דיסקציה של משפר תפקוד באמצעות הפרעות משפר מבוססי CRISPR מולטיפלקס בשורות תא

1. דור של תא קווים Stably לבטא SID4X-dCas9-קראב הערה: התנאים תרביות תאים וריכוזי סמים המובאת כאן מוטבו עבור תאים אישיקאווה, קו התא סרטן רירית הרחם, גדל בתקשורת RPMI 1640 בתוספת 10% FBS ו 1% פניצילין/סטרפטומיצין (RPMI מלאה). שורות תאים אחרים עשויים לדרוש תנאים שונים תרביות תאים וריכוזי סמים. משתמשים יכולים לבצע גם תקנים ארעי ניסויים בתאי פראי-סוג, במקום לייצר קו תא יציבה, עם פלסמיד לבטא SID4X-dCas9-קראב יחד עם מדריך RNA לבטא פלסמידים; עם זאת, תוצאות transfections ארעי ייתכן שתתקשה להתרבות כמו SID4X-dCas9-קראב רמות עשויה להשתנות לפי תקנים. צלחת אישיקאווה תאים בבארות לפחות 2 של צלחת 6-ובכן-זרימה 30-50% (כ 300,000 אישיקאווה תאים) ב- 3 מ”ל של RPMI מלאה. האחות המדיה מן התאים. לשטוף את התאים פעם אחת עם 1 x PBS (pH 7.4). האחות של PBS ולהוסיף טריפסין (4 מ ל צלחת 10 ס מ או 5 מ עבור בקבוקון T-75). דגירה התאים ~ 5 דקות ב 37 מעלות צלזיוס, בדיקת כל 2 דקות עבור תאים מנותקת ורעדתי בעדינות את הכלי. ברגע תאים יש תלושים, פיפטה trypsinized תאים לכל אורך כמה שעות, פיפטה בעדינות במורד הצד של כלי השיט לשחרר תאים המצורפת. להעביר את התאים צינור חרוטי 15 מ”ל, ספין התאים למטה במשך 5 דקות ב 250 x g. האחות של טריפסין, resuspend את התאים ב- 5-10 מ”ל של מדיה. השתמש פיפטה של P1000 מביצועם תא גושים במידת הצורך. לספור את התאים ולקבוע את אמצעי האחסון הדרושים כדי צלחת ~ 300,000 תאים לכל באר הנפח הכולל של 3 מ. להוסיף את התאים 2 בארות נפרדים של צלחת 6-. טוב. למלא כל אחד טוב עד 3 מ”ל עם RPMI מלאה. לנער בעדינות את הצלחת כל 5 דקות הראשון באינטרקום לאחר ציפוי כדי להבטיח כי התאים מופצים בצורה שווה על הצלחת. השתמש במיקרוסקופ כדי להבטיח כי התאים התפזרו מהאמצע של הבאר. בתוך 24 שעות של ציפוי, לבצע את transfections הבאות באמצעות ריאגנט של תרביות תאים המתאימים עבור שורת תאים של עניין. עבור תאים אישיקאווה, השתמש בהליך כמתואר להלן.הערה: פרוטוקול זה מבוסס על ההנחה השימוש ריאגנטים cationic ליפוזום מבוססות תקנים. אלקטרופורציה מספק שיטה חלופית עבור סוגי תאים אשר רגישים מאוד ריאגנטים אלה או זה להפגין יעילות נמוכה תרביות תאים עם lipofection. חייב להיות מוטבת תנאים תקנים עבור שורת תאים עניין לפני שתנסה ניסויים Enhancer-i. ב- mL 1.7 גלאים שפופרת, למהול 2.5 μg של SID4X-dCas9-קראב פלסמיד ו-800 ng של פלסמיד ביטוי חלבון פלואורסצנטי לתוך המדיה ללא סרום כך שאמצעי האחסון האחרון בצינור 155 µL והוא הריכוז הסופי של פלסמיד µg 0.020/µL. צינור אחר, µg 3.3 שתדללו של פלסמיד שאינו מכיל קלטת התנגדות neomycin, כגון pCMV-GFP, בתקשורת ללא סרום כך שאמצעי האחסון האחרון בצינור 155 µL הריכוז הסופי של פלסמיד הוא µg 0.020/µL. מערבולת כל צינור בקצרה, ספין למטה באמצעות של microfuge. להוסיף µL 9.9 מהתרכובת תרביות תאים (טבלה של חומרים) כל שפופרת. מערבבים על-ידי vortexing בקצרה על מהירות נמוכה. ספין הצינורות למטה עם microfuge. דגירה הצינורות בטמפרטורת החדר במשך לפחות 5 