Dissectie van Enhancer functie met behulp van Multiplex CRISPR gebaseerde Enhancer inmenging in cellijnen

1. generatie van cel lijnen stabiel uiting van SID4X-dCas9-KRAB Opmerking: De transfectie voorwaarden en concentraties van de drug die hier gepresenteerd zijn geoptimaliseerd voor Ishikawa cellen, een cellijn van endometriumkanker, geteeld in RPMI 1640 media aangevuld met 10% FBS en 1% penicilline/streptomycine (volledige RPMI). Andere cellijnen kunnen vereisen verschillende transfectie voorwaarden en concentraties van de drug. Gebruikers kunnen ook voorbijgaande transfectie experimenten uitvoeren in wild-type cellen, in plaats van het genereren van een stabiele cellijn, met een plasmide uiting van SID4X-dCas9-KRAB samen met gids RNA uiting van plasmiden; resultaten van voorbijgaande transfections kunnen echter moeilijk het reproduceren van SID4X-dCas9-KRAB niveaus variëren door transfectie. Plaat Ishikawa cellen in ten minste 2 putjes van de plaat van een 6-well aan 30-50% samenvloeiing (ongeveer 300.000 Ishikawa cellen) in 3 mL van volledige RPMI. De media van de cellen gecombineerd. Wassen van de cellen een keer met 1 x PBS (pH 7.4). De PBS gecombineerd en trypsine (4 mL voor een schotel van 10 cm of 5 mL voor een T-75 kolf) toe te voegen. Incubeer de cellen gedurende ~ 5 minuten bij 37 ° C, controleren elke 2 min voor vrijstaande cellen en voorzichtig schudden het vaartuig. Zodra de cellen hebben losgemaakt, Pipetteer trypsinized cellen boven en beneden een paar keer, en pipet zachtjes langs de zijkant van het schip om alle gekoppelde cellen vrij te geven. De cellen overbrengen in een conische tube van 15 mL en de cellen naar beneden draaien voor 5 min op 250 x g. De trypsine gecombineerd en resuspendeer de cellen in 5-10 mL van de media. Gebruik een pipet P1000 te distantiëren van cel bosjes indien nodig. Cellen tellen, en bepalen het volume nodig om de plaat ~ 300.000 cellen per putje in een totaal volume van 3 mL. De cellen toevoegen aan 2 aparte putjes van de plaat van een 6-well. Vul elk goed tot 3 mL met volledige RPMI. Zachtjes schud de plaat elke 5 min in de eerste 15 min na beplating om ervoor te zorgen dat de cellen zijn gelijkmatig verdeeld op de plaat. Gebruik een microscoop om ervoor te zorgen dat de cellen uit het midden van de put hebben verspreid. Binnen de 24u van plating, voeren de volgende transfections met behulp van een passende transfectiereagens voor de cellijn van belang. Voor Ishikawa cellen, gebruikt u de procedure zoals hieronder beschreven.Nota: Dit protocol veronderstelt het gebruik van kationische liposoom gebaseerde transfectie reagentia. Electroporation biedt een alternatieve methode voor celtypes die zijn zeer gevoelig voor deze reagentia of die vertonen lage transfectie efficiëntie met lipofection. Transfectie voorwaarden moeten worden geoptimaliseerd voor de cellijn van belang vóór probeert Enhancer-i experimenten. In een 1,7 mL Eppendorf buis, Verdun 2,5 μg van SID4X-dCas9-KRAB plasmide en 800 ng van plasmide uiting van een fluorescente proteïne in serumvrij media zodanig dat het uiteindelijke volume in de buis 155 µL is en de uiteindelijke concentratie van plasmide 0.020 µg/µL is. In een andere buis, verdunde 3.3 µg van een plasmide die bevat geen een neomycine weerstand cassette, zoals pCMV-GFP, in serumvrij media zodanig is dat het uiteindelijke volume in de buis 155 µL en de uiteindelijke concentratie van plasmide is 0.020 µg/µL. Vortex elk tube kort en spin down met behulp van een microfuge. Voeg 9.9 µL van het transfectiereagens (Tabel van materialen) aan elke buis. Meng door vortexing kort bij een lage snelheid. Draai de buizen naar beneden met een microfuge. Incubeer de buizen bij kamertemperatuur voor minstens 5 min, maar niet