Dissezione della funzione Enhancer usando Multiplex basati su CRISPR Enhancer interferenze nelle linee cellulari

1. generazione di Cell Lines che esprimono stabilmente SID4X-dCas9-KRAB Nota: Le condizioni di transfezione e le concentrazioni di farmaco qui presentate sono state ottimizzate per le cellule di Ishikawa, una linea cellulare di cancro dell’endometrio, coltivate in RPMI 1640 media completati con 10% FBS e 1% penicillina/streptomicina (RPMI completo). Altre linee cellulari possono richiedere condizioni diverse di transfezione e concentrazioni nella droga. Gli utenti possono anche eseguire esperimenti di trasfezione transiente in cellule wild-type, invece di generare una linea cellulare stabile, con un plasmide esprimente SID4X-dCas9-KRAB insieme a RNA guida esprimendo plasmidi; Tuttavia, i risultati da transfezioni transienti potrebbero essere difficili da riprodurre come livelli di SID4X-dCas9-KRAB possono variare dalla transfezione. Piastra di cellule di Ishikawa in almeno 2 pozzetti di una piastra di 6 pozzetti di confluenza 30-50% (circa 300.000 cellule di Ishikawa) in 3 mL di RPMI completo. Aspirare i media dalle cellule. Lavare le cellule una volta con PBS 1X (pH 7.4). Aspirare il PBS e aggiungere tripsina (4 mL per un piatto di 10 cm o 5 mL per un pallone da T-75). Incubare le cellule per ~ 5 min a 37 ° C, controllando ogni 2 min per cellule indipendente e delicatamente scuotendo il vaso. Una volta che le cellule hanno staccato, pipetta tripsinizzate cellule su e giù per un paio di volte e pipetta inclinate leggermente il bordo del recipiente per rilasciare eventuali cellule allegate. Trasferire le cellule in una provetta conica da 15 mL e rallentare le cellule per 5 min a 250 x g. Aspirare la tripsina e risospendere le cellule in 5-10 mL di media. Utilizzare una pipetta P1000 per dissociare ciuffi di cella, se necessario. Contare le celle e determinare il volume necessario per piastra ~ 300.000 cellule per pozzetto in un volume totale di 3 mL. Aggiungere le celle 2 pozzetti separati di una piastra a 6 pozzetti. Riempire ogni bene a 3 mL con RPMI completo. Scuotere delicatamente la piastra ogni 5 min nel primo 15 min dopo placcatura per garantire che le cellule siano distribuite uniformemente sulla piastra. Utilizzare un microscopio per garantire che le cellule sono disperse dalla metà del pozzo. Entro 24 h dalla placcatura, eseguire i seguente transfezioni utilizzando un reagente di transfezione appropriato per la linea cellulare di interesse. Per cellule di Ishikawa, è necessario utilizzare la procedura come descritto di seguito.Nota: Il presente protocollo si presuppone l’utilizzo di reagenti di transfezione di base di liposomi cationici. Elettroporazione fornisce un metodo alternativo per tipi di cellule che sono molto sensibili a questi reagenti o che esibiscono l’efficienza di trasfezione basso con lipofezione. Condizioni di transfezione devono essere ottimizzate per la linea cellulare di interesse prima di tentare di esperimenti Enhancer-i. In un 1,7 mL provetta Eppendorf, diluire 2,5 μg di plasmide SID4X-dCas9-KRAB e 800 ng di plasmide esprimente una proteina fluorescente in terreni privi di siero in modo tale che il volume finale del tubo è µ l 155 e la concentrazione finale del plasmide è 0.020 µ g / µ l. In un altro tubo, diluire 3,3 µ g di un plasmide che non contengono una cassetta di resistenza di neomicina, quali pCMV-GFP, in media del siero senza tale che il volume finale del tubo è µ l 155 e la concentrazione finale del plasmide è 0.020 µ g / µ l. Vortice ogni tubo brevemente e rotazione verso il basso utilizzando un microfuge. Aggiungere 9,9 µ l di reagente di transfezione (Tabella materiali) in ogni provetta. Mescolare nel Vortex brevemente a bassa velocità. Rallentare i tubi con un microfuge. Incubare