דקות, אך לא יותר מ 20 דקות. ב אבטחה הקבינט, להוסיף 150 µL של המיקס דנ א מוכן: ריאגנט dropwise טוב על הצלחת 6-. טוב. חזור על הצינור השני של DNA: ריאגנט מוכן לערבב. לערבב את הצלחות על ידי מתערבל בעדינות את הצלחת ולחזור החממה. יום 2 פוסט תרביות תאים, לשנות את המדיה, להשלים עם G418 כדי ריכוז סופי של 600 ng/μL. ריכוז זה ייתכן שתצטרך להיות ממוטבים עבור סוג התא. שנה מלאה RPMI מדיה, להשלים עם G418 בכל יום אחר במשך 2-4 שבועות עד התאים בקרה transfected מתים ולהיות הבארות המכיל SID4X-dCas9-קראב confluent. הסכום המדויק הנדרש בתאים לשחזר תלויות זמן הכפלה של התאים. כאשר התאים הופכים confluent, המעבר אל קיבול T-25 או T-75, השלימו RPMI עם מינון נמוך של G418 (300 ng/μL עבור תאים אישיקאווה). במהלך המסע, להפוך aliquots 2 ~ 100,000 תאים כל (בערך 1/10בתאנון של צלחת 6-ובכן) לתוך 2 צינורות ריפרבאן מ”ל 1.7 נפרד לבידוד RNA ו- DNA, בהתאמה. לסובב את הצינורות האלה למטה (5 דקות, 250 גרם x), להסיר טריפסין על-ידי pipetting, להקפיא את הצינורות ב-20 ° C לשימוש עתידי. לבודד דנ א גנומי באמצעות ערכות זמינים מסחרית ולבצע PCR בעזרת “pAC95_PCR” או “SID4X_PCR” תחל (טבלה 1) כדי לוודא המצאות חלבון כימרי בתוך הקו הסלולרי. השתמש דנ א גנומי שחולצו מן הקו הורים כפקד שלילית, SID4x-dCas9-קראב פלסמיד DNA כפקד חיובי. השתמש תערובת בסיס אמינות גבוהה פולימראז עם 50-100 ננוגרם של הדנ א, רכיבה על אופניים התנאים הבאים: 98 ° C ל 30 s, 25 מחזורי של (98 ° C עבור 10 s, 58 ° C ל 30 s, 72 מעלות צלזיוס למשך 2 דקות), 72 מעלות צלזיוס למשך 5 דקות , תחזיק על 4 מעלות צלזיוס. כדי לוודא את הביטוי של החלבון פיוז’ן ברמת ה-RNA, לבצע qPCR עם ה-RNA שחולצו מן הקו הסלולרי באמצעות ערכות זמינים מסחרית. השתמש תחל את “dCas9_qPCR” (טבלה 1), פרוטוקול qPCR בשלב אחד מספק בשלב 6.3 של פרוטוקול זה. כדי לוודא הביטוי ברמת חלבון של היתוך גרעיני, לבצע מערבון ביחסינו lysates מתוך שורת תאים. השתמש נגד דגל או אנטי-HA נוגדנים כדי לזהות את החלבון פיוז’ן. 2. מדריך RNA עיצוב הערה: פרוטוקול זה מיועד לשימוש עם הרנ א מדריך U6 שיבוט וקטורית שנוצרה על ידי המעבדה הכנסייה וזמין על Addgene (Addgene 41824). כדי ליצור גרסה של זה וקטורית שמכילה התנגדות puromycin המותרת באותה אסטרטגיה שיבוט כמו 41824, עברנו מרובים באתר שיבוט זה לתוך הווקטור pGL3-U6-sgRNA-PGK-puromycin (Addgene 51133). Addgene 41824 או את הגרסה שלנו עם puromycin (Addgene 106404) תואמים האסטרטגיה שיבוט המפורטות להלן. להשיג basepairs 600-900 של רצף ה-DNA לכל אזור הרגולציה של עניין. השתמש אתרי קישור פקטור שעתוק ו/או נגישות כרומטין להנחיה היכן להגדיר את האזור של הריבית (איור 2 א).הערה: בזמן הדוגמה באיור 2 א כולל משפרי ויוצאת, זה גם אפשרי למקד את הרגולציה אלמנטים ממוקם בתוך אינטרונים. מקם כל רצפי שהושג בקובץ טקסט יחיד באמצעות התבנית FASTA. לזהות אחד לפחות אזור בקרה שלילית זה לא צפוי להשתנות במהלך ניסיוני תנאים, כגון אדם המקדם את גן כי אינו מתבטא בשורה תא של ריבית. להשיג את רצף ה-DNA עבור אזור זה ולהוסיפו לקובץ טקסט בתבנית FASTA.