Рассечение Enhancer функции мультиплексной основанный ТРИФОСФАТЫ Enhancer вмешательства в клеточных линиях

1. поколение клеток линии стабильно выражения SID4X-dCas9-краб Примечание: Трансфекции условий и концентрации наркотиков, представленные здесь были оптимизированы для клеток Исикава, на линию клеток рака эндометрия, выращенных в СМИ RPMI 1640 с 10% FBS и 1% пенициллина/стрептомицина (полная RPMI). Другие клеточные линии может потребовать различных трансфекции условий и концентрации наркотиков. Пользователи также могут выполнять переходные трансфекции эксперименты в одичал тип клеток, вместо создания стабильной клеток линии, с плазмида, выражая SID4X-dCas9-KRAB наряду с руководство РНК, выражая плазмиды; Однако результаты от переходных transfections может быть сложно воспроизвести, как SID4X-dCas9-KRAB уровни могут различаться по transfection. Пластина Исикава клетки в по крайней мере 2 скважин 6-ну пластины при впадении (приблизительно 300.000 Исикава клетки) 30-50% в 3 мл полной RPMI. Аспирационная СМИ из клеток. Вымойте клетки один раз с ПБС (рН 7,4). Аспирационная PBS и добавить трипсина (4 мл на 10 см блюдо или 5 мл раствора для в T-75 колбу). Инкубируйте клетки ~ 5 минут при 37 ° C, проверяя каждые 2 мин, для отдельных ячеек и слегка покачивая судна. После того, как клетки отдельный, Пипетка trypsinized клетки вверх и вниз несколько раз и пипетки нежно вниз стороне корабля освободить любые вложенные ячейки. Клетки перехода к 15 мл Конические трубки и спина клетки вниз на 5 мин на 250 x g. Аспирационная трипсина и Ресуспензируйте клетки в 5-10 мл средства массовой информации. Используйте пипетку P1000 не присоединяться скопления клеток, при необходимости. Подсчитать количество ячеек и определить объем необходимых для пластины ~ 300 000 ячеек на Ну в общем объеме 3 мл. Добавьте клетки 2 отдельных скважин 6-ну плиты. Заполните каждый хорошо для 3 мл с полным RPMI. Осторожно встряхните пластину каждые 5 минут в первые 15 мин после покрытия для обеспечения что клетки равномерно распределены на плите. Используйте Микроскоп чтобы убедиться, что клетки разошлись с середины колодца. В течение 24 ч обшивки выполните следующие transfections, используя соответствующие трансфекции реагент для линии клетки интереса. Для Исикава ячеек используйте процедуру, как описано ниже.Примечание: Этот протокол предполагает использование катионных на основе липосом трансфекции реагентов. Электропорация предоставляет альтернативный метод для типов клеток, которые очень чувствительны к эти реагенты или что экспонат низкого трансфекции эффективность с липофекция. Трансфекция условия должны быть оптимизированы для линии клетки интереса перед Enhancer-i экспериментов. В 1,7 мл трубки Эппендорф, разбавляют 2,5 мкг SID4X-dCas9-KRAB плазмиды и 800 нг плазмида, выражая флуоресцентного белка в сыворотке свободных средств массовой информации, такие, что окончательный объем в трубе-155 мкл и конечная концентрация плазмида 0,020 мкг/мкл. В другой трубки разбавляют 3,3 мкг плазмиды, которые не содержат неомицин сопротивления кассету, например pCMV-GFP, в сыворотке свободных средств массовой информации таким образом, что окончательный объем в трубе-155 мкл и конечная концентрация плазмида 0,020 мкг/мкл. Вихревой каждая трубка кратко и спин вниз с помощью отцентрифугировать. Мкл 9.9 трансфекции реагента (Таблица материалов) к каждой трубе. Смешайте vortexing кратко на низкой скорости. Спин трубы вниз с отцентрифугировать. Инкубируйте трубы при комнатной температуре по крайней мере 5 минут, но не более 20 мин. В области биобезопасности