meer dan 20 min. Voeg 150 µL van het mengsel bereid DNA: reagens ontkleuring aan één putje op de plaat 6-well in het biosafety kabinet. Herhaal deze stappen voor de andere buis voor bereid DNA: reagens mix. Meng de platen door voorzichtig te zwenken en de plaat terug te keren naar de incubator. Op dag 2 post transfectie, wijzigen van de media en aan te vullen met G418 om een eindconcentratie van 600 ng/μL. Deze concentratie moet worden geoptimaliseerd voor het celtype. Volledige RPMI media wijzigen en aan te vullen met G418 om de andere dag voor 2-4 weken totdat de controle transfected cellen dood zijn en de putjes met SID4X-dCas9-KRAB confluente worden. De exacte hoeveelheid tijd die nodig is voor de cellen te herstellen zal afhangen van de verdubbeling tijd van de cellen. Wanneer de cellen worden confluente, overgang naar een T-25 of T-75 schip in RPMI compleet met een lagere dosis van G418 (300 ng/μL voor Ishikawa cellen). Tijdens deze passage maken 2 aliquots van ~ 100.000 cellen elke (ongeveer 1/10th van een 6-well-plate) in 2 aparte 1,7 mL Eppendorf buizen voor isolatie van RNA en DNA, respectievelijk. Draai deze buizen naar beneden (5 min, x 250gr), trypsine verwijderen door pipetteren en bevriezen van de buizen bij-20 ° C voor toekomstig gebruik. Isoleer genomic DNA met behulp van commercieel beschikbare kits en uitvoeren van PCR met behulp van de “pAC95_PCR” of “SID4X_PCR” inleidingen (tabel 1) om te controleren of de aanwezigheid van de fusieproteïne binnen in de cellijn. Genomic DNA geëxtraheerd uit de ouderlijke lijn als een negatieve controle, en SID4x-dCas9-KRAB plasmide DNA gebruiken als positieve controle. Een master mengeling van HiFi-polymerase met 50-100 ng van genomic DNA en de volgende fietsen voorwaarden gebruiken: 98 ° C gedurende 30 s, 25 cycli van (98 ° C gedurende 10 s, 58 ° C gedurende 30 s, 72 ° C gedurende 2 minuten), 72 ° C gedurende 5 minuten , houden bij 4 ° C. Uitvoeren om te controleren of de expressie van het fusie-eiwit op het niveau van RNA, qPCR met RNA gehaald uit de cellijn met behulp van commercieel beschikbare kits. Gebruik de “dCas9_qPCR” inleidingen (tabel 1), en het protocol van de qPCR één stap in stap 6.3 van dit protocol. Uitvoeren om te controleren of de expressie van de eiwit-niveau van de fusie, een westelijke vlek op lysates uit de cellijn. Gebruik Dizzee RASCAL of anti-HA antilichamen om de fusie proteïne te ontdekken. 2. gids RNA Design Opmerking: Dit protocol is ontworpen voor gebruik met de U6 gids RNA klonen vector gecreëerd door de kerk lab en beschikbaar op Addgene (Addgene 41824). Voor het maken van een versie van deze vector met puromycin weerstand die mag voor dezelfde klonen strategie als 41824, verruilt we de meerdere klonen site deze vector in de vector pGL3-U6-sgRNA-PGK-puromycin (Addgene 51133). Addgene 41824 of onze versie met puromycin (Addgene 106404) zijn compatibel met de klonen strategie zoals hieronder beschreven. Verkrijgen van 600-900 basepairs van DNA-sequentie voor elk regelgevend gebied van belang. Transcriptie factor bandplaatsen en/of chromatine Toegankelijkheid gebruiken voor aanwijzingen over waar te definiëren van de regio van belang (figuur 2A).Opmerking: Terwijl het voorbeeld in figuur 2A de versterkers van de upstream- en downstream beschikt, het is ook mogelijk te richten regelgevende elementen introns bevinden. Plaats alle reeksen in een enkel tekstbestand met behulp van de indeling FASTA verkregen. Identificeren van ten minste één negatieve controle-regio die niet naar verwachting zal veranderen in de experimentele omstandigheden, zoals een promotor van een gen dat niet wordt uitgedrukt in de cellijn van belang. Aanvragen van DNA-sequentie voor deze regio en toevoegen naar de tekstbestand in