הערה: אנו משתמשים מדריך RNAs מיקוד יזם IL1RN 25 כפקד שלילי עבור כל האזורים שאנחנו היעד. המשתמשים יכולים גם לבחור רצף intergenic ליד האזור עניין שאינו מכיל אתרי קישור פקטור שעתוק כפקד שלילי. עם זאת, אם הם מהווים מטרה לוקוסים מרובים בו זמנית, אזור שליטה שלילי יחיד מפשט עיצוב ניסיוני, פרשנות של תוצאות. אם משפר יישוב intronic, ייתכן מועיל למטרה אזור intronic-מיקומה אותו שאינו מכיל רכיב תקינה בשם בתור פקד שליליים נוספים, כמו הפיוז’ן dCas9 עלולים להפריע שעתוק. לזהות אזורים בקרה חיובית, כגון היזמים כי הם המטרות בשם של האזורים הרגולציה של עניין או היזמים של גנים אשר הם מאוד עיבד בשורת תאים של ריבית. להשיג את רצף ה-DNA עבור אזורים אלה והוסף אותו בקובץ טקסט בתבנית FASTA. השתמש בתוכנית כגון e-פריך26 (http://www.e-crisp.org/E-CRISP/) רצפי DNA שנוצר כדי למצוא את המדריך RNAs עם נמוך את המטרות (אידיאלי 0-3). מדריך RNAs מורכב 20 נוקלאוטידים במעלה הזרם של protospacer הסמוך מוטיב (פאם), אשר לוקח את הטופס “הגולה” עבור dCas9 מ ס הפישחה ינפל תומימת. באתר e-פריך, בחר את האורגניזם עניין שימוש בתפריט הנפתח. מכלול הגנום מופיע בצד ימין של השם מינים. בחר בלחצן האפשרות קלט הוא FASTA רצף . העתק את רצפי FASTA מלמעלה, והדבק אותם בתיבת הדו-שיח. ודא כותרת FASTA כלולות עבור כל רצף.הערה: עד 50 רצפים יכול להיות שאילתה בעת ובעונה אחת. בחר בלחצן האפשרות בינונית את עיצוב יחיד בתפריט הנפתח. לחץ על הלחצן התחל חיפוש sgRNA. כרטיסיה חדשה של הדפדפן יפתח, יוצגו תוצאות. הורד את רצפי המועמד על-ידי לחיצה על לחצן הורד דוח טבלאי של Excel מעוצב על כל רצפי השאילתה יחד. פתח את דוח טבלאי באמצעות Excel, או בתוכנית לעריכת טקסט. השתמש את הדפדפן הגנום UCSC בלאט המועמד gRNA באורך מלא רצפים (23 basepairs) כדי הגנום. בדפדפן, נווט אל אתר דפדפן הגנום UCSC (http://genome.ucsc.edu). תחת המקטע הכלים שלנו, לאתר את המילה BLAT ולחץ על זה. הכלי חיפוש בלאט יפתח. השתמש בתפריטים הנפתחים ממוקם מתחת לטקסט בלאט חיפוש הגנום כדי לבחור את מכלול אורגניזם ו גנום של עניין. העתק את רצפי RNA מדריך מהדוח טבלאיים שנוצרו על ידי e-פריך, והדבק אותם בתיבת הדו-שיח. ודא כי כל רצף יש כותרת עליונה FASTA ייחודי, ואז לחץ על Submit בתחתית תיבת הדו-שיח.הערה: עד 25 רצפים יכולים להיבדק בעת ובעונה אחת. בדף תוצאות החיפוש בלאט , יופיע במערכים של כל מדריך רצף ה-RNA, עם כל שורה מייצגת ישור. באופן אידיאלי, צריך להיות יישור אחד עבור כל מדריך RNA, המציין את הייחודיות של המדריך RNA. למנוע את קווי יישור שמיישרים במספר מיקומים הגנום במידת האפשר. לבחון מדריך RNA לוקליזציה והפצה בתוך האזור בעל עניין, לחץ על הקישור הדפדפן תחת המקטע פעולות לאחד RNAs מדריך המאוחזרים. הדפדפן הגנום יופיע ואת ימורכז על המדריך שנבחר RNA. השתמש בלחצנים התרחקות בחלק העליון של הדף כדי להמחיש את ההפצה של אחרים מדריך RNAs המזוהה על-ידי e-פריך בתוך האזור של ריבית. בחר 4 רצוי שאינם חופפים מדריך RNA רצפים המופצים ברחבי האזור בעל עניין (איור 2B). אם האזור של ריבית עולה 600 bp, שקול