le provette a temperatura ambiente per almeno 5 minuti, ma non più di 20 min. Nella cappa di biosicurezza, aggiungere 150 µ l della miscela del DNA: reagente preparato goccia a goccia in un pozzetto sulla piastra 6 pozzetti. Ripetere per l’altro tubo di mix di DNA: reagente preparato. Miscelare le piastre agitando delicatamente e riporre la piastra nell’incubatore. Transfezione di post del giorno 2, cambiare il supporto e completare con G418 a una concentrazione finale di 600 ng/μL. Questa concentrazione potrebbe essere necessario essere ottimizzato per il tipo di cella. Modificare multimediale completo RPMI e completare con G418 ogni altro giorno per 2-4 settimane fino a quando il controllo transfettata le cellule sono morti e i pozzetti contenenti SID4X-dCas9-KRAB diventano confluenti. L’esatta quantità di tempo necessario per recuperare le cellule dipenderà il tempo di raddoppiamento delle cellule. Quando le cellule diventare confluenti, passaggio a una nave T-25 o T-75 in completano RPMI con una dose inferiore di G418 (300 ng/μL per cellule di Ishikawa). Durante questo passaggio, fare 2 aliquote di ~ 100.000 cellule ogni (circa 1/10th di una piastra a 6 pozzetti) in 2 provette Eppendorf di separata 1,7 mL per l’isolamento di RNA e DNA, rispettivamente. Girare questi tubi verso il basso (5 min, 250 x g), rimuovere tripsina pipettando e congelare le provette a-20 ° C per un uso futuro. Isolare il DNA di genomic usando i kit disponibili in commercio ed eseguire PCR utilizzando il “pAC95_PCR” o “SID4X_PCR” primer (tabella 1) per verificare la presenza della proteina di fusione all’interno nella linea cellulare. Utilizzare il DNA genomic estratto della linea parentale come controllo negativo e il DNA del plasmide SID4x-dCas9-KRAB come controllo positivo. Utilizzare un mix master della polimerasi ad alta fedeltà con 50-100 ng di DNA genomico e le seguenti condizioni in bicicletta: 98 ° C per 30 s, 25 cicli di (98 ° C per 10 s, 58 ° C per 30 s, 72 ° C per 2 min), 72 ° C per 5 min , tenere a 4 ° C. Per verificare l’espressione della proteina di fusione a livello di RNA, eseguire qPCR con RNA estratto dalla linea cellulare usando i kit disponibili in commercio. Utilizzare il primer “dCas9_qPCR” (tabella 1) e il protocollo di qPCR One-Step fornito nel passaggio 6.3 del presente protocollo. Per verificare l’espressione del livello della proteina di fusione, eseguire un Western blot su lisati dalla linea cellulare. Utilizzare anti-FLAG o anti-HA gli anticorpi per rilevare la proteina di fusione. 2. Guida RNA Design Nota: Questo protocollo è progettato per uso con il RNA di guida U6 clonazione vettoriale creata dal laboratorio Chiesa e disponibile su Addgene (Addgene 41824). Per creare una versione di questo vettore contenente resistenza con puromicina che ha permesso per la stessa strategia clonazione 41824, ci siamo spostati i polylinker da questo vettore nel vettore pGL3-U6-sgRNA-PGK-con puromicina (Addgene 51133). Addgene 41824 o la nostra versione con con puromicina (Addgene 106404) sono compatibili con la clonazione strategia descritta di seguito. Ottenere 600-900 basi di sequenza di DNA di ogni regione regolatrice di interesse. Utilizzare siti di legame del fattore di trascrizione e/o l’accessibilità della cromatina per indicazioni su dove andare a definire l’area di interesse (Figura 2A).Nota: Mentre nell’esempio in Figura 2A caratteristiche esaltatori di upstream e downstream, è anche possibile di destinazione elementi regolatori che si trova all’interno di introni. Posizionare tutte le sequenze ottenute in un unico file di testo utilizzando il formato FASTA. Identificare almeno una regione di controllo negativo che non si prevede di passare a condizioni sperimentali, come promotore di un gene che non è espresso nella linea cellulare di