FASTA formaat.Opmerking: We gebruiken gids RNAs gericht op de IL1RN promotor25 als een negatieve controle voor alle regio’s die wij richten. Gebruikers kunnen ook selecteren op intergenic volgorde in de buurt van de regio van belang dat geen transcriptie factor bandplaatsen als negatieve controle. Echter als meerdere loci gelijktijdig gericht worden, vereenvoudigt een enkele negatieve controle regio proefopzet en interpretatie van resultaten. Als de gerichte enhancer intronic is, is het wellicht nuttig te richten een intronic gebied op de zelfde locus die geen een vermeende regelgevende element als een extra negatieve controle, als de dCas9-fusion bevat met de transcriptie interfereren kan. Identificeren van positieve controle gebieden, zoals de initiatiefnemers die de vermeende doelstellingen van de regelgevende gebieden van belang zijn, of de initiatiefnemers van genen die zeer worden overgezet in de cellijn van belang. Aanvragen van DNA-sequentie voor deze regio’s en toevoegen naar de tekstbestand in FASTA formaat. Gebruik een programma zoals e-scherpe26 (http://www.e-crisp.org/E-CRISP/) op de DNA-sequenties gegenereerd vind je gids RNAs met lage af-doelen (idealiter 0-3). Gids RNAs bestaan uit 20 nucleotiden stroomopwaarts van een protospacer aangrenzende motief (PAM), waarin het formulier “NGG” voor de dCas9 van S. pyogenes. Op de website van e-crisp, selecteer het organisme van belang met behulp van het drop-down menu. De genoom-vergadering verschijnt rechts van de soortnaam. Selecteer het keuzerondje Input is FASTA opeenvolging . De FASTA sequenties van bovenaf kopiëren en plakken in het dialoogvenster. Ervoor zorgen dat de kop van een FASTA opgenomen voor elke sequentie.Opmerking: Maximaal 50 sequenties kunnen worden opgevraagd gelijktijdig. Selecteer het Medium radio knop en enkele grafische vorm geldt in het drop-down menu. Klik op de knop Start sgRNA zoeken. Een nieuw tabblad wordt geopend, en de resultaten worden weergegeven. De kandidaat-sequenties downloaden door te klikken op de knop downloaden van een rapport in tabelvorm Excel opgemaakt voor alle query reeksen samen. Open het rapport in tabelvorm met behulp van Excel of een tekstverwerkingsprogramma. Gebruik de UCSC genome browser aan BLAT kandidaat full-length gRNA sequenties (23 basepairs) aan het genoom. In een browser, ga naar de UCSC genome browser website (http://genome.ucsc.edu). Zoek het woord BLAT onder de sectie onze toolsen tikken daarop. De BLAT Search Tool wordt geopend. Gebruik de drop-down menu’s bevindt zich onder de tekst BLAT Zoek genoom te selecteren van de vergadering van het organisme en genoom van belang. De gids RNA-sequenties van het rapport in tabelvorm gegenereerd door e-scherpe kopiëren en plakken in het dialoogvenster. Ervoor zorgen dat elke sequentie een unieke FASTA header heeft, klikt u op verzenden onder aan het dialoogvenster.Opmerking: Maximaal 25 sequenties kunnen worden onderzocht in een keer. Op de pagina Zoekresultaten BLAT wordt uitlijning van elke gids sequentie van het RNA weergegeven, waarbij voor elke lijn vertegenwoordigt een uitlijning. In het ideale geval moet er één uitlijning voor elke gids RNA, met vermelding van de uniciteit van die gids RNA. De gidsen die zijn afgestemd op meerdere locaties in het genoom indien mogelijk te vermijden. Om te controleren gids RNA lokalisatie en distributie binnen de regio van belang, klik op de link van de Browser onder de sectie acties voor een van de RNAs opgevraagde gids. De genoom-Browser zal verschijnen en zal worden gecentreerd op het geselecteerde hulplijn RNA. Gebruik de Zoom uit knoppen aan de bovenkant van de pagina te visualiseren van de verdeling van andere gids RNAs geïdentificeerd door e-scherpe binnen de regio van