להוסיף 1-2 מדריכים נוספים. הימנע מדריך RNAs עם homopolymeric נמתח, תוכן קיצוני GC, כמו תכונות אלה יכולים לעכב את הרנ א מדריך שכפול התהליך ולהפחית RNA מדריך מיקוד יעילות. ברגע המדריכים נבחרו, ליצור קובץ המכיל את המדריך המלא רצף ה-RNA (23 נוקלאוטידים) עבור כל מדריך הרצוי ולאחר מכן הסר את נוקלאוטיד 5′, כמו גם את פאם (הגולה) מקצה 3′. שלב זה מאפשר הזמנת oligo. להוסיף את הרצף הבא לסוף 5′ של הרצף oligonucleotide: GTGGAAAGGACGAAACACCG. להוסיף את הרצף הבא לסוף 3′ של הרצף oligonucleotide: GTTTTAGAGCTAGAAATAGC.הערה: הרצף הסופי צריך להיות נוקלאוטידים 59 זמן תראה ככה: GTGGAAAGGACGAAACACCG-יעד (19 nt)-GTTTTAGAGCTAGAAATAGC. להבטיח שלכל רכיב רגולטורי כדי להיות ממוקד עם משפר-i יש לפחות 4 oligonucleotides ייחודי המיועד לכך. להזמין את רצפי אלה יחד עם תחל “U6_internal” המופיעים בטבלה 1. 3. מדריך RNA שיבוט הערה: מדריך RNA שכפול באמצעות הרכבה גיבסון הוכיחה להיות יעילים ביותר בידיים שלנו, מניב מאות מושבות לכל צלחת, עם נוכח השליטה היחידה וקטור מעטים אם בכלל מושבות. יעילות כזה חיוני לשמירה על מורכבות במהלך שכפול במאגר. יתרון נוסף של גיבסון הרכבה שיבוט הוא למשתמשים אין מה לדאוג הנוכחות של אנזים ההגבלה לחתוך האתר במדריך RNA הם מנסים להכניס הווקטור שיבוט U6. למרות זאת, פרוטוקול זה ניתן להתאים עבור מסורתי אנזים הגבלה המבוסס על שיבוט במידת הצורך. לשקם מדריך RNA oligos-ריכוז סופי של 100 μM במים הנדסה גנטית (RNase-חופשית, נטולת DNase). צריך להיות לפחות 4 מדריך נפרד RNA oligos עבור כל אזור בעל עניין. עבור כל אזור הרגולציה של עניין, ליצור מאגר של כל oligos המתאים לאזור של ריבית. בשפופרת גלאים, לשלב 5 μL של כל oligo RNA מדריך משוקם נפרדים עבור כל אזור. לערבב את הבריכה היטב על ידי vortexing, ולאחר מכן להסיר את 1 μL, לדלל את 1:200 aliquot במים הנדסה גנטית.הערה: אם רצונך בכך, בשלוליות פילוח אזורי רגולטוריות בודדים ניתן עוד יותר לשלב כדי ליצור בריכה מורכבים מיקוד אזורים מרובים. עד 50 אזורים רגולטוריות עשויות להיות ממוקדות בו-זמנית בבריכה יחיד (איור 3C). לבצע PCR קצר עם תחל U6 לצרף הומולוגיה אזורים oligos לפני ההרכבה גיבסון. בסיסים כ-40 יתווספו כל oligo, מניב מוצר bp ~ 100 המכיל הומולוגיה מספיקות כדי הווקטור U6 בשני הקצוות. מדריך כל בריכה RNA, להגדיר μL 20 PCR עם תערובת בסיס אמינות גבוהה פולימראז, הרכיבים הבאים: 1 μL של הבריכה oligo מדולל מהשלב 3.2, μL 1 של פריימר לפנים U6 (10 μM), μL 1 של U6 הפוך פריימר (10 μM) , מים μL עד 20. דגירה ב הצנטרפוגה תרמי עם התנאים הבאים: 98 ° C ל 30 s, 10 מחזורים של (98 ° C עבור 10 s, 55 ° C ל 30 s, 72 מעלות צלזיוס למשך 2 דקות), 72 מעלות צלזיוס במשך 5 דקות, והחזק ב 4 º C. הפעל μL 5 התגובה על 1-2% agarose ג’ל עם סולם נמוך משקל מולקולרי. המוצר הסופי צריך להיות ~ 100 basepairs (איור 2C). לנקות את התגובה הרחבה עם ערכת טיהור DNA מבוססי עמודה, elute, μL 20 • תנאי מאגר המסופק בערכה.