interesse. Ottenere la sequenza del DNA per questa regione e aggiungerlo al file di testo in formato FASTA.Nota: Abbiamo usato la guida RNAs targeting il promotore IL1RN 25 come controllo negativo per tutte le regioni che ci rivolgiamo. Gli utenti possono anche selezionare sequenza intergenica vicino alla regione di interesse che non contiene siti di legame del fattore di trascrizione come controllo negativo. Tuttavia, se più loci sono presi di mira contemporaneamente, una regione di singolo controllo negativo semplifica disegno sperimentale e interpretazione dei risultati. Se il rinforzatore mirato è intronic, può essere utile a destinazione una regione intronic nello stesso locus, che non contiene un elemento regolatore putativo come un ulteriore controllo negativo, come la fusione di dCas9 può interferire con la trascrizione. Identificare le aree di controllo positivo, quali promotori che sono il bersaglio putativo di nelle regioni regolatrici di interesse o promotori di geni che sono altamente trascritti nella linea cellulare di interesse. Ottenere la sequenza del DNA per queste regioni e aggiungerlo al file di testo in formato FASTA. Utilizzare un programma come e-croccante26 (http://www.e-crisp.org/E-CRISP/) sulle sequenze del DNA generate per cercare Guida RNAs con basso off-target (idealmente 0-3). Guida RNAs consistono di 20 nucleotidi a Monte di un motivo adiacente protospacer (PAM), che assume la forma “NGG” per il dCas9 da S. pyogenes. Sul sito Web e-croccante, selezionare l’organismo di interesse utilizzando il menu a discesa. L’Assemblea di genoma appare a destra del nome della specie. Selezionare il pulsante di opzione Input è FASTA sequenza . Copiare le sequenze FASTA dall’alto e incollarli nella finestra di dialogo. Verificare che un’intestazione FASTA è inclusa per ogni sequenza.Nota: Fino a 50 sequenze possono essere interrogati simultaneamente. Nel menu a discesa, selezionare il pulsante di opzione Medium e unico disegno . Fare clic sul pulsante Avvia ricerca sgRNA. Si aprirà una nuova scheda del browser, e i risultati verranno visualizzati. Scarica le sequenze di candidati facendo clic sul pulsante Scarica un report tabella Excel formattato per tutte le sequenze di query insieme. Aprire il report tabulare utilizzando Excel o un editor di testo. Utilizzare il browser genoma UCSC BLAT sequenze di Full-Length gRNA candidato (23 basi) al genoma. In un browser, passare al sito del browser UCSC genoma (http://genome.ucsc.edu). Sotto la sezione i nostri strumenti, individuare la parola BLAT e fare clic su di esso. Verrà aperto lo strumento di ricerca BLAT. Utilizzare i menu a discesa situati sotto il testo BLAT ricerca genoma per selezionare l’assembly organismo e genoma di interesse. Copiare le sequenze di RNA guida dal report tabulare generato dal e-crisp e incollarli nella finestra di dialogo. Garantire che ogni sequenza ha un’unica intestazione FASTA, quindi fare clic su Invia nella parte inferiore della finestra di dialogo.Nota: Fino a 25 sequenze possono essere esaminati in una sola volta. Nella pagina dei Risultati di ricerca BLAT , allineamenti di ogni sequenza di RNA guida apparirà, con ogni riga che rappresenta un allineamento. Idealmente, dovrebbe esserci un allineamento per ogni guida di RNA, che indica l’unicità di tale guida RNA. Evitare le guide che si allineano a più posizioni nel genoma, se possibile. Per esaminare la guida RNA localizzazione e distribuzione all’interno della regione di interesse, clicca sul link Browser nella sezione azioni per uno degli RNA guida richiesto. Il Genome Browser verrà visualizzato e sarà centrato sulla guida selezionata RNA. Utilizzare i pulsanti Zoom indietro nella parte superiore della pagina per visualizzare la distribuzione di altre guida RNAs identificato da e-croccante