil and Neill’s Physiology of Reproduction. , (2015).
- Parasuraman, S., Raveendran, R., Kesavan, R. Blood sample collection in small laboratory animals. Journal of Pharmacology and Pharmacotherapy. 1 (2), 87-93 (2010).
- Steiner, R. A., Bremner, W. J., Clifton, D. K. Regulation of luteinizing hormone pulse frequency and amplitude by testosterone in the adult male rat. Endocrinology. 111 (6), 2055-2061 (1982).
- Moore, A. M., Prescott, M., Marshall, C. J., Yip, S. H., Campbell, R. E. Enhancement of a robust arcuate GABAergic input to gonadotropin-releasing hormone neurons in a model of polycystic ovarian syndrome. Proceedings of National Academy of Science U S A. 112 (2), 596-601 (2015).
- Czieselsky, K., et al. Pulse and Surge Profiles of Luteinizing Hormone Secretion in the Mouse. Endocrinology. 157 (12), 4794-4802 (2016).
- Campos, P., Herbison, A. E. Optogenetic activation of GnRH neurons reveals minimal requirements for pulsatile luteinizing hormone secretion. Proceedings of National Academy of Science U S A. 111 (51), 18387-18392 (2014).
- Yang, J. A., et al. Acute Psychosocial Stress Inhibits LH Pulsatility and Kiss1 Neuronal Activation in Female Mice. Endocrinology. 158 (11), 3716-3723 (2017).
- Clarkson, J., et al. Definition of the hypothalamic GnRH pulse generator in mice. Proceedings of National Academy of Science U S A. 114 (47), E10216-E10223 (2017).
- Lewis, V. J., Thacker, W. L., Mitchell, S. H., Baer, G. M. A new technic for obtaining blood from mice. Laboratory Animal Science. 26 (2 Pt 1), 211-213 (1976).
- Abatan, O. I., Welch, K. B., Nemzek, J. A. Evaluation of saphenous venipuncture and modified tail-clip blood collection in mice. Journal of the American Association of Laboratory Animal Science. 47 (3), 8-15 (2008).
- Durschlag, M., Wurbel, H., Stauffacher, M., Von Holst, D. Repeated blood collection in the laboratory mouse by tail incision–modification of an old technique. Physiology and Behavior. 60 (6), 1565-1568 (1996).
- Goodman, R. L., Karsch, F. J. Pulsatile secretion of luteinizing hormone: differential suppression by ovarian steroids. Endocrinology. 107 (5), 1286-1290 (1980).
- Clarke, I. J., Cummins, J. T. Increased gonadotropin-releasing hormone pulse frequency associated with estrogen-induced luteinizing hormone surges in ovariectomized ewes. Endocrinology. 116 (6), 2376-2383 (1985).
- Vidal, A., Zhang, Q., Medigue, C., Fabre, S., Clement, F. DynPeak: an algorithm for pulse detection and frequency analysis in hormonal time series. PLoS One. 7 (7), e39001 (2012).
- Merriam, G. R., Wachter, K. W. Algorithms for the study of episodic hormone secretion. American Journal of Physiology. 243 (4), E310-E318 (1982).
- Xie, T. Y., et al. Effect of Deletion of Ghrelin-O-Acyltransferase on the Pulsatile Release of Growth Hormone in Mice. Journal of Neuroendocrinology. 27 (12), 872-886 (2015).
- Koch, C. E., Leinweber, B., Drengberg, B. C., Blaum, C., Oster, H. Interaction between circadian rhythms and stress. Neurobiology of Stress. 6, 57-67 (2017).
- Tuli, J. S., Smith, J. A., Morton, D. B. Corticosterone, adrenal and spleen weight in mice after tail bleeding, and its effect on nearby animals. Laboratory Animal. 29 (1), 90-95 (1995).
- . Animal Welfare Inspection Guide Available from: https://www.aphis.usda.gov/animal_welfare/downloads/Animal-Care-Inspection-Guide.pdf (2017)
- Steyn, F. J., et al. Development of a method for the determination of pulsatile growth hormone secretion in mice. Endocrinology. 152 (8), 3165-3171 (2011).
