細胞を用いた多重 CRISPR ベース エンハンサー干渉エンハンサー機能の解剖

1 世代セルの行を安定に発現する SID4X-dCas9-KRAB 注: トランスフェクション条件とここに示す薬物濃度に最適化されています石川細胞、子宮内膜癌細胞株、10 s と 1% ペニシリン/ストレプトマイシン (完全な RPMI) 添加 RPMI 1640 メディアで栽培します。他の細胞は異なるトランスフェクション条件および薬物濃度を必要があります。ユーザーは、SID4X-dCas9-KRAB ガイド RNA 発現プラスミド; と一緒にを発現プラスミドを安定したセルラインを生成する代わりに、野生型細胞のトランスフェクション実験を実行することもただし、一時的な transfections からの結果はトランスフェクションによって異なる場合があります SID4X-dCas9-KRAB レベルとして再現することは困難かもしれない。 30-50% 合流完了 RPMI 3 mL (約 300,000 石川細胞) で 6 ウェル プレートの少なくとも 2 の井戸で石川細胞をプレートします。 細胞からメディアを吸い出しなさい。1 × PBS (pH 7.4) と一度セルを洗浄します。PBS を吸引し、トリプシン (4 mL 10 cm 皿または T-75 フラスコ 5 mL) を追加します。 37 ° c、剥離細胞の 2 分ごとのチェックと、容器を軽く揺れ 〜 5 分のセルを孵化させなさい。 一度セルをデタッチ、ピペットは上下にいくつかの回と接続されたセルを解放する容器の側面を優しくピペット細胞をトリプシンしました。 15 mL の円錐管にセルを転送し、250 x g で 5 分間セルをスピンダウンします。 トリプシンを吸引し、5-10 mL の培地で細胞を再懸濁します。P1000 ピペットを使用して、必要に応じて細胞塊を分離します。 セルをカウントし、3 mL の容量でウェルあたりの 300,000 〜 細胞をプレートに必要なボリュームを決定します。6 ウェル プレート 2 つの井戸にセルを追加します。塗りつぶしは各完全な RPMI で 3 mL にも。 最初の 15 分でセルがプレートに均等に配布されるようにするめっき後プレート 5 分ごとを軽く振る。顕微鏡を使ってすると、井戸の中から細胞が分散していることを確認します。 めっきの 24 h 内で興味のセル行の適切なトランスフェクション試薬を使用して次の transfections を実行します。石川のセルに下記のとおり手順を使用します。注: このプロトコルでは、カチオン性リポソーム ベースのトランスフェクション試薬の使用を前提としています。エレクトロポレーションは、これらの試薬に非常に敏感、またはリポフェクション低トランスフェクション効率を展示する携帯型の代替方法を提供します。エンハンサー i 実験を試みる前に興味のセル行のトランスフェクション条件を最適化する必要があります。 1.7 ml エッペン チューブ、希釈 SID4X-dCas9-KRAB プラスミドの 2.5 μ g 及び 800 155 μ L であり、プラスミドの最終濃度は 0.020 μ g/μ L 管の最終巻その血清自由な媒体に蛍光タンパク質を発現プラスミドの ng。 別の管で 3.3 μ g のプラスミド pCMV GFP などのネオマイシン耐性カセットを含まない、血清自由な媒体の管の最終巻が 155 μ L とプラスミドの最終濃度は 0.020 μ g/μ L を希釈します。 渦は簡潔に各チューブし、スピン ・ ダウン、および microfuge を使用します。 各チューブにトランスフェクション試薬 (材料表) の 9.9 μ L を追加します。簡単に低速で混ぜます。および microfuge の管をスピンダウンします。 チューブが少なくとも 5 分、20 分以上の室温で孵化させなさい。 キャビネットのバイオ セーフティにおける 6 ウェル プレートに 1 つの井戸に準備された DNA: 試薬ミックスの 150 μ L を滴下追加します。準備された DNA: 試薬ミックスの他の管の手順を繰り返します。ミックス プレートを軽く旋回、インキュベーターにプレートを戻ります。 2 日目記事トランスフェクションでメディアを変更し、600 ng/μ L の最終的な集中に G418 を補足します。この濃度は、細胞の種類に合わせて最適化する必要があります。 完全な RPMI メディアを変更し、G418 transfected 制御細胞は死んでいるし、SID4X-dCas9-KRAB を含む井戸なる合流まで 2-4 週間毎日を補足します。