הערה: כמו המוצר הוא קצר, הימנע משימוש מבוסס-חרוז לנקות קופצים, אשר נועדו לשלול שברים קטנים במרחק של פחות מ 100 bp. לכמת את ה-DNA מטוהרים באמצעות fluorometer או ספקטרופוטומטרים (מצופה התשואה הוא 10-20 ng/μL). מדריך RNA מוסיף שניתן לאחסן ב-20 ° C, או יכול לשמש מיד בהרכבה גיבסון עם וקטור U6 ליניארית. כדי להכין את המטופל U6 וקטור שיבוט להרכבה גיבסון, להגדיר את תקציר אנזים הגבלה. אם תגובות רבות של הרכבה גיבסון לביצוע, להגדיר מעכל מרובים כדי להבטיח תשואה מספקת של וקטור לחתוך. השתמש 20 יחידות של האנזים AflII μg 1 של פלסמיד בתגובה 20 μL עם המאגר אנזים הגבלה המתאים. דגירה ב 37 מעלות צלזיוס במשך 1-2 h. לנקות את התקציר עם חרוזים או ערכת מבוססי עמודה עבור טיהור DNA, elute ב μL 20 • תנאי המאגר. לכמת את ה-DNA מטוהרים באמצעות fluorometer או ספקטרופוטומטרים. דוגמאות שיכול להיות קפוא ב-20 ° C לשימוש מאוחר יותר. לבצע הרכבה גיבסון על וקטור מוכן והכנס. להגדיר את גיבסון הרכבה תגובות על קרח. שימוש 50 ng של וקטור ו- 7 ננוגרם של הקדמי בתגובה 20 μL. לדלל 1:10 מוסיף במים הנדסה גנטית כדי להקל על pipetting. להגדיר את וקטור היחידה גיבסון הרכבה ריאקציה, באמצעות 50 ng של וקטור, מחליף את תותב עם מים. דגירה גיבסון מכלול התגובות למשך 15 דקות ב 50 מעלות צלזיוס, ואחריו אחיזה ב 4 º C. להעביר את המוצרים מורכבים לקרח. לדלל את המוצרים מורכבים 1:4 במים הנדסה גנטית על קרח. לדוגמה, הוסף 5 μL של גיבסון הרכבה מוצר 15 μL של מים הנדסה גנטית. להפוך את המוצרים מכלול גיבסון מדולל. הפשרת תאים המוסמכת יעילות גבוהה על קרח ולהפוך aliquots 25 μL עבור כל שינוי. אם בריכה מורכבים מיקוד באתרים מרובים רצוי, להפשיר מספיק תאים לתוך צינורות שונים כדי לבצע העתקות עצמאיות מרובות באותה הבריכה gRNA מורכבים. עבור כל מוצר מדולל, להוסיף 1 μL של זה דילול mL 1.7 גלאים שפופרת המכילה 25 μL של תאים המוסמכת. מערבבים על ידי מצליף בקצרה את הצינור. דגירה הצינורות על קרח למשך 30 דקות. חום לזעזע את התאים עבור 30 s-42 ° C, ואז להעביר מיד קרח למשך 2 דקות. הוספת μL 300 SOC מדיה (2% טריפטון, 0.5% תמצית שמרים, 10 מ מ NaCl, 2.5 מ מ. אשלגן כלורי, 10 מ מ MgCl2, 10 מ מ MgSO4ו- 20 מ מ גלוקוז) ולתת את התאים לשחזר עבור h 1 ב 37 ° C עם טלטול (300 סל ד). במהלך תקופה זו, חמים צלחות אגר עם אמפיצילין/carbenicillin עד 37 מעלות צלזיוס בתוך אינקובטור. השתמש לוח אחד עבור כל שינוי. צלחת μL 50 תאים ולמקם את הצלחות חממה 37 ° C בלילה. הבריכות מיקוד אתרים בודדים, במקום ישירות ב- 3-5 מ ל מרק ליברות (טבלה של חומרים) המכיל אמפיצילין/carbenicillin (1 מ”ג/מ”ל), דגירה בין לילה ברעידות-250 סל”ד ב 37 ° C עבור minipreps. לקצור את התאים, לבודד דנ א. עבור ספריות RNA גדול מדריך מיקוד באתרים מרובים, להשתמש במגרדת צלחת של איסוף כל המושבות שהלוח בודדים לתוך אחד maxiprep (150 מ ל נוזל תרבות). זה ניתן להקל על ידי שפיכת ~ 5 מ של ליברות עם האנטיביוטיקה המתאימה לתוך צינור בז 50 מ ל ולשרוט את המושבות לתוך הצינור. עבור ספריות מיקוד אתרים בודדים, לגרד את הצלחות לתוך miniprep (3-5 מ ל נוזל תרבות). דגירה תרבויות אלה עם האנטיביוטיקה המתאימה עבור h 3-5 ב 37 מעלות צלזיוס ברעידות-250 