кабинета добавьте 150 мкл смеси подготовлены ДНК: Реагент каплям один колодец на пластину 6-хорошо. Повторите для другой трубки подготовленных ДНК: Реагент микс. Mix плиты закрученного мягко и возвращение пластину в инкубаторе. В день 2 пост трансфекции изменить СМИ и дополнить с G418 до конечной концентрации 600 нг/мкл. Эта концентрация может должны быть оптимизированы для типа ячейки. Измените полное RPMI СМИ и дополнить с G418 каждый день в течение 2-4 недель до управления transfected клеток мертвых и скважин, содержащие SID4X-dCas9-KRAB стать вырожденная. Точное количество времени, необходимое для клеток для восстановления будет зависеть от время удвоения клеток. Когда клетки становятся вырожденная, проход к T-25 или T-75 судно в полный RPMI с низкой дозы G418 (300 нг/мкл для Исикава клетки). Во время этого отрывка сделайте 2 аликвоты ~ 100000 клеток каждого (примерно 1/10й 6-ну плиты) в 2 отдельных 1,7 мл пробирок Эппендорф для изоляции РНК и ДНК, соответственно. Спиновые эти трубы вниз (5 мин., 250 x g), удалите трипсина, закупорить и замораживания труб при-20 ° C для использования в будущем. Изолировать геномной ДНК, используя имеющиеся наборы и выполнять ПЦР, используя «pAC95_PCR» или «SID4X_PCR» грунтовки (Таблица 1) для проверки наличия синтез белка в в линии клеток. Используйте в качестве позитивного управления геномной ДНК, извлеченные из родительской строки как отрицательный контроль и SID4x-dCas9-KRAB плазмида ДНК. Используйте мастер смесь высокой верности полимеразы с 50-100 нг геномной ДНК и следующих условий Велоспорт: 98 ° C за 30 сек, 25 циклов (98 ° C 10 s, 58 ° C за 30 s, 72 ° C на 2 мин), 72 ° C за 5 мин , удерживайте при 4 ° C. Чтобы проверить выражение синтез белка на уровне РНК, выполните ПЦР РНК, извлеченные из строки ячейки, используя коммерчески доступные наборы. Использование «dCas9_qPCR» грунтовки (Таблица 1) и протокол ПЦР Одношаговая, заданное на шаге 6.3 настоящего Протокола. Чтобы проверить выражение уровень протеина сплавливания, выполните западной помарки на лизатов от линии клеток. Использование анти флаг или анти-Ха антитела для обнаружения синтез белка. 2. Руководство РНК дизайн Примечание: Этот протокол разработан для использования с РНК руководство U6, клонирование вектор созданный лабораторией церковь и доступна на Addgene (Addgene 41824). Чтобы создать версию этого вектора, содержащие puromycin сопротивления, что позволило для той же клонирования стратегии как 41824, мы переехали несколько клонирования сайта из этого вектора в вектор pGL3-U6-sgRNA курьер puromycin (Addgene 51133). Addgene 41824 или наша версия с puromycin (Addgene 106404) совместимы с клонирования стратегию, изложенную ниже. Получите basepairs 600-900 последовательности ДНК для каждого нормативной области интереса. Использование сайтов связывания фактор транскрипции и/или хроматина доступность для руководства о том, где для определения области интереса (рисунок 2A).Примечание: Хотя в примере на рисунке 2A усилителей вверх и вниз по течению, это также возможно ориентироваться нормативных элементов, расположенных в пределах интронов. Поместите все последовательности, полученные в один текстовый файл, используя формат FASTA. Определите по крайней мере один отрицательный контроль региона, который, как ожидается, не изменить над экспериментальных условиях, таких как промоутер гена, которое выражается не в линии клетки интереса. Получить последовательность ДНК для этого региона и добавить его в текстовый файл в формате FASTA.