JoVE Journal > Genetics
Summary
Abstract
Introduction
Protocol
Results
Discussion
Disclosures
Acknowledgements
Materials
References
العربية

Automatically Generated
Please note that all translations are automatically generated. Click here for the English version.
Genetics

تشريح للدالة محسن باستخدام محسن متعدد المستندة إلى كريسبر التدخل في خطوط الخلايا

Published: June 02, 2018
doi:
10.3791/57883
, ,
1Department of Oncological Sciences, Huntsman Cancer Institute,University of Utah

Summary

ويصف هذا البروتوكول الخطوات اللازمة لتصميم وتنفيذ متعدد استهداف معززات مع البروتين الانصهار التخميد SID4X-dCas9-KRAB، المعروف أيضا تدخل محسن (محسن-ط). هذا البروتوكول يمكن تحديد القدرة على تنظيم التعبير الجيني ويسهل تشريح العلاقات بين القدرة على تنظيم جينات هدف مشترك.

Abstract

معززات متعددة غالباً ما تنظم جين معين، ولكن لمعظم الجينات، مازال من غير الواضح الذي معززات ضرورية للتعبير الجيني، وكيفية الجمع بين هذه القدرة على إنتاج استجابة النسخي. كما تم تحديد الملايين من القدرة على، هناك حاجة أدوات الفائق لتحديد دالة محسن على نطاق الجينوم. تشمل الأساليب الحالية لدراسة وظيفة محسن جعل الحذف الوراثي باستخدام Cas9 نوكلاس-يتقن، ولكن من الصعب أن دراسة آثار اندماجي متعددة القدرة على استخدام هذه التقنية، كما يجب أن تكون خطوط الخلية الاستنساخ متتالية متعددة التي تم إنشاؤها. نقدم هنا، محسن-i، أسلوب القائم على التدخل كريسبر يسمح باستجواب معززات متعددة في وقت واحد على المكاني الذاتية الفنية. أنا محسن يجعل استخدام هذين المجالين القمعية تنصهر فيها تفتقر إلى نوكلاس Cas9 وسيد KRAB، لتحقيق التعطيل محسن عن طريق ديسيتيليشن هستون في المكان المستهدف. هذا البروتوكول يستخدم تعداء عابر دليل الكشف لتمكين المنظمة عابرة للمناطق المستهدفة، وهي فعالة بشكل خاص في حجب الردود النسخي إيندوسيبلي للمحفزات في بيئات زراعة الأنسجة. محسن-i محددة للغاية في استهدافه الجينوم وآثاره على التعبير الجيني العالمي على حد سواء. النتائج التي تم الحصول عليها من هذا البروتوكول تساعد على فهم ما إذا كان محسن هو المساهمة في التعبير الجيني، وحجم المساهمة، وكيف يتأثر بالمساهمة الأخرى القريبة من القدرة على.

Introduction

واسعة النطاق التسلسل مشاريع مثل ترميز1و “خارطة الطريق ابيجينوميكس”2[فنتوم] حددت3 ملايين معززات المفترضة داخل الجينوم البشري عبر مئات أنواع الخلايا. ويقدر أن يربط كل المروج مع متوسط القدرة على 4.9 ومحسن كل جهات الاتصال في متوسط3من الجينات 2.4، مما يوحي بأن التعبير الجيني هو غالباً نتيجة لدمج التفاعلات التنظيمية الموزعة متعددة. أحد التحديات هامة المتبقية لتحديد القدرة ليس فقط كيف الفردية على الإسهام في التعبير الجيني، ولكن كيف أنها تجمع بين يؤثر على التعبير. النهج الوراثية تستخدم عادة لتحديد العلاقات بين معززات في الكائنات نموذج من المورفولوجية4 إلى5من الفئران. بيد أن هذه التجارب مضيعة للوقت والإنتاجية المنخفضة لدراسة القدرة على متعددة في جينات متعددة.