all’interno della regione di interesse. Selezionare 4 preferibilmente non sovrapposte guida sequenze di RNA che vengono distribuiti in tutta la regione di interesse (Figura 2B). Se la regione di interesse è superiore a 600 bp, considerare l’aggiunta di 1-2 guide aggiuntive. Evitare di guida RNAs con tratti di omopolimero e contenuto di GC estrema, come queste caratteristiche possono ostacolare il RNA guida processo di duplicazione e ridurre guida RNA efficienza di targeting. Una volta che le guide sono state selezionate, creare un file contenente la guida completa sequenza di RNA (23 nucleotidi) per ogni guida desiderata e quindi rimuovere il nucleotide 5′ così come il PAM (NGG) dall’estremità 3′. Questo passaggio facilita l’ordinazione oligo. Aggiungere la seguente sequenza al 5′ conclusione della sequenza del oligonucleotide: GTGGAAAGGACGAAACACCG. Aggiungere la seguente sequenza all’estremità 3′ della sequenza del oligonucleotide: GTTTTAGAGCTAGAAATAGC.Nota: La sequenza finale dovrebbe essere 59 nucleotidi lungo e senti come questo: GTGGAAAGGACGAAACACCG-destinazione (19 nt)-GTTTTAGAGCTAGAAATAGC. Assicurarsi che ogni elemento normativo per essere mirate con Enhancer-i con almeno 4 oligonucleotidi unici progettati per esso. Ordinare queste sequenze insieme con gli iniettori di “U6_internal” elencati nella tabella 1. 3. Guida RNA clonazione Nota: Guida RNA clonazione tramite Assemblea Gibson ha dimostrato di essere altamente efficiente nelle nostre mani, producendo centinaia di colonie per piastra, con pochi eventuali colonie presenti nel controllo unico vettore. Tale efficienza è fondamentale per mantenere la complessità durante la clonazione in pool. Un altro vantaggio dell’Assemblea di Gibson clonazione è che gli utenti non devono preoccuparsi circa la presenza di un enzima di restrizione tagliata sito nella Guida RNA stanno cercando di inserire il vettore di clonazione U6. Tuttavia, questo protocollo può essere adattato per tradizionale degli enzimi di limitazione basato clonazione se lo si desidera. Ricostituire i oligos guida RNA ad una concentrazione finale di 100 μM in acqua ultrapura (privo di RNasi, DNasi-free). Ci dovrebbe essere almeno 4 Guida separata RNA oligos per ogni area di interesse. Per ogni regione regolatrice di interesse, creare un pool di tutti i oligos corrispondente alla regione di interesse. In una provetta Eppendorf, unire 5 μL di ogni oligo RNA guida ricostituito individuale per ogni regione. Mescolare bene la piscina Vortex, poi rimuovere 1 μL e diluire questa aliquota 1: 200 in acqua ultrapura.Nota: Se lo si desidera, queste piscine targeting singole regioni regolatorie possono essere ulteriormente combinate per generare una complessa piscina targeting più regioni. Fino a 50 regioni regolarici possono essere mirate simultaneamente in un singolo pool (Figura 3). Eseguire una breve PCR con primers U6 per allegare regioni di omologia oligos prima del montaggio di Gibson. Circa 40 basi verranno aggiunto a ogni oligo, ottenendo un prodotto di ~ 100 bp che contiene sufficiente omologia al vettore U6 su entrambe le estremità. Per ogni guida di pool di RNA, impostare un 20 μL PCR con un mix master della polimerasi ad alta fedeltà e i seguenti componenti: 1 μL di oligo diluito piscina dal punto 3.2, 1 μL di U6 forward primer (10 μM), 1 μL di U6 reverse primer (10 μM) e fino a 20 μL di acqua. Incubare in un termociclatore con le seguenti condizioni: 98 ° C per 30 s, 10 cicli di (98 ° C per 10 s, 55 ° C per 30 s, 72 ° C per 2 min), 72 ° C per 5 min e tenere a 4 ° C. Eseguire 5 μL della reazione su gel di agarosio 1-2% con una scala di basso peso molecolare. Il prodotto finale dovrebbe essere ~ 100 basi (Figura 2). Ripulire la reazione di estensione con un kit di purificazione di DNA basata su colonne ed eluire in 20 μL di