Примечание: Мы используем руководство РНК, ориентация IL1RN промоутер25 как отрицательный контроль для всех регионов, которые мы нацелены. Пользователи могут также выбрать intergenic последовательность вблизи региона интерес, которые не содержат сайтов связывания фактор транскрипции как отрицательный контроль. Однако если одновременно являются мишенью нескольких локусов, один отрицательный контроль регион упрощает экспериментальный дизайн и интерпретации результатов. Если целевой усилитель intronic, это может быть полезным для целевого intronic региона в том же локусе, который не содержит элемент предполагаемого регулирования как элемент дополнительные негативные, как dCas9 fusion может вмешиваться в транскрипции. Определите положительный контроль регионов, таких как промоутеров, которые являются предполагаемые цели регулирования областей интереса, или промоутеры из генов, которые высоко транскрибируется в линии клетки интереса. Получить последовательность ДНК для этих регионов и добавить его в текстовый файл в формате FASTA. Используйте такие программы, как e хрустящий26 (http://www.e-crisp.org/E-CRISP/) на последовательности ДНК, чтобы найти руководство РНК с низкой вне целей (в идеале 0-3). Руководство РНК состоит из 20 нуклеотидов, вверх по течению protospacer прилегающие мотив (PAM), которая принимает форму «НЭС» для dCas9 от S. pyogenes. На сайте e хрустящий выберите организм интерес, раскрывающемся меню. Сборка генома появляется справа от имени вида. Установите переключатель Вход — FASTA последовательность . Скопируйте FASTA последовательности от выше и вставить их в диалоговом окне. Убедитесь, что заголовок FASTA включена для каждой последовательности.Примечание: До 50 последовательности можно запрашивать одновременно. В раскрывающемся меню выберите переключатель среднего и единый дизайн . Нажмите кнопку начать поиск sgRNA. Откроется новая вкладка браузера, и результаты будут отображаться. Скачайте кандидат последовательности, нажав на кнопку скачать табличный отчет Excel формате для всех запросов последовательностей вместе. Откройте табличный отчет с помощью Excel или программы для редактирования текста. Используйте UCSC генома браузер БЛАТ кандидат полнометражного gRNA последовательностей (23 basepairs) генома. В браузере перейдите к UCSC генома браузер веб-сайт (http://genome.ucsc.edu). В разделе наши инструментынайдите слова, БЛАТ и нажмите на него. Откроется средство поиска БЛАТ. Используйте раскрывающиеся меню, расположенный под Генома БЛАТ Поиск текста для выбора организма и геном Ассамблеи интереса. Скопируйте руководство РНК последовательности из табличного отчета, порожденных e хрустящий и вставьте их в диалоговом окне. Убедитесь, что каждая последовательность имеет уникальный заголовок FASTA, затем нажмите кнопку Отправить в нижней части диалогового окна.Примечание: До 25 последовательности может рассматриваться одновременно. На странице Результатов поиска БЛАТ появится рядов каждого гида последовательности РНК, с каждой строки, представляющие выравнивание. В идеале должно быть одно выравнивание для каждого руководства РНК, показывающее уникальности этого руководства РНК. Избегайте гиды, которые присоединяются в несколько мест в геноме, если это возможно. Для изучения руководство РНК локализации и распространения в пределах региона интерес, нажмите на ссылку браузера в разделе действия для одного из запрашиваемых руководство РНК. Генома браузер появится и будет сосредоточена на выбранной руководство РНК. Используйте кнопки масштаба в верхней части страницы, для визуализации распределения других руководство РНК выявленных e Крисп в регионе интереса. Выберите 