סל”ד. לבצע הפקת דנ א באמצעות ערכה שתוצאתו נטולת אנדוטוקסין preps. לכמת הדנ א באמצעות fluorometer או ספקטרופוטומטרים. פלסמידים יכולים להיות בשימוש מיד תרביות תאים או המאוחסנים ב-20 ° C לשימוש עתידי. לאשר הנוכחות של מדריך רצף ה-RNA בתוך הווקטור U6 בריכות קטנות מיקוד אתרי יחיד, להשתמש סנגר רצף-miniprep מוכן עם פריימר “U6_PCR_R” מפורטות בטבלה 1. בשל איגום של מדריך RNAs, הרצף היעד 19 basepair gRNA תניב בסיסים מעורבת, אבל המקדם U6 ואת מדריך RNA לגרדום המקיפים את הרצף הזה צריך להיות שלם. 4. תקנים של שיפור-i הערה: עבור המצור מוצלחת מתגובה אסטרוגן באמצעות שיפור-i בתאים אישיקאווה, זה הכרחי כדי לשלול את התאים של אסטרוגן במשך 5-7 ימים לפני תרביות תאים על ידי שמירה על אותם פנול אדום חינם RPMI עם 10% פחם-הפשיטו FBS ו- 1% פניצילין/סטרפטומיצין. התאים צריכים להיות מחונן בתקשורת זו במהלך ואחרי תרביות תאים אם מנסה לחסום מענה אסטרוגן אנו ממליצים על השימוש של טריפסין חינם פנול אדום עבור המעבר של תאים מלאה פנול אדום חינם RPMI. יום לפני תרביות תאים, צלחת התאים (פראי-סוג או לבטא stably SID4X-dCas9-קראב) לתוך צלחת 24-ובכן-30-50% confluency (~ 60,000 תאים לכל טוב עבור תאים אישיקאווה). צלחת מספיק תאים כך transfections ניתן לבצע שכפול, והם כוללים בארות כדי להיות transfected עם שליטה מדריך RNAs.  ודא כי התאים הם מופץ באופן שווה על פני הבאר ע י ניעור בעדינות את הצלחת לאחר יופיצ תא כמו שלב 1.1.7.הערה: פרוטוקול זה מבוסס על ההנחה השימוש ריאגנטים cationic ליפוזום מבוססות תקנים. אלקטרופורציה מספק שיטה חלופית עבור סוגי תאים הרגישים מאוד ריאגנטים אלה. חייב להיות מוטבת תנאים תקנים עבור שורת תאים עניין לפני שתנסה ניסויים Enhancer-i. למחרת, להכין את transfections לפי הוראות של תרביות תאים הכימית של בחירה. עבור תאים אישיקאווה, שימוש 550 ng של פלסמיד הכולל עבור כל טוב של צלחת 24-. טוב. לדלל את פלסמידים כדי ריכוז סופי של μg/μL 0.020 בתקשורת ללא סרום (1.1 μg של ה-DNA ב- 52 μL של הנפח הכולל למעיינות 2 transfecting). השתמש μL 3 של ריאגנט תרביות תאים עבור כל μg 1 של ה-DNA, מערבולת דגירה כפי שמתואר בשלב 1.2. להוסיף 25 μL של התערובת הסופית מכל קידוח.הערה: כדי שילובים היעד של אתרים, השתמש באותו המשקל של פלסמיד עבור כל אתר בודדים ולאחר מכן למלא את המשקל שאריות עם פלסמיד שליטה (RNA מדריך ריק שיבוט וקטוריים או מדריך RNAs פילוח אזור בקרה שלילית כגון IL1RN יזם). לשימוש transfections ארעי, יחס של 3:2 Cas9 פיוז’ן: מדריך RNA פלסמיד. ניתן להוסיף פלסמידים המכיל כתבים פלורסנט לפקח על תרביות תאים יעילות. ב 36 h פוסט תרביות תאים, לשנות את התקשורת באמצעות פנול אדום חינם RPMI עם 10% הפשיטו פחם FBS ו 1% פניצילין/סטרפטומיצין (עבור תאים אישיקאווה) והענק puromycin (הריכוז הסופי: 1 μg/mL) ו neomycin (ריכוז סופי: 300 ng/mL). אם תאים רגישים ריאגנט תרביות תאים, התקשורת ניתן לשינוי מוקדם יותר, אך יש להוסיף אנטיביוטיקה לא מוקדם יותר תקנים פוסט 24 שעות ביממה.