belang. Selecteer 4 bij voorkeur niet-overlappende gids RNA-sequenties die zijn verspreid over de regio van belang (figuur 2B). Als de regio van belang groter is dan 600 bp, overwegen het toevoegen van 1-2 extra gidsen. Vermijd gids RNAs met homopolymeric rek en extreme GC inhoud, omdat deze functies kunnen een belemmering vormen voor de gids-RNA klonen proces en verminderen gids RNA gericht op efficiëntie. Zodra de gidsen hebben geselecteerd is, maak een bestand met de volledige gids opeenvolging van RNA (23 nucleotiden) voor elke gewenste gids, en verwijder de nucleotide 5′ evenals de PAM (NGG) uit de 3′-eind. Deze stap vergemakkelijkt oligo bestellen. De volgende reeks toevoegen aan het einde 5′ van de oligonucleotide volgorde: GTGGAAAGGACGAAACACCG. De volgende reeks toevoegen aan de 3′ einde van de reeks van oligonucleotide: GTTTTAGAGCTAGAAATAGC.Opmerking: De uiteindelijke volgorde moet 59 nucleotiden lang en kijk net als dit: GTGGAAAGGACGAAACACCG-target (19 nt)-GTTTTAGAGCTAGAAATAGC. Zorg ervoor dat elk regelgevend element te worden gericht met de Enhancer-i ten minste 4 unieke oligonucleotides ontworpen voor het. Bestel deze sequenties samen met de “U6_internal” inleidingen vermeld in tabel 1. 3. gids RNA klonen Opmerking: Gids RNA klonen via Gibson vergadering heeft bewezen zeer efficiënt in onze handen, honderden kolonies per plaat, met weinig of geen koloniën aanwezig in de enige vectorbestrijding oplevert. Dergelijke efficiëntie is essentieel voor het handhaven van complexiteit tijdens de gepoolde klonen. Een ander voordeel van Gibson vergadering klonen is dat gebruikers niet hoeft te maken over de aanwezigheid van een restrictie-enzym gesneden site in de handleiding RNA ze proberen in te voegen in de U6 klonen vector. Niettemin, dit protocol kan worden aangepast voor traditionele restrictie-enzym gebaseerd klonen indien gewenst. Reconstrueren gids RNA oligos op een eindconcentratie van 100 μM in ultrazuiver water (RNase-gratis, DNase-gratis). Er moet ten minste 4 aparte gids RNA oligos voor elk gebied van belang. Maak voor elke regelgevende regio van belang, een pool van alle oligos die overeenkomt met de regio van belang. Combineren in een buis Eppendorf, 5 μL van elke individuele gereconstitueerde gids RNA oligo voor elke regio. Meng het zwembad goed door vortexing, 1 μL haal hem eruit en Verdun deze aliquoot 1:200 in ultrazuiver water.Opmerking: Indien gewenst, deze zwembaden gericht op individuele regelgevende gebieden kunnen worden verdere gecombineerd voor het genereren van een complexe pool targeting op meerdere gebieden. Tot 50 regelgevende gebieden kunnen het doelwit gelijktijdig in een enkele pool (Figuur 3 c). Voer een korte PCR met de U6 inleidingen om te koppelen homologie regio’s aan de oligos voorafgaand aan de vergadering van de Gibson. Ongeveer 40 grondslagen zullen worden toegevoegd aan elke oligo, opbrengst een ~ 100 bp product dat bevat voldoende homologie naar de U6 vector aan beide uiteinden. Voor elke gids RNA zwembad, instellen van een 20 μL PCR met een hifi-polymerase master mix en de volgende onderdelen: 1 μL van verdunde oligo zwembad vanaf stap 3.2, 1 μL van U6 voorwaartse primer (10 μM), 1 μL van U6 reverse primer (10 μM) , en water van maximaal 20 μL. Incubeer in een thermische cycler met de volgende voorwaarden: 98 ° C gedurende 30 s, 10 cycli van (98 ° C gedurende 10 s, 55 ° C gedurende 30 s, 72 ° C gedurende 2 minuten), 72 ° C gedurende 5 minuten, en houd bij 4 ° C. Voer 5 μL van de reactie op een 1-2% agarose gel met een laag molecuulgewicht ladder. Het eindproduct moet ~ 100 basepairs (figuur 2C). Opruimen van de reactie van de uitbreiding met een kolom gebaseerde DNA zuivering kit, en elueer in 20 μL van elutie buffer geleverd in de