細胞が修復に必要な時間の正確な量は、細胞の倍加時間によって異なります。 G418 の低用量で、コンフルエントになる細胞で T-25 または T-75 容器への通路が RPMI を完了するとき (300 ng/μ L 石川のセル)。この一節の中を 2 因数 〜 100,000 セルの各 (約 1/10th 6 ウェル プレートの) 2 の独立した 1.7 mL エッペン チューブに RNA と DNA の隔離のためそれぞれ。スピン (5 分、250 x g)、これらのチューブ、ピペッティングによりトリプシンを削除し、将来使用するための-20 ° C で管を凍結します。 市販のキットを使用してゲノムの DNA を隔離し、細胞内融合蛋白質の存在を確認する”pAC95_PCR”または”SID4X_PCR”プライマー (表 1) を使用して PCR を実行します。肯定的な制御としてネガティブ コントロールとしてはくさいから抽出したゲノム DNA と SID4x-dCas9-KRAB プラスミド DNA を使用します。ゲノム DNA の次のサイクリング条件 50 100 ng と忠実度の高いポリメラーゼ マスター ミックスを使用: 98 ° C、30 s、サイクル、25 (98 ° C、10 s、58 ° C、30 秒、2 分のための 72 ° C)、72 ° C、5 分、4 ° C で保持 RNA レベルで融合タンパク質の発現を確認するには、市販のキットを使用して細胞株から抽出した RNA を qPCR を実行します。”DCas9_qPCR”プライマー (表 1) を使用し、ワンステップ qPCR プロトコルは、このプロトコルの手順 6.3。 融合発現タンパク質レベルを確認するには、実行、ウエスタン細胞ラインから溶解液のしみ。反フラグまたは対策のいずれかを使用-HA 融合蛋白質を検出する抗体。 2. ガイド RNA デザイン 注: このプロトコルは、クローンとして作るベクトル教会の実験室によって作成され、Addgene (Addgene 41824) で使用可能な U6 ガイド rna 用です。41824 として同じクローニング法の許可ピューロマイシン耐性を含むこのベクトルのバージョンを作成するには、多重クローニング サイトをこのベクトルから pGL3 U6 sgRNA PGK ピューロマイシン ベクトル (Addgene 51133) に移動しました。Addgene 41824 またはピューロマイシン (Addgene 106404) と私たちのバージョンのいずれか、下記クローニング法と互換性が。 興味の各規制地域の DNA シーケンスの 600-900 ヒトを取得します。(図 2 a) 関心領域を定義する場所のガイダンスの転写因子結合部位やクロマチンのアクセシビリティを使用します。注:図 2 aの例の機能上流と下流のエンハンサーは、それも可能ですイントロン内にある規制の要素を対象とします。 FASTA 形式を使用して 1 つのテキスト ファイルの取得すべての系列を配置します。 興味のセルのラインで表現されていない遺伝子のプロモーターなどの実験条件で変更されないが、少なくとも 1 つのネガティブ コントロール地域を識別します。この地域の dna を入手して FASTA 形式でテキスト ファイルに追加します。メモ: 我々 はガイド Rna 陰性対照すべての地域を対象としてIL1RNプロモーター25をターゲットを使用します。ネガティブ コントロールとして転写因子結合部位を含まない関心領域の近くの遺伝子間のシーケンスも選択できます。ただし、複数の遺伝子座が同時に対象と、その 1 つの否定的な調節領域には、実験計画と結果の解釈が簡素化します。対象となるエンハンサーがイントロンの場合 dCas9 の融合として、追加のネガティブ コントロールとして推定される規制要素が含まれていない同じ軌跡でイントロン領域は転写と干渉するかもしれないターゲットに役に立つ場合があります。 プロモーター、規制地域の推定の対象とするなど高い関心のセルラインに転写される遺伝子のプロモーター、肯定的な制御領域を識別します。これらの地域の dna を入手して FASTA 形式でテキスト ファイルに追加します。 低オフ ターゲット (理想的には 0-3) を持つガイド Rna を見つけるに生成された DNA シーケンスの e カリカリ26 (http://www.e-crisp.org/E-CRISP/) などのプログラムを使用します。ガイド Rna は protospacer 隣接するモチーフ (PAM) s. 化膿から dCas9 の「NGG」形をとる 20 ヌクレオチド上流から成っています。 