4 желательно non перекроя руководство РНК последовательности, которые распространяются во всем регионе интереса (рис. 2B). Если области интереса превышает 600 bp, рекомендуется добавить 1-2 дополнительные руководства. Избегайте руководство РНК с homopolymeric тянется и экстремальных GC содержание, как эти возможности могут препятствовать руководство РНК, процесс клонирования и уменьшить руководство РНК ориентации эффективности. После того, как были выбраны гиды, создайте файл, содержащий полное руководство РНК последовательности (23 нуклеотидов) для каждого нужного руководства и затем удалите нуклеотидов 5′, а также PAM (НЭС) из 3′ конца. Этот шаг облегчает oligo заказа. Добавить следующую последовательность к 5′ концу последовательности олигонуклеотида: GTGGAAAGGACGAAACACCG. Добавьте следующую последовательность 3′ конца последовательности олигонуклеотида: GTTTTAGAGCTAGAAATAGC.Примечание: Конечной последовательности должны быть 59 нуклеотидов долго и посмотрите как это: GTGGAAAGGACGAAACACCG-цель (19 nt)-GTTTTAGAGCTAGAAATAGC. Убедитесь, что каждый регуляторные элементы быть ориентированы с Enhancer-i имеет по крайней мере 4 уникальных олигонуклеотиды, предназначенные для него. Закажите эти последовательности вместе с «U6_internal» грунтовки, перечисленных в таблице 1. 3. Руководство РНК клонирования Примечание: Руководство РНК клонирования через Ассамблеи Гибсон оказался весьма эффективным в наших руках, приносит сотни колоний на пластину, с несколько если любые колоний в только переносчиками. Такая эффективность имеет решающее значение для поддержания сложности во время клонирования пула. Еще одним преимуществом Гибсон Ассамблеи клонирования является, что пользователям не придется беспокоиться о присутствии энзима ограничения, вырезать сайт в руководстве РНК, они пытаются вставить в вектор клонирования U6. Тем не менее этот протокол может быть адаптирован для традиционных энзима ограничения на основе клонирования при желании. Воссоздания oligos руководство РНК в конечной концентрации 100 мкм в ультрачистая вода (РНКазы, DNase бесплатно). Там должно быть по крайней мере 4 отдельных руководство РНК oligos для каждого региона интерес. Для каждого регулирования региона интерес создайте пул всех oligos, соответствующий области интереса. В трубке Эппендорф объединить 5 мкл каждого индивидуального восстановленный руководство РНК oligo для каждого региона. Mix бассейна хорошо vortexing, а затем удалить 1 мкл и разбавляют этот аликвота 1: 200 в ультрачистая вода.Примечание: При желании эти бассейны ориентации отдельных областей регулирования могут быть далее объединены для создания комплекса бассейн на несколько областей. До 50 нормативных регионы могут быть направлены одновременно в единый пул (рис. 3 c). Выполните короткий ПЦР с праймерами U6 придавать гомологии регионов oligos до Гибсон Ассамблеи. Около 40 баз будет добавляться к каждому oligo, уступая ~ 100 bp продукт, который содержит достаточных гомологичностью к U6 вектора на обоих концах. Для каждого руководства РНК бассейн создан 20 мкл ПЦР с сочетанием высокой верности полимеразы Мастер и следующие компоненты: 1 мкл разбавленного oligo бассейна от шага 3.2, 1 мкл U6 вперед праймера (10 мкм), 1 мкл U6 обратный грунтовка (10 мкм) и воды до 20 мкл. Инкубировать в тепловая велосипедист с соблюдением следующих условий: 98 ° C за 30 сек, 10 циклов (98 ° C 10 s, 55 ° C за 30 s, 72 ° C на 2 мин), 72 ° C за 5 мин и провести на 4 ° C. Запуск 5 мкл реакции на 1-2% агарозном геле с низкой молекулярной массой лестницы. Конечный продукт должен быть ~ 100 basepairs (рис. 2 c). Очистить расширения реакции с набором на основе столбцов очистки ДНК и элюировать в 20 мкл буфера комплекта.