הערה: המתן לפחות 24 שעות לאחר הוספת אנטיביוטיקה לפני קציר תאים. שינויים בביטוי עקב שיפור-i יכול להתגלות מוקדם ככל 48 שעות פוסט תרביות תאים, עד 5 ימי פוסט תרביות תאים. אם עובדים עם תאים אישיקאווה נמנעו של אסטרוגן, ביצוע של 8-h 10 nM 17β-אסטרדיול (E2) אינדוקציה יום אחרי טיפול אנטיביוטי, ואז לקצור תאי מיד. 5. תא המסיק והפקת RNA להכין מאגר פירוק עם 1% β-mercaptoethanol (BME). ודא שיש מספיק תערובת פירוק-BME (300 μL עבור כל טוב שנקטפו). האחות התקשורת באמצעות ליניקת אבק. לשטוף את התאים פעם אחת עם אמצעי אחסון שווה ל- 1 x PBS (500 μL), לשאוב כדי להסיר כמה שיותר PBS ככל האפשר. להוסיף 300 μL של פירוק-BME פתרון מכל קידוח באמצעות פיפטה רב-ערוצי. Pipette הפתרון פירוק למעלה, למטה 8 – 10 פעמים, והעברת באר לוחית או 1.7 mL גלאים צינורות על קרח. רנ א ניתן באופן מיידי, או שיכול להיות קפוא lysates ב-80 מעלות צלזיוס לעיבוד עתידי. כדי לחלץ RNA lysates, להשתמש ערכת זמינים מסחרית הכוללת טיפול DNase. Elute באמצעי האחסון המומלץ הקטן ביותר של מים הנדסה גנטית (RNase-חופשית, נטולת DNase) או • תנאי מאגר ולכמת RNA. עבור מספר קטן של דוגמאות, להשתמש fluorometer או ספקטרופוטומטרים. עבור מספרים גדולים של דגימות, השתמש בדיקה פלורסנט שמזהה RNA ולמדוד על קורא צלחת. שיכול להיות קפוא דגימות ב-80 מעלות צלזיוס לפני או אחרי כמת. 6. שינויים בביטוי גנים באמצעות צעד אחד qPCR ו- RNA-seq לכימות להשיג qPCR תחל עבור הגנים של עניין, ג’ין משק אחד לפחות מתבטא ליד רמת הגנים יישוב, לא משנה על פני תנאי הניסוי. באופן אידיאלי, אלה תחל תתפרס על צומת אקסון-אקסון להימנע הגברה של הדנ א. מבחן אלה תחל ב- RNA המתקבל הקו תא עניין. שימוש להמיס עקומת ניתוח כדי לאמת את הייצור של מוצר אחד. אם מוצר אחד אינו מיוצר, לבדוק פריימר נוספים זוגות. עבור כל שיפור-i ובקרה מדריך RNA מטופלים מדגם, לזהות כמה גנים צריך להיות לבדיקה בדוגמת זו. זו קבוצה של גנים צריך לכלול את הגנים משק בית, כגון CTCF או GAPDH. להגדיר תגובות qPCR. לדלל כל דוגמאות לריכוז אותו במים, כך 50 ng של RNA הכולל הוא pipetted בקלות, ויש מספיק מדולל RNA עבור כל תגובה. לדוגמה, לדלל RNA ל ~16.6 ng/μL ולהשתמש μL 3 של RNA בתגובה לכל. לשמור RNA על הקרח תוך הגדרת mixes מאסטר. הכנת תערובות מאסטר נפרד לכל הגן ניתן למדוד באמצעות ערכות qPCR זמינים מסחרית של צעד אחד. השתמש אמצעי התגובה 20 μL μL 1 של כל פריימר (10 μM מניות פתרון). להגדיר תגובות אלו על קרח. צלחת התגובה המתאימה הצנטרפוגה תרמי, להוסיף דוגמאות RNA ואחריו mixes מאסטר. חותם עם סילר לאיטום צלחת ומערבבים בעדינות על-ידי vortexing או pipetting. Centrifuge בקצרה את הצלחת (140 x גר’ 60 s) על מנת להבטיח את הנוזלים נמצאת בתחתית הבארות. דגירה את הצלחת ב הצנטרפוגה תרמי כדלקמן (או כמו ערכת מורה): 48 º C למשך 30 דקות, 95 מעלות צלזיוס למשך 10 דקות, 40 מחזורי של (95 ° C 15 s, 60 מעלות צלזיוס במשך 1 דקה). להשיג ערכי Ct עבור כל ג’ין נמדד בתוך כל דגימה. השתמש בשיטת Ct השוואתי כדי לזהות שינויים בביטוי הגנים. להחסיר ה-Ct של הגן משק מן ה-Ct של כל גן מעניין עבור כל דגימה כדי להפיק ערכים Ct מנורמל. הדגימות שליטה מטופלים, סעו ממוצע