E さわやかなウェブサイトでドロップ ダウン メニューを使用して興味の生物を選択します。ゲノムのアセンブリは、種名の右側に表示されます。 入力が FASTA のシーケンスのラジオ ボタンを選択します。上から FASTA シーケンスをコピーし、ダイアログ ボックスに貼り付けます。FASTA ヘッダーが各シーケンスに含まれることを確認します。注: 50 シーケンスまで照会できます同時に。 ドロップ ダウン メニューで媒体ラジオ ボタンと1 つのデザインを選択します。 SgRNA 検索を開始] ボタンをクリックします。ブラウザーの新しいタブが開きと結果が表示されます。候補シーケンスをダウンロードするには、一緒にすべてのクエリのシーケンスの Excel 形式の表形式のレポートをダウンロード] ボタンをクリックします。 Excel またはテキスト編集プログラムを使用して表形式のレポートを開きます。 BLAT 候補フルレングスの gRNA シーケンス (23 ヒト) ゲノム、UCSC のゲノムのブラウザーを使用します。 ブラウザーで、UCSC のゲノムのブラウザーのウェブサイト (http://genome.ucsc.edu) に移動します。私たちのツールのセクションBLATは用語を検索、それをクリックします。BLAT 検索ツールが起動します。 BLAT 検索ゲノム本文の下にあるドロップ ダウン メニューを使用すると、興味の生物、ゲノムのアセンブリを選択できます。 E カリカリによって生成される表形式のレポートからガイド RNA シーケンスをコピーし、ダイアログ ボックスに貼り付けます。各シーケンスにユニークな FASTA ヘッダーの送信] ダイアログ ボックスの下部をクリックしてください。注: 25 シーケンスまで調べることができます一度に。BLAT 検索結果] ページで、各ガイド RNA シーケンスの線形は、線形を表す各行が表示されます。理想的には、それぞれのガイド ガイド RNA の一意性を示す RNA の 1 つ配置する必要があります。 可能な場合はゲノム中の複数の場所に配置ガイドを避けてください。 ガイド RNA 局在と関心の領域内の分布を調べると、照会されたガイド Rna のいずれかの [アクション] セクションブラウザーのリンクをクリックします。ゲノムのブラウザーが表示され、選択したガイド RNA 中心になります。ページの上部にズームアウトボタンを使用して、Rna 識別関心領域内 e パリッとしたその他のガイドの分布を視覚化します。 4 できれば重複ガイド RNA シーケンス (図 2 b) 関心の領域全体に分散するを選択します。関心領域は、600 を超える場合、bp 1 2 その他のガイドを追加することを検討してください。これらの機能することができますガイド RNA の複製プロセスを妨げるし、ガイド RNA ターゲットに効率を減らすトルエン ストレッチと極端な GC コンテンツ ガイド Rna を避けます。 ガイドを選択すると、各目的のガイドでは、完全なガイド RNA シーケンス (23 塩基) を含むファイルを作成し、3′ 末端から 5′ ヌクレオチドとして PAM (NGG) を削除します。この手順を容易にオリゴを注文します。 配列の 5′ 端に次のシーケンスを追加: GTGGAAAGGACGAAACACCG。 次のシーケンスの配列の 3′ 末端に追加: GTTTTAGAGCTAGAAATAGC。メモ: 最終的なシーケンスがあります 59 ヌクレオチド長いと見てこのような: GTGGAAAGGACGAAACACCG ターゲット (19 nt)-GTTTTAGAGCTAGAAATAGC。 エンハンサー i の対象になる各規制要素にそれ用に設計された少なくとも 4 ユニークなオリゴヌクレオチドであることを確認します。表 1に記載されている”U6_internal”プライマーと一緒にこれらのシーケンスを注文します。 3. ガイド RNA のクローニング 注: はギブソン アセンブリを介してガイド RNA クローニング ベクトルの唯一のコントロールであれば少数のコロニーとコロニー プレートあたりの数百の降伏、我々 の手で非常に効率的に証明されています。このような効率がプールのクローン作成中に複雑さを維持するため重要です。クローニング ギブソン アセンブリの別の利点は、彼らは U6 のクローニング ベクトルに挿入しようとしている RNA ガイドのサイトをカット制限酵素の存在を心配するユーザーはしていないです。それにもかかわらず、このプロトコルが必要な場合のクローンを作成基づいて従来の制限酵素の合わせることができます。 (RNase フリー、DNase フリー)、純水で 100 μ M の最終的な集中でガイド RNA oligos を再構成します。興味の地域ごとの少なくとも 4 別ガイド RNA oligos 必要があります。 興味の各規制地域、関心の領域に対応するすべての oligos のプールを作成します。エッペン チューブで地域ごとにそれぞれ個々 の再構成されたガイド RNA オリゴの 5 μ L を組み合わせてください。、ボルテックスでよくプールを混ぜる、1 μ L を削除し、純水でこの分注 1: 200 を希釈します。注: 必要な場合これらの個々 の規制地域をターゲット ・ プールさらに結合できます複雑なプールをターゲットに複数の領域を生成します。最大 50 規制領域可能性がありますの対象に同時に単一のプール (図 3)。 ギブソン アセンブリ前に oligos 相同領域にアタッチする U6 プライマーの短い PCR を実行します。各オリゴは、両端に U6 ベクトルに十分な相同性を含んだ 〜 100 bp 製品を降伏に約 40 拠点が追加されます。 各ガイド RNA プール、忠実度の高いポリメラーゼ マスター ミックスと次のコンポーネントと 20 μ L の PCR を設定: ステップ 3.2、U6 前方プライマー (10 μ M)、U6 の 1 μ L の 1 μ L から希薄オリゴ プールの 1 μ L 逆プライマー (10 μ M)、最大 20 μ L を水と。 以下の条件で熱 cycler で孵化させなさい: 98 ° C、30 s、サイクル、10 (98 ° C、10 s、55 ° C、30 秒、2 分のための 72 ° C)、4 ° C で 5 分押しのための 72 ° C 低分子量の梯子の 1-2% の agarose のゲルの反応の 5 μ L を実行します。最終製品は、100 〜 ヒト (図 2) をする必要があります。 列に基づく DNA 精製キットと拡張反応をクリーンアップし、キットで提供される溶出バッファーの 20 μ L の溶出します。注: 製品は短いので、回避ビーズ ベースの清掃、100 未満の小さな断片を除外するように設計を使用して bp。 蛍光光度計や分光光度計を使用して精製した DNA の定量化 (予想利回りは 10-20 ng/μ L)。ガイド RNA 挿入は-20 ° C で保存することができます。 または線形 U6 ベクトルを持つギブソン アセンブリですぐに使用することができます。 U6 クローニング ベクトル ギブソン アセンブリの受信者を準備するには、制限の酵素のダイジェストを設定します。多くのギブソン アセンブリ反応を実行する場合は、カットのベクトルの十分な収量を確保するため複数のダイジェストを設定します。 AflII 酵素の 20 台、1 μ g のプラスミドは、適切な制限酵素バッファーと 20 μ L 反応。1-2 h を 37 ° C で孵化させなさい。 ビーズまたは列に基づく DNA 精製キットでダイジェストをクリーンアップし、20 μ L の溶出バッファーで溶出します。蛍光光度計や分光光度計を使用して精製した DNA を定量化します。サンプルは、後で使用するための-20 ° C で凍結できます。 ベクトルの準備にギブソン アセンブリを実行し、挿入します。 氷上ギブソン アセンブリ反応を設定します。ベクターと 7 の使用 50 ng の 20 μ L 反応で挿入 ng。挿入 1:10 をピペッティングを容易にする超純水で希釈します。ベクトルだけギブソン アセンブリ反応を 50 を使用してベクターとインサートを水に置き換えての ng。 4 ° C での開催に続いて、50 ° C で 15 分間ギブソン アセンブリ反作用を孵化させなさい 氷に組み立て完成品を転送します。組み立て完成品 1:4 氷の上超純水で希釈します。たとえば、15 μ L の純水にギブソン アセンブリ製品の 5 μ L を追加します。 希薄化後のギブソン アセンブリ製品を変換します。 氷の上の高効率有能なセルを解凍し、変換ごとに 25 μ 因数を作る。複数のサイトを対象とする複雑なプールが必要な場合は、同じ複雑な gRNA プールの複数の独立した変換を実行する別のチューブに十分な細胞を解凍します。 各希釈 1.7 ml エッペン チューブの有能なセルの 25 μ L を含むこの希釈の 1 μ L を追加します。簡単にチューブをフリックでミックスします。30 分間氷の上管を孵化させなさい。 熱ショック 30 セル 42 ° c、s の 2 分間氷にすぐに転送します。 