Примечание: Как продукт короткий, Избегайте использования основанных на шарик чистой ups, которые призваны исключить небольшие фрагменты, менее чем в 100 bp. Количественно очищенная ДНК с помощью флуориметр или спектрофотометра (ожидается выход составляет 10-20 нг/мкл). Руководство РНК вставок может храниться при температуре-20 ° C, или может быть использован сразу в Ассамблее Гибсон с линеаризованного вектора U6. Чтобы подготовить получателей U6 клонирования вектор для Ассамблеи Гибсон, настройте дайджест энзима ограничения. Если многие реакции Гибсон Ассамблеи должны выполняться, установите несколько дайджесты для обеспечения достаточного урожая отрезока вектора. Используйте 20 единиц AflII фермента и 1 мкг плазмида в 20 мкл реакции с буфером соответствующего энзима ограничения. Инкубируйте при 37 ° C для 1-2 ч. Очистить дайджест с бисером или на основе столбцов комплект для очистки ДНК и элюировать в 20 мкл буфера. Количественно очищенная ДНК с помощью флуориметр или спектрофотометра. Образцы могут быть заморожены при-20 ° C для последующего использования. Гибсон Ассамблеи на подготовленный вектор и вставить. Настройка Гибсон Ассамблеи реакции на льду. Использование 50 ng вектора и 7 ng вставки в 20 мкл реакции. Разбавьте вставки 1:10 в ультрачистая вода для облегчения закупорить. Настройка реакции Ассамблеи только Гибсон вектор, с использованием 50 ng вектора и замена вставки с водой. Инкубировать Гибсон Ассамблеи реакций 15 мин при 50 ° C, а затем провести на 4 ° C. Передачи собранных продуктов на льду. Разбавьте собранных продуктов 1:4 в ультрачистая вода на льду. К примеру добавьте 5 мкл Гибсон Ассамблеи продукта 15 мкл ультрачистая вода. Преобразование разреженных Гибсон сборки продукции. Оттепель сведущие клетки высокой эффективности на льду и сделать 25 мкл аликвоты для каждого преобразования. Если комплекс бассейн на несколько сайтов, оттепель достаточное количество клеток в различных труб для выполнения нескольких независимых преобразований один и тот же комплекс gRNA пул. Для каждого разбавленного продукта добавьте 1 мкл этой разбавления до 1,7 мл Eppendorf трубка, содержащая 25 мкл компетентных клеток. Смешайте кратко стряхивая трубки. Инкубируйте трубы на льду за 30 мин. Тепловой шок клетки для 30 s при 42 ° C, затем немедленно передать в лед на 2 мин. Добавить 300 мкл SOC СМИ (Триптон 2%, 0,5% экстракт дрожжей, 10 мм NaCl, 2,5 мм KCl, 10 мм MgCl глюкозы2, 10 мм MgSO4и 20 мм) и пусть клетки восстановить за 1 ч при 37 ° C при встряхивании (300 об/мин). В это время теплый плиты агара с ампициллин/carbenicillin до 37 ° C в инкубаторе. Используйте одну пластину для каждого преобразования. Пластина 50 мкл клеток и поместите пластины в инкубаторе 37 ° C на ночь. Для бассейнов, ориентации отдельных сайтов непосредственно в 3-5 мл LB отвара (Таблица материалов), содержащий ампициллина/carbenicillin (1 мг/мл) и инкубировать на ночь с встряхивания на 250 об/мин при 37 ° C для minipreps. Урожай клетки и изолировать ДНК. Для больших руководство РНК библиотеки, предназначенные для нескольких сайтов используйте скребок тарелку для сбора всех колоний от каждой индивидуальной пластины в один maxiprep (150 мл жидкого культура). Это может быть облегчено лить ~ 5 мл фунтов с соответствующего антибиотика в 50 мл трубки сокола и выскабливание колоний в трубу. Для библиотеки, предназначенные для отдельных сайтов Очистите пластины в алкалический (3-5 мл жидкого культура). Инкубируйте этих