tampone di eluizione fornito nel kit.Nota: Poiché il prodotto è breve, evitare di utilizzare basati su tallone clean-up, che sono progettati per escludere piccoli frammenti meno di 100 bp. Quantificare il DNA purificato utilizzando un fluorimetro o spettrofotometro (previsto resa è 10-20 ng/μL). Guida RNA inserti possono essere conservati a-20 ° C, o possono essere utilizzati immediatamente in Assemblea di Gibson con un vettore linearizzato U6. Per preparare il destinatario U6 vettore di clonazione per assemblaggio di Gibson, impostare un digest di enzima di restrizione. Se molte reazioni di Gibson assembly devono essere eseguiti, impostare più digest per garantire sufficiente rendimento di taglio vettoriale. Utilizzare 20 unità di enzima AflII e 1 μg di plasmide in una reazione di 20 µ l con il buffer di enzima di restrizione appropriato. Incubare a 37 ° C per 1-2 ore. Ripulire il digest con perline o un kit basato su colonna per purificazione del DNA ed eluire in 20 μL di tampone di eluizione. Quantificare il DNA purificato utilizzando un fluorimetro o spettrofotometro. I campioni possono essere congelati a-20 ° C per un uso successivo. Eseguire il montaggio di Gibson sul vettore del preparato e inserire. Impostare Gibson Assemblea reazioni su ghiaccio. Uso 50 ng del vettore e 7 ng dell’inserto in una reazione di 20 μL. Diluire l’inserti 01:10 in acqua ultrapura per agevolare il pipettaggio. Impostare una vettore solo Gibson Assemblea reazione, utilizzando 50 ng del vettore e sostituire l’inserto con l’acqua. Incubare le reazioni di assemblaggio di Gibson per 15 min a 50 ° C, seguita da una sospensione a 4 ° C. Trasferire i prodotti assemblati in ghiaccio. Diluire i prodotti assemblati 1:4 in acqua ultrapura sul ghiaccio. Ad esempio, aggiungere 5 µ l di prodotto di assemblaggio di Gibson a 15 μL di acqua ultrapura. Trasformare i prodotti di assemblaggio Gibson diluiti. Scongelare le cellule competenti di alta efficienza sul ghiaccio e fare 25 aliquote del μL per ogni trasformazione. Se si desidera una complessa piscina più siti di targeting, scongelare abbastanza cellule in diverse provette per eseguire trasformazioni più indipendente della stessa piscina complesso gRNA. Per ogni prodotto diluito, aggiungere 1 μL di questa diluizione a un 1,7 mL provetta Eppendorf contenente 25 μL di cellule competenti. Mescolare brevemente sfogliando il tubo. Incubare le provette in ghiaccio per 30 min. Scossa di calore le cellule per 30 s a 42 ° C, quindi trasferire immediatamente in ghiaccio per 2 min. Aggiungere 300 μL SOC media (tryptone di 2%, 0,5% di Estratto di lievito, 10 millimetri di NaCl, 2.5 mM KCl, 10mm MgCl2, 10mm MgSO4e 20 mM glucosio) e lasciare che le celle recuperare per 1h a 37 ° C con agitazione (300 giri/min). Durante questo tempo, riscaldare le piastre di agar con ampicillina/carbenicillina a 37 ° C in un incubatore. Utilizzare una piastra per ogni trasformazione. Piastra 50 μL di cellule e posizionare le piastre in un incubatore a 37 ° C durante la notte. Per i pool di targeting per singoli siti, posto direttamente in 3-5 mL di brodo LB (Tabella materiali) contenente ampicillina/carbenicillina (1 mg/mL) e incubare per una notte con agitazione a 250 giri/min a 37 ° C per minipreps. Raccogliere le cellule e isolare il DNA. Per le librerie di RNA di grande guida targeting più siti, è possibile utilizzare un raschietto piatto per raccogliere tutte le colonie da ogni singola piastra in una maxiprep (coltura liquida 150 mL). Questo può essere facilitato da versando ~ 5 mL di LB con l’antibiotico adatto in un tubo falcon 50 mL e raschiare le colonie nel tubo. Per le raccolte siti individuali di targeting, raschiare le piastre in un miniprep (coltura liquida 3-5 mL). Incubare queste culture con l’antibiotico adatto per 3-5 h a 37 ° C con