kit.Opmerking: Als het product kort is, Vermijd het gebruik van de kraal gebaseerde schoon-ups, die zijn ontworpen om uit te sluiten van kleine fragmenten kleiner is dan 100 bp. Kwantificeren van de gezuiverde DNA met een Fluorimeter of spectrofotometer (verwacht rendement is 10-20 ng/μl). Gids RNA inzetstukken kunnen worden achtergelaten bij-20 ° C, of onmiddellijk in Gibson vergadering met een gelineariseerde U6-vector kunnen worden gebruikt. Ter voorbereiding van de ontvanger U6 klonen vector voor Gibson montage, opgezet een restrictie-enzym-digest. Als vele Gibson vergadering Reacties dienen te worden uitgevoerd, instellen meerdere verteert om voldoende rendement van gesneden vector. 20 eenheden van AflII enzym en 1 μg plasmide gebruiken in een 20 μL reactie met de juiste restrictie-enzym-buffer. Incubeer bij 37 ° C gedurende 1-2 uur. Opruimen van de digest met kralen of een kolom gebaseerde kit voor DNA zuivering en elueer in 20 μL van elutie buffer. Kwantificeren van de gezuiverde DNA met een Fluorimeter of spectrofotometer. Monsters kunnen worden bevroren bij-20 ° C voor later gebruik. Gibson vergadering uit te voeren op de voorbereide vector en invoegen. Gibson vergadering reacties instellen op ijs. Gebruik 50 ng van de vectoren en 7 ng van het donormateriaal in een 20 μL reactie. De inserts 1:10 verdunnen in ultrazuiver water om pipetteren. Instellen van een vector enige Gibson vergadering-reactie, 50 ng van de vector en het donormateriaal te vervangen door water. Incubeer de Gibson vergadering reacties voor 15 min bij 50 ° C, gevolgd door een wachtruimte bij 4 ° C. Overdracht van de geassembleerde producten aan ijs. Verdun de geassembleerde producten 1:4 in ultrazuiver water op het ijs. Bijvoorbeeld, 5 μl van Gibson vergadering product aan 15 μL van ultrazuiver water toevoegen. Transformeren de verdunde Gibson vergadering producten. Hoogrenderende bevoegde cellen op ijs ontdooien en 25 μL aliquots voor elke transformatie te maken. Als een complexe pool targeting op meerdere sites wordt gewenst, ontdooi genoeg cellen in verschillende buizen voor het uitvoeren van meerdere onafhankelijke transformaties van dezelfde groep met complexe gRNA. Toevoegen voor elk verdunde product, 1 μL met deze tweevoudige verdunning een 1,7 ml Eppendorf buis met 25 μL van bevoegde cellen. Meng door kort flicking de buis. Incubeer de buizen op het ijs gedurende 30 minuten. Warmte schok de cellen voor 30 bij 42 ° C, s Breng onmiddellijk om het ijs gedurende 2 minuten. Voeg van 300 μL SOC media (2% trypton, 0,5% gistextract, 10 mM NaCl, 2,5 mM KCl, 10 mM MgCl2, 10 mM MgSO4en 20 mM glucose) en laat de cellen herstellen gedurende 1 uur bij 37 ° C met schudden (300 rpm). Gedurende deze tijd, warm de agar platen met ampicilline/carbenicillin tot 37 ° C in een broedstoof. Een plaat voor elke transformatie gebruiken. Typeplaatje 50 μl van cellen en plaats de platen in een incubator 37 ° C’s nachts. Voor de zwembaden gericht op afzonderlijke sites, plaatst u rechtstreeks in 3-5 mL van de pond-Bouillon (Tabel of Materials) met ampicilline/carbenicillin (1 mg/mL) en na een nacht bebroeden met schudden bij 250 omwentelingen per minuut bij 37 ° C gedurende minipreps. Oogsten van de cellen en DNA te isoleren. Gebruik voor grote gids RNA bibliotheken targeting op meerdere sites, een schraper plaat om te verzamelen van alle kolonies van elke afzonderlijke plaat in één maxiprep (150 mL vloeibare cultuur). Dit kan worden vergemakkelijkt door gieten ~ 5 mL LB met de juiste antibioticum in een tube van 50 mL falcon en schrapen de kolonies in de buis. Voor bibliotheken gericht op afzonderlijke sites, schraap de platen in een miniprep (3-5 mL vloeibare cultuur). Incubeer deze culturen met de juiste antibioticum gedurende 