نهج واحد لدراسة محسن الدالة على نطاق واسع يشمل فحوصات مراسل موازية على نطاق واسع. تسمح هذه فحوصات لفحص آلاف تسلسل الحمض النووي لقدرتها على التعبير عن الجينات مراسل6محرك متزامنة. في حين أظهرت هذه الاختبارات أن تسلسل الحمض النووي يمكن وحدها كافية لنقل الجينات تنظيم المعلومات7، أنها تأتي مع التوضيحات ليجري تنفيذها خارج سياق الكروماتين الأصلية ومروج مغايرة. وبالإضافة إلى ذلك، حجم تسلسل الحمض النووي ويجري تحليلها في فحوصات مراسل موازية على نطاق واسع هو عادة أقل من 200 باسيبيرس، الذي قد يؤدي إلى استبعاد تسلسل المحيطة ذات الصلة. الأهم من ذلك، كما فحوصات مراسل قياس نشاط تسلسل واحد فقط في وقت واحد، أنها لا تأخذ في الاعتبار العلاقات المعقدة التي يمكن أن توجد بين القدرة على. وهكذا، بينما فحوصات مراسل موازية على نطاق واسع يمكن أن تكون غنية بالمعلومات حول نشاط جوهري لتسلسل الحمض النووي، أنهم ليس بالضرورة تبلغنا الوظيفة لأن تسلسل الحمض النووي في سياق الجينوم.

مؤخرا قد يسرت أدوات كريسبر/Cas9 نمواً8 دراسة تنظيم الجينات أنها تسمح لحذف معززات في محور الذاتية. ومع ذلك، حذف معززات متعددة في وقت واحد قد يؤدي إلى عدم الاستقرار المجيني، وأنها تستغرق وقتاً طويلاً لتوليد عمليات الحذف المتتالية محسن في خط خلية مفردة. وبالإضافة إلى ذلك، يتم إنشاء تسلسل الجينوم الجديد في الموقع للحذف بعد إصلاح، وهذا التسلسل قد كسب الوظيفة التنظيمية. وقد وضعت صيغة بديلة من Cas9 خصيصا لتحوير الجينات، الاعتماد على اندماج لتفعيل9،10 أو قمع المجالات12 11،بشكل ناقص نوكلاس Cas9 (dCas9). هذه البروتينات الانصهار مثالية لدراسة مواقع متعددة في وقت واحد كما لا فعلياً تغيير تسلسل الحمض النووي، وبدلاً من ذلك تعدل التخلق بغية استجواب منطقة تنظيمية. الانصهار القمعية الأكثر استخداماً هو KRAB، التي تجند المجمع قامع المشارك KAP1، تعزيز ترسب هيستون المرتبطة بالقمع H3 يسين 9 تريميثيليشن (H3K9me3)13. dCas9-KRAB، المعروف أيضا كريسبر التدخل14، قد استخدمت معززات الفرد المستهدف وشاشة لمساهماتها في15،التعبير الجيني16؛ ومع ذلك، أنها ليست الأمثل لاستهداف مناطق متعددة في وقت واحد. إصدار واحد من التدخل كريسبر متعدد للمنشطات، فسيفساء seq17، يستخدم خلية مفردة تسلسل الحمض النووي الريبي قراءات، ولكن هذه التكنولوجيا باهظة الثمن ومناسبة فقط لدراسة الجينات أعرب عالية نظراً لحساسية منخفضة من خلية مفردة الجيش الملكي النيبالي-ما يليها.

سعينا لتطوير أسلوب كريسبر المستندة إلى التدخل لتشريح وظيفة محسن اندماجي في سياق استجابة النسخي للاستروجين. حوالي نصف الجينات الإستروجين استجابة يحتوي على 2 أو أكثر القدرة على الالتزام بالاستروجين مستقبلات ألفا (ER) القريبة18، مما يوحي بأن معززات متعددة قد تكون المشاركة في الاستجابة للاستروجين، وفهم المنطق التنظيمي يتطلب استهداف معززات متعددة في وقت واحد. كما اقترحت الدراسات الأولية باستخدام كريسبر التدخل في المروجين أن المروجين ليست كلها أيضا استجابة لوساطة KRAB القمع19، نحن مسبب أن إضافة مجال قمعية متميزة إلى dCas9 قد تسهل إبطال مفعول معززات متنوعة. اخترنا Sin3a التفاعل المجال من Mad1 (SID)20 كما أنه يؤدي إلى تجنيد هيستون ديسيتيلاسيس21، التي تقوم بإزالة مجموعات أسيتيل على histones المرتبطة بالنشاط الترانسكربتي. الأهم من ذلك، المجال SID كانت فعالة في الحد من التعبير الجيني عندما تنصهر dCas922 و23من حكايات، ولقد ثبت Sin3a لتكون عاملاً قويا المشارك قمعية في مجموعة متنوعة من السياقات تسلسل محسن24. استخدمنا SID4x-dCas9-KRAB (محسن-ط) لاستهداف معززات مختلفة 10 الالتزام بلائحة، وتحديد مواقع الربط ER (آربس) التي ضرورية للاستجابة النسخي الإستروجين في الجينات 418. نحن أيضا استهدفت المجموعات من القدرة على تحديد المواقع التي تتعاون في إنتاج الإستروجين استجابة النسخي. ووجدنا أن ما يصل إلى 50 موقعا يمكن يحتمل أن استهداف في وقت واحد مع التغيرات تعبير الجينات قابلة للاكتشاف. استخدام seq رقاقة وتسلسل الحمض النووي الريبي، أثبتنا أن محسن-i تقنية محددة للغاية لدراسة القدرة على متعددة في وقت واحد.