культур с соответствующим антибиотиком для 3-5 ч при 37 ° C с встряхивания на 250 об/мин. Выполните с помощью комплекта, что приводит к свободной эндотоксина парфюмерные экстракции ДНК. Количественно ДНК с помощью флуориметр или спектрофотометра. Плазмиды могут быть использованы непосредственно в трансфекции или температуре-20 ° C для использования в будущем. Чтобы подтвердить присутствие руководство РНК последовательности в рамках U6 вектор для небольших бассейнов ориентации одного сайтов, используйте Сэнгер секвенирования на подготовленный алкалический грунтом «U6_PCR_R» перечислены в таблице 1. За счет объединения руководство РНК, 19 basepair gRNA последовательности даст смешанных баз, но U6 промоутер и руководство РНК леса вокруг этой последовательности должны быть неповрежденными. 4. transfection Enhancer-i Примечание: Для успешной блокады эстроген ответа с помощью Enhancer-i в клетках Исикава, необходимо лишить клетки эстроген для 5-7 дней до трансфекции, поддерживая их в фенола Красного бесплатно RPMI с 10% древесный уголь раздели FBS и 1% пенициллин/стрептомицина. Клетки должны быть культивировали в этой СМИ во время и после трансфекции, если пытаясь блокировать ответ эстрогена. Мы рекомендуем использовать бесплатные трипсина фенола Красного для прохода клеток в полной фенола Красного бесплатно RPMI. За день до трансфекции, плиты клетки (одичал тип или стабильно выражения SID4X-dCas9-KRAB) в 24-ну пластины на 30-50% confluency (~ 60 000 ячеек на колодец для клетки Исикава). Плиты достаточно клетки, что transfections может быть выполнена в двух экземплярах и включают скважин для transfected с руководством управления РНК.  Убедитесь, что ячейки равномерно распределяются между хорошо встряхнув нежно пластины после ячейки покрытия как шаг 1.1.7.Примечание: Этот протокол предполагает использование катионных на основе липосом трансфекции реагентов. Электропорация предоставляет альтернативный метод для типов клеток, которые очень чувствительны к эти реагенты. Трансфекция условия должны быть оптимизированы для линии клетки интереса перед Enhancer-i экспериментов. Следующий день, подготовьте transfections согласно инструкции реагента трансфекции выбора. Для клеток Исикава, использование 550 нг всего плазмиду для каждой скважины 24-ну плиты. Разбавьте плазмид в конечной концентрации 0,020 мкг/мкл в сыворотке свободных СМИ (1,1 мкг ДНК в 52 мкл общего объема для transfecting 2 скважин). Используйте 3 мкл Реагента трансфекции для каждого 1 мкг ДНК, вихрь и инкубировать как описано в шаге 1.2. Добавьте 25 мкл окончательный смеси в каждой скважине.Примечание: Для сочетания целевых сайтов, используйте тот же вес плазмиду для каждого отдельного узла, а затем заполнить оставшиеся вес с управления плазмида (пустой руководство РНК клонирования вектор или руководство РНК, таргетинг на отрицательный контроль регион как IL1RN Промоутер). Для переходных transfections используйте в соотношении 3:2 Cas9 фьюжн: руководство РНК плазмиды. Плазмиды, содержащие флуоресцентные Репортеры могут быть добавлены для мониторинга эффективности transfection. Изменить в 36 h пост трансфекции, средства массовой информации, с помощью фенола Красного бесплатно RPMI с 10% древесный уголь раздели FBS и 1% пенициллина/стрептомицина (для ячеек Исикава) и поставок puromycin (конечная концентрация: 1 мкг/мл) и неомицин (конечная концентрация: 300 нг/мл). Если клетки чувствительны к трансфекции реагента, средства массовой информации могут быть изменены ранее, но антибиотики должны быть добавлены не ранее чем через 24 ч пост transfection.