3-5 uur bij 37 ° C met het schudden van 250 toeren per minuut. DNA-extractie met behulp van een kit die in een endotoxine-vrije preps resulteert uitvoeren Kwantificeren van DNA met een Fluorimeter of spectrofotometer. Plasmiden kunnen worden onmiddellijk in Transfectie gebruikt of opgeslagen bij-20 ° C voor toekomstig gebruik. Ter bevestiging van de aanwezigheid van de volgorde van de RNA van de gids in de U6 vector voor kleine zwembaden gericht op enkele sites, gebruik Sanger rangschikken op de voorbereide miniprep met de “U6_PCR_R” primer vermeld in tabel 1. Door bundeling van gids RNAs, de 19 basepair gRNA doel reeks gemengde honken zal opleveren, maar de U6 promotor en gids RNA steiger rondom deze volgorde moet intact. 4. de transfectie van Enhancer-i Nota: Voor de succesvolle blokkade van een reactie van de oestrogeen Enhancer-i, waarbij in Ishikawa cellen, is het noodzakelijk om te beroven van de cellen van oestrogeen voor 5-7 dagen vóór de transfectie door te handhaven hen fenol red gratis RPMI met 10% houtskool-ontdaan FBS en 1% penicilline/streptomycine. Cellen moeten in deze media worden gekweekt tijdens en na de transfectie als proberen te blokkeren van een oestrogeen-reactie. Wij raden het gebruik van fenol red gratis trypsine voor passage van de cellen in het volledige fenol rood gratis RPMI. De dag voor transfectie, plaat de cellen (wild-type of stabiel uiting van SID4X-dCas9-KRAB) in een 24-well plaat duikt met 30-50% confluentie (~ 60.000 cellen per putje voor Ishikawa cellen). Plaat voldoende cellen zodanig dat transfections kan worden uitgevoerd in twee exemplaren, en omvatten putten om te zijn transfected met controleaanwijzing RNAs.  Zorg ervoor dat de cellen worden gelijkmatig verdeeld over de put door zachtjes schudden de plaat na cel plating zoals in stap 1.1.7.Nota: Dit protocol veronderstelt het gebruik van kationische liposoom gebaseerde transfectie reagentia. Electroporation biedt een alternatieve methode voor celtypes die zeer gevoelig voor deze reagentia zijn. Transfectie voorwaarden moeten worden geoptimaliseerd voor de cellijn van belang vóór probeert Enhancer-i experimenten. De volgende dag, bereiden transfections volgens instructies van de transfectiereagens van keuze. Voor Ishikawa cellen, gebruik 550 ng van totale plasmide voor elk putje van de plaat van een 24-well. Verdun de plasmiden om een eindconcentratie van 0.020 μg/μL in serumvrij media (1.1 μg van DNA in 52 μL van totale volume voor transfecting 2 putten). 3 μL van transfectiereagens gebruiken voor elke 1 μg van DNA, vortex en zoals beschreven in stap 1.2 uit te broeden. 25 μL van het uiteindelijke mengsel toevoegen aan elk putje.Opmerking: Tot doel combinaties van sites, gebruiken hetzelfde gewicht van plasmide voor elke individuele site, en vul vervolgens het overgebleven gewicht met een besturingselement plasmide (lege gids RNA klonen vector- of gids RNAs gericht op een gebied van de negatieve controle zoals de IL1RN Promotor). Voor tijdelijke transfections, gebruikt u een verhouding van 3:2 Cas9 fusion: gids RNA plasmide. Plasmiden met fluorescerende verslaggevers kunnen worden toegevoegd aan het controleren van de transfectie efficiëntie. Bij 36 h post transfectie, veranderen de media met behulp van fenol red gratis RPMI met 10% houtskool-ontdaan FBS en 1% penicilline/streptomycine (voor Ishikawa cellen) en leveren van puromycin (eindconcentratie: 1 μg/mL) en neomycine (eindconcentratie: 300 ng/mL). Als cellen gevoelig voor transfectiereagens zijn, de media kan eerder worden gewijzigd, maar niet eerder dan 24 h post transfectie antibiotica moeten worden toegevoegd.Opmerking: Wacht ten minste 24 uur na het toevoegen van antibioticum vóór het oogsten van de cellen. Expressie veranderingen als gevolg van Enhancer-i kunnen worden gedetecteerd als spoedig 48u transfectie boeken en omhoog tot 5 dagen transfectie boeken. Als werken met Ishikawa-cellen die gebleven van oestrogeen verstoken zijn, voert u een 8-h 10 nM 17β-estradiol (E2) inductie de dag na behandeling met antibiotica en vervolgens onmiddellijk oogst cellen. 