300 μ L の SOC のメディア (2% トリプトン、0.5% 酵母エキス、10 mM の NaCl、KCl、2.5 mM 10 mM MgCl2MgSO4、10 mM と 20 mM のグルコース) を追加し、37 ° C (300 の rpm) の揺れで 1 時間回復細胞。この間、インキュベーターの 37 ° C とアンピシリン/carbenicillin と寒天を温めます。各変換ごとに 1 つのプレートを使用します。 細胞の 50 μ L をプレート、37 ° C のインキュベーターで一晩プレートを配置します。個々 のサイトを対象とするプール、アンピシリン/carbenicillin (1 mg/mL) を含む流体培養基 LB (材料表) の 3 ~ 5 mL に直接配置し、minipreps 37 ° C で 250 rpm で振とうしながら一晩インキュベートします。 セルを収穫し、DNA を分離します。 複数のサイトを対象とする大規模なガイド RNA ライブラリ、1 つ maxiprep (150 mL 液体培養) にそれぞれの個々 の板からすべてのコロニーを収集するためにプレートのスクレーパーを使用します。これは、50 mL の隼のチューブとチューブにコロニーを掻きに注ぐ ~ 5 mL LB の適切な抗生物質で容易にできます。個々 のサイトをターゲットのライブラリ、miniprep (3-5 mL の液体培養) にプレートをこすり。 250 rpm で振とうしながら 37 ° C で 3-5 h の適切な抗生物質とこれらの文化を孵化させなさい。 プレップのエンドトキシン フリーになるキットを使用して DNA の抽出を実行します。 蛍光光度計や分光光度計を使用して DNA を定量化します。プラスミドは、遺伝子導入ですぐに使用または将来使用するための-20 ° C で保存できます。 1 つのサイトをターゲットに小さな水たまりがサンガーを用 U6 ベクター内ガイド RNA シーケンスの存在を確認するには、”U6_PCR_R”プライマーの準備 miniprep の配列は、表 1に示します。ガイド Rna のプーリングにより 19 basepair gRNA ターゲット シーケンスは混合されたベースになりますが、U6 プロモーターとガイド RNA 足場周囲のこのシーケンスはそのままする必要があります。 4. エンハンサー私のトランスフェクション メモ: 石川細胞エンハンサー i を用いたエストロゲン応答の成功の封鎖の必要はフェノールレッドでそれらを維持することによってトランスフェクション前に 5-7 日 10% 無料 RPMI 木炭を除去した FBS と 1% のエストロゲンの細胞を奪うことペニシリン/ストレプトマイシン。トランスフェクション後必要エストロゲン応答をブロックする場合は細胞をこのメディアに培養する必要があります。完全なフェノールレッドの細胞の通過無料 RPMI フェノールレッド無料トリプシンの使用をお勧めします。 トランスフェクション、前日は 30-50% の confluency (石川セル用の井戸あたり ~ 60,000 セル) で 24 ウェル プレートで (野生型または安定に発現する SID4X-dCas9-KRAB) 細胞をプレートします。Transfections、重複して実行することができますコントロール ガイド Rna のトランスフェクションに井戸があります、十分な細胞をプレートします。 セルがステップ 1.1.7 のようにセルめっき後プレートを優しく揺することによって井戸に均等に配分することを確認します。注: このプロトコルでは、カチオン性リポソーム ベースのトランスフェクション試薬の使用を前提としています。エレクトロポレーションは、これらの試薬に非常に敏感な細胞の種類の代替方法を提供します。エンハンサー i 実験を試みる前に興味のセル行のトランスフェクション条件を最適化する必要があります。 次の日は選択のトランスフェクション試薬の指示に従って transfections を準備します。石川のセル、24 ウェル プレートの各ウェルの合計プラスミドの使用 550 ng。血清自由な媒体 (株 2 井戸の総体積の 52 μ l の DNA の 1.1 μ g) の 0.020 μ g/μ L の最終的な集中にプラスミドを希釈します。トランスフェクション試薬の 3 μ L を使用して DNA のすべて 1 μ g の渦と手順 1.2 を孵化させなさい。最終混合物の 25 μ L を各ウェルに追加します。