agitazione a 250 giri/min. Eseguire l’estrazione di DNA utilizzando un kit che si traduce in preps privo di endotossina. Quantificazione di DNA usando un fluorimetro o spettrofotometro. Plasmidi possono essere utilizzati immediatamente nella transfezione o conservati a-20 ° C per un uso futuro. Per confermare la presenza della sequenza di RNA di guida all’interno del vettore di U6 per piccole piscine targeting per singoli siti, utilizzare Sanger sequenziamento sul miniprep preparato con il primer “U6_PCR_R” elencati nella tabella 1. A causa di messa in comune di guida RNAs, alla sequenza di destinazione del 19 basepair gRNA produrrà basi miste, ma il promotore U6 e impalcatura di RNA guida che circondano questa sequenza dovrebbe essere intatti. 4. la transfezione di Enhancer-i Nota: Per il successo del blocco di un estrogeno risposta utilizzando Enhancer-i in cellule di Ishikawa, è necessario privare le cellule di estrogeno per 5-7 giorni prima della trasfezione di mantenerle in rosso fenolo libero RPMI con 10% carbone-spogliato FBS e 1% penicillina/streptomicina. Le cellule dovrebbero essere coltivate in questa media durante e dopo la trasfezione se cercando di bloccare una risposta di estrogeno. Si consiglia l’uso di rosso fenolo libero tripsina per passaggio di cellule in rosso fenolo completa gratuita RPMI. Il giorno prima di transfezione, piastra le cellule (wild-type o che esprimono stabilmente SID4X-dCas9-KRAB) in una piastra a 24 pozzetti al confluency di 30-50% (~ 60.000 cellule per pozzetto per cellule di Ishikawa). Piastra abbastanza cellule tale che transfezioni possono essere eseguite in duplicato e includono pozzi per trasfettate con guida controllo RNAs.  Assicurarsi che le celle sono distribuite uniformemente tra il pozzo agitando delicatamente la piastra dopo il placcaggio di cella come descritto al punto 1.1.7.Nota: Il presente protocollo si presuppone l’utilizzo di reagenti di transfezione di base di liposomi cationici. Elettroporazione fornisce un metodo alternativo per i tipi di cella che sono molto sensibili a questi reagenti. Condizioni di transfezione devono essere ottimizzate per la linea cellulare di interesse prima di tentare di esperimenti Enhancer-i. Il giorno seguente, preparare transfezioni seguendo le istruzioni del reagente di transfezione di scelta. Per cellule di Ishikawa, uso 550 ng di plasmide totale per ciascun pozzetto di una piastra a 24 pozzetti. Diluire i plasmidi a una concentrazione finale di 0.020 μg/μL in media privo di siero (1,1 μg di DNA in 52 μL di volume totale per trasfezione 2 pozzi). Utilizzare 3 μL di reagente di transfezione per ogni 1 μg di DNA, vortex e incubare come descritto al punto 1.2. Aggiungere 25 µ l della miscela finale ad ogni pozzetto.Nota: Per combinazioni di destinazione dei siti, utilizzare lo stesso peso del plasmide per ogni singolo sito e quindi riempire il peso rimanente con un plasmide di controllo (RNA guida vuoto clonazione vettoriale o guida RNAs destinazione è un’area di controllo negativo come IL1RN promotore). Per transfezioni transienti, utilizzare un rapporto di plasmide di RNA di 3:2 Cas9 fusione: Guida. Plasmidi contenenti reporter fluorescenti possono essere aggiunti per monitorare l’efficienza di trasfezione. A transfezione di post 36H, cambiare il supporto utilizzando rosso fenolo RPMI con 10% carbone-spogliato FBS e 1% penicillina/streptomicina (per cellule di Ishikawa) e la fornitura gratuita con puromicina (concentrazione finale: 1 μg/mL) e neomicina (concentrazione finale: 300 ng/mL). Se le cellule sono sensibili al reagente di transfezione, il supporto può essere modificato in precedenza, ma antibiotici devono essere aggiunto non prima di transfezione post 24 h.Nota: Attendere almeno 24 ore dopo l’aggiunta di antibiotico prima della raccolta di cellule. Cambiamenti di espressione a causa di Enhancer-i possono essere rilevati come presto come 48h post transfezione e fino a 5 giorni dopo trasfezione. Se lavora con cellule di Ishikawa che sono state private di estrogeno, eseguire un’induzione 8-h 10 nM 17 β-estradiolo (E2) il giorno dopo il trattamento antibiotico e quindi raccogliere le cellule immediatamente. 