في هذا البروتوكول، يمكننا وصف الخطوات التي تنطوي عليها أداء محسن-i، تقنية مرنة تمكن الدراسة الفنية من القدرة على متعددة في نفس الوقت في بيئة زراعة الأنسجة. محسن-ط ارتباطاً قويا بالحذف الوراثية ولكن يوفر عابر التعطيل التي تعتمد عليها هيستون ديسيتيلاسيس (هداكس). ويتجنب هذا البروتوكول بتقديم دليل الكشف عن طريق تعداء عابر بدلاً من التكامل مستقرة عن طريق النواقل الفيروسية، الترسب، وانتشار محتمل من H3K9me3. هذا تصميم دليل الحمض النووي الريبي تفاصيل البروتوكول والاستنساخ عن طريق الجمعية جيبسون، تعداء من دليل الكشف باستخدام ليبوفيكتيون، وتحليل التعبير الجيني الناتجة عن التغييرات التي قبكر. نحن تشمل أيضا أساليب لتقييم خصوصية محسن-ط الاستهداف على مستوى الجينوم والترنسكربيتوم. بينما تم تطوير هذه التقنية لدراسة تنظيم الجينات بلائحة ملزمة معززات في خطوط خلايا السرطان البشرية، أنها تنطبق على تشريح أي محسن الثدييات.