Примечание: Подождите по крайней мере 24 часа после добавления антибиотик до уборки клетки. Выражение изменения вследствие Enhancer-i могут быть обнаружены как рано, как 48 h пост transfection и до 5 дней после transfection. При работе с Исикава клетки, которые были лишены эстрогена, выполнения 8-h 10 Нм 17β-эстрадиола (Е2) индукции на следующий день после лечения антибиотиками и затем сразу же урожай клетки. 5. ячейка урожай и извлечение RNA Подготовьте литического буфера с 1% β-меркаптоэтанол (BME). Убедитесь, что смесь достаточно лизис BME (300 мкл для каждой хорошо собирают). Аспирационная СМИ, с помощью вакуум отсос. Вымыть клетки один раз с равным объемом 1 x PBS (500 мкл) и аспирата удалить столько PBS как можно скорее. Добавьте 300 мкл раствора лизис BME каждой скважины с использованием многоканальные пипетки. Пипетка лизис решение вверх и вниз 8 – 10 раз и перевод на глубокой скважины пластины или 1,7 мл Eppendorf трубки на льду. РНК могут быть получены сразу, или лизатов могут быть заморожены на-80 ° C для последующей обработки. Чтобы извлечь РНК из лизатов, использование коммерчески доступных комплект, который включает в себя DNase лечения. Элюировать минимальный рекомендуемый объем ультрачистая вода (РНКазы, DNase бесплатно) или Элюирующий буфер и количественного определения РНК. Для небольшого числа образцов используйте флуориметр или спектрофотометра. Для большого количества образцов используйте флуоресцентный зонд, который обнаруживает РНК и меру на тарелку читателя. Образцы могут быть заморожены при температуре-80 ° C, до или после количественной оценки. 6. Количественная оценка изменения выражения гена с помощью одношагового ПЦР и РНК seq Получите ПЦР Праймеры для генов интерес и для уборки по крайней мере один ген, который выражается возле уровня целевых генов и не меняется в экспериментальных условиях. В идеале эти грунты охватит Экзон экзона Джанкшен, чтобы избежать амплификацию геномных ДНК. Проверьте эти грунты на РНК, полученных от линии клетки интереса. Использование расплава анализа кривой для проверки производства одного продукта. Если один продукт не производится, тест дополнительным букварь пар. Для каждого Enhancer-i и управления руководство РНК лечение образца определите, сколько гены должны быть assayed в этом образце. Этот набор генов должны включать уборки генов, например CTCF или GAPDH. Настройка реакции ПЦР. Разбавить все образцы же концентрации в воде, что 50 нг всего РНК легко накапаны и есть достаточно разбавленный РНК для каждой реакции. Например разбавляют РНК до ~16.6 нг/мкл и использовать 3 мкл РНК в каждой реакции. Держите РНК на льду при настройке мастер смеси. Подготовьте отдельный мастер смеси для каждого гена измеряется с помощью коммерчески доступных одношаговый ПЦР комплекты. Используйте 20 мкл реакции тома с 1 мкл каждого праймера (10 μM раствор). Настройка этих реакций на льду. В реакции пластина, которая подходит для тепловая велосипедист добавьте образцы РНК, после чего мастер смеси. Печать с sealer пластины и смешайте нежно vortexing или закупорить. Кратко центрифуга пластину (140 x g 60 s) для обеспечения что жидкость находится в нижней части скважины. Инкубировать пластины в тепловой циклователь следующим образом (или как комплект инструктирует): 48 ° C за 30 мин., 95 ° C в течение 10 мин, 40 циклов (95 ° C в течение 15 сек, 60 ° C в течение 1 мин). Получение значения Ct для каждого гена, измеренных в пределах каждого образца. Используйте метод сравнительного Ct для определения изменения в экспрессии генов. Вычтите Ct уборки гена от Ct каждого гена интереса