5. cellula di raccolta ed estrazione del RNA Preparare il tampone di lisi con 1% β-mercaptoetanolo (BME). Assicurarsi che ci sia abbastanza miscela di lisi-BME (300 μL per ogni bene che la raccolta). Aspirare il supporto utilizzando un aspiratore. Lavare le cellule una volta con un volume uguale di PBS 1X (500 μL) e aspirare a rimuovere quanto più PBS come possibile. Aggiungere 300 μL di soluzione di lisi-BME ad ogni pozzetto usando una pipetta multicanale. Dispensare la soluzione di lisi su e giù 8 – 10 volte e il trasferimento a un profondo-piastra o 1,7 mL Eppendorf tubi sul ghiaccio. RNA possa essere estratti immediatamente, o lisati possono essere congelati a-80 ° C per elaborazioni future. Per estrarre RNA da lisati, utilizzare un kit disponibile in commercio che include un trattamento della dnasi. Eluire nel più piccolo volume consigliato di acqua ultrapura (privo di RNasi, DNasi-free) o eluizione buffer e quantificare il RNA. Per un piccolo numero di campioni, utilizzare un fluorimetro o spettrofotometro. Per un gran numero di campioni, utilizzare una sonda fluorescente che rileva RNA e misura su un lettore di piastra. I campioni possono essere congelati a-80 ° C prima o dopo la quantificazione. 6. quantificare i cambiamenti di espressione genica utilizzando uno stadio qPCR e RNA-seq Ottenere qPCR primer per i geni di interesse e per le pulizie almeno un gene che è espresso vicino al livello del gene targeting e non cambia in condizioni sperimentali. Idealmente, questi iniettori si estendono in una giunzione esone-esone per evitare l’amplificazione di DNA genomic. Prova questi iniettori su RNA ottenuto dalla linea cellulare di interesse. Uso sciogliere l’analisi delle curve per verificare la produzione di un singolo prodotto. Se non viene prodotto un unico prodotto, prova coppie di primer aggiuntive. Per ogni campione di RNA trattato Enhancer-i e controllo di guida, identificare quanti geni devono essere dosati in quel campione. Questo insieme di geni dovrebbe includere geni housekeeping, quali CTCF o GAPDH. Impostare qPCR reazioni. Diluire i campioni tutti alla stessa concentrazione in acqua, tale che 50 ng di RNA totale è facilmente dispensato e c’è abbastanza diluito RNA per ogni reazione. Ad esempio, diluire RNA a ~16.6 ng/μL e utilizzare 3 μL di RNA in ogni reazione. Tenere RNA su ghiaccio durante l’impostazione master mix. Preparare il mix master separati per ogni gene deve essere misurata usando i corredi qPCR commercialmente disponibile One-Step. Utilizzare un volume di reazione di 20 μL con 1 μL di ogni primer (soluzione madre di 10 μM). Impostare queste reazioni su ghiaccio. In una piastra di reazione che è appropriata per il termociclatore, aggiungere campioni di RNA seguiti da master mix. Sigillare con un foglio sigillante e mescolare delicatamente nel Vortex o pipettaggio. Centrifugare brevemente la piastra (140 x g per 60 s) affinché quel liquido è presso il fondo dei pozzetti. Incubare la piastra in un termociclatore come segue (o come kit incarica): 48 ° C per 30 min, 95 ° C per 10 min, 40 cicli di (95 ° C per 15 s, 60 ° C per 1 min). Ottenere i valori di Ct per ogni gene misurata all’interno di ogni campione. Utilizzare il metodo comparativo di Ct per identificare i cambiamenti nell’espressione genica. Sottrarre il Ct del gene delle pulizie da Ct di ogni gene di interesse per ogni campione per generare valori normalizzati di Ct. Per i campioni di