5. cel oogst en RNA extractie Lysis-buffermengsel met 1% β-mercaptoethanol (BMT) voor te bereiden. Zorg ervoor dat er genoeg lysis-BME mengsel (300 μL voor elk goed wordt geoogst). De media met behulp van een vacuüm aspirator gecombineerd. Wassen van de cellen een keer met een gelijk volume 1 x PBS (500 μL) en aspirate te verwijderen van zo veel PBS mogelijk. Voeg 300 l lysis-BME oplossing aan elk putje met behulp van een meerkanaalspipet. Pipetteer de lysis oplossing omhoog en omlaag 8 – 10 keer, en overdracht aan een diep-well plaat of 1,7 mL Eppendorf buizen op ijs. RNA kan onmiddellijk worden geëxtraheerd, of lysates kunnen worden bevroren bij-80 ° C voor toekomstige verwerking. Om RNA van lysates, gebruikt u een commercieel beschikbare kit waarin een DNase behandeling. Elueer in de kleinste aanbevolen hoeveelheid ultrazuiver water (RNase-gratis, DNase-gratis) of elutie buffer en kwantificeren van RNA. Voor kleine aantallen monsters, gebruik een Fluorimeter of spectrofotometer. Gebruik voor grote aantallen monsters, een fluorescente sonde die RNA en maat op een afleesapparaat detecteert. Monsters kunnen worden bevroren bij-80 ° C voor of na de kwantificering. 6. het kwantificeren van gen expressie veranderingen met behulp van One-step qPCR en RNA-seq QPCR inleidingen voor de genen van belang en voor ten minste één huishouden-gen dat wordt uitgedrukt in de buurt van het niveau van gerichte genen en verandert niet over experimentele omstandigheden te verkrijgen. In het ideale geval wordt deze inleidingen verdeeld over een knooppunt van de exon-exon Voorkom versterking van genomic DNA. Test deze inleidingen op RNA verkregen uit de cellijn van belang. Gebruik smelten kromme analyse om te controleren of de productie van één product. Als een enkel product wordt niet geproduceerd, testen extra primerparen. Voor elk Enhancer-i en controle gids RNA behandeld monster, identificeren hoe vele genen moeten worden bepaald in dat monster. Deze set genen moet bevatten genen van de huishouding, zoals CTCF of GAPDH. Instellen qPCR reacties. Alle monsters dezelfde concentratie in water, verdund zodat 50 ng van totale RNA is gemakkelijk afgepipetteerde, en er is genoeg verdund RNA voor elke reactie. Bijvoorbeeld, RNA Verdun tot ~16.6 ng/l en gebruikt 3 μL van RNA in elke reactie. RNA op ijs tijdens het opzetten van meester mixen houden. Aparte master mixen voor elk gen worden gemeten met behulp van commercieel verkrijgbare one-step qPCR kits voor te bereiden. Gebruik een 20 μL reactie volume met 1 μL van elke primer (10 μM stockoplossing). Deze reacties instellen op ijs. In een reactie plaat die geschikt is voor de thermische cycler, toevoegen van RNA monsters gevolgd door meester mixen. Zegel met een sealer plaat en meng zachtjes door vortexing of pipetteren. Kort centrifugeren van de plaat (140 x g voor 60 s) om ervoor te zorgen dat vloeibaar is bij de bodem van de putten. Incubeer de plaat in een thermische cycler als volgt (of als bouwpakket gelast): 48 ° C gedurende 30 minuten, 95 ° C gedurende 10 min, 40 cycli van (95 ° C gedurende 15 s, 60 ° C gedurende 1 min). Ct waarden voor elk gen gemeten binnen elk monster te verkrijgen. Gebruik de vergelijkende Ct methode om veranderingen in de expressie van genen te identificeren. Aftrekken van de Ct van het huishouden-gen van de Ct van elk gen van belang voor elk monster voor het genereren van genormaliseerde