注: ターゲット サイトの組み合わせに、個々 のサイトのプラスミッドの同じ重量を使用し、制御プラスミド (空ガイド RNA ベクターまたはガイドIL1RNなどネガティブ コントロール領域をターゲット Rna のクローニングと残りの重量を入力プロモーター)。一時的な transfections 3:2 Cas9 融合: ガイド RNA プラスミドの比率を使用します。蛍光レポーターを含んでいるプラスミッドは、トランスフェクション効率を監視に追加可能性があります。 36 h ポスト トランスフェクションで変更フェノールレッドを使用してメディア 10% 炭剥奪 FBS と 1% ペニシリン/ストレプトマイシン (石川セル) の無料 RPMI、ピューロマイシンを供給 (最終濃度: 1 μ g/mL) とネオマイシン (最終濃度: 300 ng/mL)。細胞のトランスフェクション試薬に敏感である、以前では、メディアを変更できますが、24 h ポスト トランスフェクションより以前に抗生物質を追加してください。注: セルを収穫前に抗生物質を追加した後、少なくとも 24 時間を待ちます。48 h は早くもトランスフェクションの記事し、を 5 日間の投稿トランスフェクション エンハンサー-i のための表現の変更を検出できます。エストロゲンを奪われている石川セル操作、8 h 10 nM 17 β-エストラジ オール (E2) 誘導抗生剤投与後日を行い、細胞をすぐに収穫します。 5. 細胞収穫および RNA の抽出 1% β-メルカプトエタノール (BME) 換散バッファーを準備します。十分な換散 BME 混合物 (各も収穫されての 300 μ L) があることを確認します。 真空吸引装置を使用してメディアを吸い出しなさい。 1 × PBS の等量と一度セルを洗浄 (500 μ L) と可能ように同様に多くの PBS を削除する吸引。 マルチ チャンネル ピペットを使用して各ウェルに換散 BME ソリューションの 300 μ L を追加します。ピペットの換散のソリューションを 8 – 10 倍、ディープウェル プレートまたは 1.7 mL エッペンに転送は氷の上管します。RNA をすぐに抽出することができます。 または lysates を将来処理-80 ° C で固定できます。 Lysates から RNA を抽出するには、DNase 処理を含む市販のキットを使用します。(RNase フリー、DNase フリー) 純水の最小の推奨量の溶出や溶出バッファーし、RNA を定量化します。サンプル数は少なく、蛍光光度計や分光光度計を使用します。多数のサンプル、プレート リーダーで測定と RNA を検出する蛍光プローブを使用します。サンプルは、定量化の前後に-80 ° C で冷凍することができます。 6. ワンステップ qPCR と RNA シーケンスを使用して遺伝子発現変動の定量化 QPCR プライマー興味の遺伝子の少なくとも 1 つの家計の遺伝子ターゲット遺伝子のレベルに近い表現は、実験条件は変更されませんを取得します。理想的には、これらのプライマー、ゲノム DNA の増幅を避けるためにエクソン エキソンジャンクションにまたがります。 興味の細胞ラインから得られた RNA にこれらのプライマーをテストします。使用は、単一の製品の生産を確認する曲線解析を溶かします。単一製品を生産しない場合は、追加のプライマーのペアをテストします。 各エンハンサー i とコントロール ガイド RNA 処理サンプルは、どのように多くの遺伝子が、このサンプルで試金する必要がありますを識別します。この遺伝子のセットは、 CTCFやGAPDHなどのハウスキーピング遺伝子を含める必要があります。 QPCR 反応を設定します。 同じ濃度、水にすべてのサンプルを希釈するよう 50 総 RNA の ng は戻簡単に、各反作用のため RNA を希釈十分があります。たとえば、~16.6 ng/μ L に RNA を希釈し、各反応における RNA の 3 μ L を使用します。氷の上の RNA を保った、マスター ミックスを設定します。 市販のワンステップ qPCR キットを使用して測定される各遺伝子の別のマスター ミックスを準備します。各プライマー (10 μ M 原液) の 1 μ L と 20 μ L 反応ボリュームを使用します。氷の上のこれらの反応を設定します。 熱 cycler の適切なリアクション プレート、続いてマスター ミックスの RNA のサンプルを追加します。プレート シーラーでシール、軽くボルテックスやピペッティングで混ぜます。簡単にプレートを遠心分離機 (140 x 60 g s)、井戸の下にその液体をように。 