controllo trattato, prendere una media dei valori di Ct normalizzati per ciascun gene. Registro base 2-scala pieghevole repressione quindi può essere calcolato sottraendo l’esempio Enhancer-i trattati normalizzata Ct per ogni gene dallo stesso valore per il campione di controllo trattato per il gene corrispondente. Per determinare cambiamenti nell’espressione genica Enhancer-i trattamento seguente, è necessario preparare i campioni per la sequenza di RNA utilizzando un kit disponibile in commercio compatibile con tecnologia di sequenziamento dell’utente. Uso ~ 500 ng di RNA per il materiale di partenza e preparare le librerie per almeno 2 repliche biologiche. 7. Verifica di Targeting genomici specifici di SID4X-dCas9-KRAB utilizzando ChIP-seq Nota: La proteina di fusione SID4X-dCas9-KRAB contiene sia un tag di epitopo FLAG e un tag di epitopo HA, ma migliori risultati per ChIP-seq sono stati ottenuti con gli anticorpi anti-FLAG. Se lo si desidera, l’utente può eseguire ulteriori esperimenti di ChIP-seq per fattori di trascrizione potenzialmente interessati da Enhancer-i, o per H3K27ac, un segno di attività enhancer che è diminuito da Enhancer-io. Tuttavia, ogni esperimento ChIP-seq richiede 10 x 106 celle, quindi pianificare di conseguenza. Transfect cellule con piscine Enhancer-i. Piastra 10 x 106 cellule in un piatto di coltura del tessuto di 15 cm. Ogni piatto rappresenta 1 ChIP-seq esperimento per 1 fattore di interesse. Il giorno seguente, transfect le celle utilizzando 20 μg di DNA totale per ogni piatto. Per transfezioni nelle linee cellulari che esprimono stabilmente SID4X-dCas9-KRAB, il DNA deve essere un pool di plasmide di guida RNAs targeting per tutti i siti di interesse e, facoltativamente, un plasmide di espressione della proteina fluorescente. Per transfezioni transienti, utilizzare un rapporto di pool di RNA proteina: Guida di 3:2 dCas9 fusione. Per ChIP-seq di altri TFs o modificazioni istoniche, eseguire almeno una trasfezione di guida RNA di controllo aggiuntivo su un altro piatto. Trattare i piatti con con puromicina (1 μg/mL) e neomicina (300 ng/mL) a transfezione post 24-48 h. Attendere almeno 24 ore prima della raccolta della cromatina. Cromatina raccolto dai piatti.Nota: Per studiare gli effetti di Enhancer-i su associazione genomiche di ER in cellule di Ishikawa, eseguire un trattamento di 1 ora e 10 nM E2 su piatti transfected con guida controllo RNAs ed Enhancer-i prima della vendemmia. Per studiare gli effetti di Enhancer-i su H3K27ac, eseguire un 8 h 10 nM E2 induzione su piatti transfected con guida controllo RNAs ed Enhancer-i prima della vendemmia. Applicare 500 μL di formaldeide al 37% per ogni piatto (concentrazione finale dell’1%). Agitare brevemente le piastre. Lasciate che le piastre riposare a temperatura ambiente per 10 min. Aggiungere 1 mL di 2,5 M glicina (concentrazione finale di 125 mM). Agitare brevemente le piastre. Versare i media con formaldeide e glicina. Aggiungere un volume equivalente (~ 20 mL) di PBS 1X freddo. Versare il PBS. Aspirare con un aspiratore per rimuovere quanto più PBS come possibile. Mettere i piatti sul ghiaccio. Aggiungere 3-5 mL di freddo 1X PBS o Farnham buffer di lisi (5 millimetri tubi pH 8.0, 85 mM KCl, 0,5% NP-40) con 1 x inibitore della proteasi (aggiunta appena prima dell’uso) per ogni piatto. Raschiare il piatto con un raschietto piatto e trasferire la soluzione in una provetta conica da 15 mL sul ghiaccio. A pellet della cromatina di filatura giù tubi in una centrifuga per 5 min a 4 ° C a 1000 x g. gettare il surnatante e memorizzare i pellet a-80 ° C per un uso futuro o procedere con il protocollo del ChIP-seq di scelta utilizzando un anticorpo anti-FLAG o anticorpi targeting altro fattori di trascrizione o le modifiche dell’istone di interesse (H3K27ac, H3K9me3).