של הערכים Ct מנורמלת עבור כל הגן. יומן בסיס 2-סולם מתקפל דיכוי אז יכול להיות מחושב על-ידי חיסור המדגם Enhancer-i יחס מנורמל Ct עבור כל הגנים של אותו ערך של המדגם שליטה טיפל עבור הגן המתאים. כדי לקבוע כללי שינויים בביטוי הגנים לאחר הטיפול משפר-i, להכין את הדגימות רצפי RNA באמצעות ערכת זמינים מסחרית תואם טכנולוגיית רצף של המשתמש. שימוש ~ 500 ננוגרם של RNA להפעלת החומר ולהכין ספריות ושכפול ביולוגית לפחות 2. 7. אימות של פילוח גנומית ספציפיים על-ידי-SID4X-dCas9-קראב באמצעות שבב-seq הערה: החלבון פיוז’ן SID4X-dCas9-קראב מכילה תג epitope דגל והן תג epitope HA, אך התוצאות הטובות ביותר עבור שבב-seq התקבלו עם נוגדנים נגד דגל. במידת הצורך, המשתמש יכול לבצע ניסויים שבב-seq נוספים עבור גורמי שעתוק שעשוי להיות מושפע Enhancer-i, או עבור H3K27ac, סימן של פעילות וריח מופחת לפי Enhancer-i. עם זאת, כל ניסוי שבב-seq דורש 10 x 106 תאים, כך בהתאם. Transfect תאים עם בריכות Enhancer-i. צלחת 10 x 106 תאים בצלחת תרביות רקמה 15 ס מ. כל מנה מייצג 1 ניסוי שבב-seq עבור הפקטור 1 עניין. למחרת, transfect את התאים באמצעות μg 20 של DNA הכולל לכל תבשיל. עבור transfections בשורות תא stably לבטא SID4X-dCas9-קראב, הדנ א צריך להיות בריכה פלסמיד של מדריך RNAs מיקוד כל אתרי עניין וכאופציה פלסמיד ביטוי חלבון פלואורסצנטי. לשימוש transfections ארעי, יחס של 3:2 dCas9 פיוז’ן חלבון: מדריך RNA בריכה. עבור שבב-seq של שר או שינויים היסטון אחרות, לבצע בקרה נוספים אחד לפחות-מדריך RNA תרביות תאים על תבשיל אחר. פנקו את הכלים עם puromycin (1 μg/mL), neomycin (300 ng/mL)-24-48 שעות פוסט תקנים. להמתין לפחות 24 שעות לפני הקטיף כרומטין. כרומטין הקציר של מנות.הערה: כדי לחקור את ההשפעות של שיפור-i ב- ER איגוד גנומית בתאים אישיקאווה, לבצע טיפול nM E2 1 h 10 מנות transfected עם שליטה RNAs הוראות Enhancer-i לפני הקציר. כדי לבחון את השפעות Enhancer-i-H3K27ac, ביצוע של nM 8 h 10 E2 אינדוקציה על מנות transfected עם שליטה RNAs הוראות Enhancer-i לפני הקציר. ΜL 500 של 37% פורמלדהיד חלות על כל מנה (סופי בריכוז 1%). מערבולת הלוחות בקצרה. תן את הצלחות לשבת בטמפרטורת החדר במשך 10 דקות. להוסיף 1 מ”ל של 2.5 מטר גליצין (ריכוז סופי של 125 מ מ). מערבולת הלוחות בקצרה. יוצקים את התקשורת עם פורמלין, גליצין. הוסף אמצעי שווה (~ 20 מ ל) ל- PBS קר 1 x. יוצקים את טוב, מגניב. האחות עם העצמות ואקום להסיר כמה שיותר PBS ככל האפשר. מניחים את הכלים על קרח. להוסיף 3-5 מ ל 1 קר x מאגר פירוק PBS או פצאל (5 מ מ צינורות pH 8.0, 85 מ מ אשלגן כלורי, 0.5% NP-40) עם 1 x מעכב פרוטאז (נוסף רק לפני השימוש) כל צלחת. לגרד את המנה עם במגרדת צלחת ולהעביר את הפתרון צינור חרוטי 15 מ”ל על קרח. גלולה כרומטין מאת ספינינג למטה צינורות ומפרידה למשך 5 דקות ב 4 ° C-g 1000 x. להשליך את תגובת שיקוע, לאחסן את כדורי ב- 80 ° C לשימוש עתידי, או להמשיך עם פרוטוקול seq שבב של בחירה באמצעות נוגדן אנטי-דגל או נוגדנים לעבר השני גורמי שעתוק או היסטון שינויים מעניינים (H3K27ac, H3K9me3).