для каждого образца для создания нормализованных значений Ct. Для управления рассматриваются образцы длится в среднем нормализованных значений Ct для каждого гена. Журнал базы 2-масштаба раза репрессий вычисляется путем вычитания нормализованных Enhancer-i рассматривается пример Ct для каждого гена от то же значение для управления рассматривается пример для соответствующего гена. Чтобы определить глобальные изменения в экспрессии генов, после лечения Enhancer-i, подготовьте образцы для последовательности РНК, использование коммерчески доступных комплект совместим с технологией виртуализации пользователя. Использование ~ 500 нг РНК для исходного материала и подготовиться по крайней мере 2 биологических реплицирует библиотек. 7. Проверка конкретных геномной таргетинг по SID4X-dCas9-краб с помощью чип seq Примечание: SID4X-dCas9-KRAB синтез белка содержит тег epitope флаг и тег epitope HA, но лучшие результаты для чип seq были получены с антителами против флага. При желании пользователь может выполнять дополнительные эксперименты чип seq для транскрипционных факторов, потенциально затронутых Enhancer-i, или H3K27ac, Марк деятельности усилитель, который снизился на Enhancer-i. Однако каждый чип seq эксперимент требует 10 х 106 клеток, так план соответственно. Transfect клетки с Enhancer-i бассейнов. Пластина 10 х 106 клеток в культуре ткани блюдо 15 см. Каждое блюдо представляет 1 чип seq эксперимент 1 фактор интереса. Следующий день, transfect клетки, с помощью 20 мкг ДНК всего за блюдо. Для transfections в клеточных линий, стабильно выражения SID4X-dCas9-краб ДНК должны быть плазмида пул руководство РНК, ориентация всех сайтов, представляющих интерес и, при необходимости, плазмиды, выражая флуоресцентный белок. Для переходных transfections используйте в соотношении 3:2 dCas9 синтеза белка: руководство РНК бассейн. Для чип seq других TFs или изменения гистона выполните по крайней мере один дополнительный контроль руководство РНК трансфекции на другое блюдо. Лечить блюда с puromycin (1 мкг/мл) и неомицин (300 нг/мл) на пост трансфекции 24-48 ч. Подождите по крайней мере 24 часа до уборки хроматина. Урожай хроматина от блюд.Примечание: Для изучения последствий Enhancer-i ER геномной привязки в клетках Исикава, выполнить лечение 1 ч 10 Нм E2 на блюда transfected с управления руководство РНК и Enhancer-i до урожая. Для изучения воздействия Enhancer-i на H3K27ac, выполнить 8 h 10 Нм E2 индукции на блюда transfected с управления руководство РНК и Enhancer-i до урожая. Применить 500 мкл 37% формальдегида, к каждому блюду (конечная концентрация 1%). Вихрем пластины кратко. Дайте постоять 10 мин при комнатной температуре пластины. Добавьте 1 мл 2,5 М глицин (конечная концентрация 125 мм). Вихрем пластины кратко. Слить СМИ с формальдегидом и глицина. Добавление равным объемом (~ 20 мл) холодной ПБС. Слить PBS. Аспирационная с вакуумным аспиратором удалить столько PBS как можно скорее. Место блюда на льду. Добавить 3-5 мл холодного 1 x PBS или Фарнхам литического буфера (5 мм трубы рН 8,0, 85 мм KCl, 0,5% NP-40) с 1 x ингибитор протеазы (добавлены непосредственно перед использованием) для каждой пластины. Скрип блюдо с скребок пластины и передать решение 15 мл Конические трубки на льду. Пелле хроматина, спиннинг вниз трубы в центрифуге для 5 мин при 4 ° C, в 1000 x g. отменить супернатант и хранить окатышей на-80 ° C для использования в будущем или продолжить с чип seq протокол выбора с использованием антител против флага или антител против других факторы транскрипции или изменения гистона интерес (H3K27ac, H3K9me3).