サーマルサイクラーにプレートを次のように孵化させなさい (またはキットとして指示します): 48 ° C、30 分、95 ° C 10 分の 40 のサイクル (95 ° C、15 秒、1 分の 60 ° C)。 各サンプル内で測定した各遺伝子の Ct 値を取得します。遺伝子発現の変化を識別するために比較 Ct 法を使用します。 Ct の正規化された値を生成する各サンプルの興味の各遺伝子の Ct からハウスキーピング遺伝子の Ct を減算します。 治療コントロールのサンプルの各遺伝子の正規化された Ct 値の平均を取る。ログ ベースの 2 スケール倍抑圧は、対応する遺伝子の処理コントロールのサンプルに対して同じ値から各遺伝子の正規化されたエンハンサー i 処理サンプル Ct を差し引くことによって計算できます。 エンハンサー i 処置に続く遺伝子発現でグローバルな変更を決定する、ユーザーのシーケンス技術と互換性のある市販のキットを使用して RNA 配列のサンプルを準備します。RNA の使用 〜 500 ng の開始材料と少なくとも 2 の生物的複製のライブラリを準備します。 7 SID4X-dCas9-KRAB 使用チップ seq 特定ゲノム ターゲットの検証 注: SID4X-dCas9-KRAB 融合タンパク質は epitope、フラグの札と HA エピトープ タグの両方を含むが、反フラグ抗体チップ seq に対して最適な結果が得られました。必要な場合、ユーザーは、エンハンサー-i の潜在的影響を受ける転写因子、H3K27ac、エンハンサー i が減少エンハンサー活性のマーク追加チップ seq 実験を実行できます。ただし、各チップ seq 実験は、10 × 10 の6セル、計画に応じて必要があります。 エンハンサー i プール付きセルを transfect します。 プレート 15 cm 培養皿に 10 x 10 の6セル。それぞれの料理は、興味の 1 要因の 1 チップ seq 実験を表します。 次の日は transfect 皿あたり 20 μ g の全 DNA を用いた細胞です。SID4X-dCas9-KRAB を安定に発現する細胞株における transfections の DNA プラスミド プール ガイド Rna の関心のすべてのサイトを対象とし、必要に応じて蛍光蛋白質を表現するプラスミッドべきであります。一時的な transfections 比 3:2 dCas9 融合タンパク質: ガイド RNA プールを使用します。他の TFs やヒストン修飾のチップ seq、別皿の上に少なくとも 1 つの追加の制御ガイド RNA トランスフェクションを実行します。 ピューロマイシン (1 μ g/mL) とネオマイシン (300 ng/mL) 24-48 h ポスト トランスフェクションで料理を扱います。クロマチンを収穫前に少なくとも 24 時間を待ちます。 料理からクロマチンを収穫します。注: 石川細胞における小胞体ゲノム結合にエンハンサー i の効果を研究、料理に 1 h 10 nM E2 治療を実行するには、コントロール ガイド Rna とエンハンサー i 前に収穫すると transfected。研究エンハンサー i が H3K27ac に及ぼす影響、皿に 8 h 10 nM E2 誘導を実行するには、発現コントロール ガイド Rna やエンハンサー i 前に収穫します。 37% ホルムアルデヒドの 500 μ L をそれぞれの料理 (最終濃度 1% の) に適用します。プレートを簡単に旋回します。板室温で 10 分間座ってみましょう。 2.5 M のグリシン (125 mM の最終的な集中) の 1 つの mL を追加します。プレートを簡単に旋回します。 ホルムアルデヒドとグリシンとメディアを注ぐ。冷 1x PBS の等しいボリューム (~ 20 mL) を追加します。 PBS を注ぐ。できるだけ多くの PBS を削除する真空吸引装置で吸引します。氷の上の皿を配置します。 PBS またはファーナムの換散バッファー x 冷 1 の 3-5 mL を追加し (5 mM パイプ pH 8.0、85 mM KCl、0.5% NP 40) プロテアーゼ阻害剤 (使用の直前に追加) 各プレートに 1。板スクレーパーと皿をこすり、氷の 15 mL の円錐管にソリューションに転送。 上澄み 1000 x g 破棄に 4 ° C で 5 分間遠心チューブを回してクロマチンをペレットし将来使用するため-80 ° C でペレットを格納または反フラグ抗体または他をターゲットの抗体を使用して好みのチップ seq プロトコルを続行転写因子やヒストン修飾 (H3K27ac、H3K9me3) の興味の。