Ct-waarden. Voor de behandelde controlemonsters, neem een gemiddelde van de genormaliseerde Ct-waarden voor elk gen. Log base 2-schaal vouw repressie kan vervolgens worden berekend door aftrekken van de genormaliseerde Enhancer-i behandeld monster Ct voor elk gen van dezelfde waarde voor de behandeld controlemonster voor het bijbehorende gen. Om te bepalen van globale wijzigingen in genexpressie na Enhancer-i behandeling, voorbereiden op de monsters RNA sequencing met behulp van een commercieel beschikbare kit compatibel met de technologie van de volgorde van de gebruiker. Gebruik ~ 500 ng van RNA voor de grondstof en bibliotheken voor ten minste 2 biologische replicatieonderzoeken te bereiden. 7. de verificatie van specifieke Genomic gericht op door met behulp van SID4X-dCas9-KRAB ChIP-seq Opmerking: De SID4X-dCas9-KRAB fusieproteïne bevat zowel een vlag epitoop tag en een HA epitoop tag, maar de beste resultaten voor ChIP-seq werden verkregen met Anti-Flag antilichamen. Indien gewenst, kan de gebruiker extra ChIP-seq experimenten uitvoeren voor transcriptiefactoren potentieel getroffen door Enhancer-i, of H3K27ac, een merk van enhancer-activiteit die wordt verlaagd door Enhancer-i. Elke ChIP-seq-experiment vereist echter 10 x 106 cellen, zo plan dienovereenkomstig. Transfect cellen met Enhancer-i zwembaden. Plaat 10 x 106 cellen in een 15 cm weefselkweek schotel. Elk gerecht vertegenwoordigt 1 ChIP-seq experiment voor 1 factor van belang. De volgende dag, transfect de cellen met behulp van totale DNA 20 μg per schotel. Voor transfections in cellijnen stabiel SID4X-dCas9-KRAB uitdrukken, moet het DNA worden van een plasmide pool van gids RNAs gericht op alle sites van belang, en optioneel een plasmide uiting van fluorescente proteïne. Voor tijdelijke transfections, gebruikt u een verhouding van 3:2 dCas9 fusion protein: gids RNA zwembad. Voor ChIP-seq van andere TFs of Histon modificaties, door ten minste één extra controle gids RNA Transfectie te verrichten op een andere schotel. Behandelen de gerechten met puromycin (1 μg/mL) en neomycine (300 ng/mL) op 24-48 h post transfectie. Wacht ten minste 24 uur vóór het oogsten van de chromatine. Oogst chromatine van gerechten.Opmerking: Een 1 h 10 nM E2 behandeling uitvoeren op gerechten te bestuderen van de effecten van Enhancer-i de genomic bindende ER in Ishikawa cellen transfected met controleaanwijzing RNAs en Enhancer-i prior te oogsten. Studie van de effecten van Enhancer-i op H3K27ac-, een 8 h 10 nM E2 inductie uitvoeren op gerechten transfected met controleaanwijzing RNAs en Enhancer-i prior te oogsten. Toepassing 500 μL van 37% formaldehyde op elk gerecht (eindconcentratie van 1%). De platen kort wervelen. Laat de platen zitten bij kamertemperatuur gedurende 10 minuten. Voeg vervolgens 1 mL van 2,5 M glycine (eindconcentratie van 125 mM). De platen kort wervelen. Giet af de media met formaldehyde en glycine. Voeg een gelijk volume (~ 20 mL) van koude 1 x PBS. Giet af de PBS. Gecombineerd met een vacuüm aspirator zoveel PBS mogelijk verwijderen. Plaats de gerechten op het ijs. Voeg 3-5 mL koude 1 x PBS of Farnham lysis-buffermengsel (5mM buizen pH 8.0, 85 mM KCl, 0,5% NP-40) met 1 x proteaseinhibitor (toegevoegd net voor gebruik) op elke plaat. Schraap de schotel met een plaat schraper en breng de oplossing over in een conische tube van 15 mL op ijs. Pellet chromatine door spinnen neer buizen in een centrifuge voor 5 min bij 4 ° C op 1000 x g. negeren het supernatant en opslaan van de pellets bij-80 ° C voor toekomstig gebruik, of doorgaan met het protocol van de ChIP-seq van keuze met behulp van een Dizzee RASCAL-antistoffen of antilichamen gericht op andere transcriptiefactoren of Histon modificaties van belang (H3K27ac, H3K9me3).