Protocol

1-جيل خلية خطوط ستابلي معربا عن SID4X-dCas9-KRAB ملاحظة: الشروط تعداء وتركيزات العقاقير المقدمة هنا قد تم الأمثل للخلايا إيشيكاوا، خط خلية سرطان بطانة الرحم، نمت في وسائل الإعلام RPMI 1640 تستكمل مع 10% FBS و 1% البنسلين/ستربتوميسين (ربمي كاملة). وقد يتطلب خطوط الخلايا الأخرى تعداء مختلف الظروف وتركيزات المخدرات. يمكن للمستخدمين أيضا إجراء تجارب تعداء عابر في البرية من نوع الخلايا، بدلاً من إنشاء خط خلية مستقرة، مع بلازميد الإعراب عن SID4X-dCas9-KRAB جنبا إلى جنب مع دليل الحمض النووي الريبي معربا عن والبلازميدات؛ ومع ذلك، قد يكون من الصعب استخراج كما قد تختلف مستويات SID4X-dCas9-KRAB من تعداء النتائج من ترانسفيكشنز عابرة. لوحة خلايا إيشيكاوا في آبار على الأقل 2 من لوحة 6-جيدا في التقاء 30-50% (حوالي 300,000 إيشيكاوا الخلايا) في 3 مل ربمي كاملة. نضح وسائط الإعلام من الخلايا. تغسل الخلايا مرة واحدة مع برنامج تلفزيوني 1 x (الرقم الهيدروجيني 7.4). نضح في برنامج تلفزيوني وإضافة التربسين (4 مل لطبق 10 سم أو 5 مل لقارورة T-75). احتضان الخلايا لدقيقة ~ 5 في 37 درجة مئوية، والتحقق من كل 2 دقيقة لخلايا منفصلة وتهز بلطف السفينة. بمجرد فصل الخلايا، تريبسينيزيد ماصة خلايا صعودا وهبوطاً عدة مرات، وماصة أسفل الجانب من السفينة لإطلاق سراح أي من الخلايا المرفقة بلطف. نقل الخلايا إلى أنبوب مخروطي 15 مل وتدور الخلايا إلى الأسفل لمدة 5 دقائق في 250 x ز. اعقلوها التربسين وريسوسبيند الخلايا في 5-10 مل من وسائل الإعلام. استخدام ماصة P1000 أن ننأى بكتل الخلية إذا لزم الأمر. عد الخلايا وتحديد حجم الحاجة إلى لوحة خلايا ~ 300,000 الواحدة وكذلك في إجمالي حجم 3 مل. إضافة الخلايا إلى آبار منفصلة 2 للوحة 6-جيدا. ملء كل جيدا لمل 3 مع ربمي كاملة. بلطف يهز لوحة كل 5 دقائق في 15 دقيقة الأولى بعد الطلاء التأكد من أن الخلايا وتوزع بالتساوي على اللوحة. استخدم مجهر للتأكد من أن الخلايا قد فرقت من منتصف البئر. خلال 24 ساعة طلاء، أداء ترانسفيكشنز التالية استخدام كاشف تعداء مناسبة لخط الخلية للفائدة. للخلايا إيشيكاوا، استخدم الإجراء كما هو موضح أدناه.ملاحظة: يفترض هذا البروتوكول استعمال الكواشف الأيوني تعداء المستندة إلى الحويصلية. انهانسر يوفر طريقة بديلة لأنواع الخلايا التي تكون حساسة جداً لهذه الكواشف أو أن يحمل تعداء منخفضة الكفاءة مع ليبوفيكشن. يجب أن يكون الأمثل تعداء الظروف لخط الخلية الفائدة قبل محاولة تجارب أنا محسن. في مل 1.7 أنابيب ايبندورف، يضعف 2.5 ميكروغرام من SID4X-dCas9-KRAB بلازميد و 800 نانوغرام بلازميد معربا عن بروتين فلوري في وسائل الإعلام الحرة المصل أن الحجم النهائي في الأنبوب ميليلتر 155 وتركيز بلازميد النهائي 0.020 ميكروغرام/ميليلتر. في أنبوب آخر، وتمييع 3.3 ميكروغرام من بلازميد التي لا تحتوي على النيوميسين كاسيت مقاومة، مثل بكمف-التجارة والنقل، وفي وسائل الإعلام الحرة المصل تكون وحدة التخزين النهائي في الأنبوب ميليلتر 155 وتركيز بلازميد النهائي هو 0.020 ميكروغرام/ميليلتر. دوامة كل أنبوب بإيجاز وتدور إلى أسفل باستخدام [ميكروفوج]. إضافة ميليلتر 9.9 من الكاشف تعداء (جدول المواد) لكل أنبوبة. مزيج من فورتيكسينج بإيجاز بسرعة منخفضة. تدور هذه الأنابيب إلى أسفل مع [ميكروفوج]. احتضان هذه الأنابيب في درجة حرارة الغرفة لمدة 5 دقائق على الأقل، ولكن لا يزيد عن 20 دقيقة. في مجال السلامة الأحيائية مجلس الوزراء، إضافة 150 ميليلتر من مزيج استعداد الحمض النووي: كاشف دروبويسي إلى بئر واحدة على لوحة 6-جيدا. كرر هذه العملية لأنبوب الأخرى من مزيج استعداد الحمض النووي: كاشف. خلط اللوحات بدوامات بلطف والعودة اللوحة للحاضنة. في يوم 2 وظيفة تعداء، تغيير وسائط الإعلام وتكملة مع G418 بتركيز نهائي من 600 نانوغرام/ميكروليتر. قد تحتاج إلى هذا التركيز الأمثل لنوع الخلية. تغيير كامل ربمي الوسائط وتكملة مع G418 يوميا لمدة 2-4 أسابيع حتى التحكم transfected الخلايا ميتة والآبار التي تحتوي على SID4X-dCas9-KRAB تصبح المتلاقية. المبلغ المحدد للوقت اللازم للخلايا لاسترداد سيتوقف في وقت تضاعف الخلايا. عند إكمال الخلايا تصبح المتلاقية، مرور سفينة T-25 أو T-75 في ربمي مع أقل جرعة من G418 (300 نانوغرام/ميكروليتر للخلايا إيشيكاوا). خلال هذا المقطع، جعل مختبرين 2 الخلايا ~ 100,000 كل (تقريبا 1/10عشر من لوحة 6-جيدا) إلى أنابيب ايبندورف مل 1.7 منفصلة 2 لعزل الحمض النووي والجيش الملكي النيبالي، على التوالي. تدور هذه الأنابيب إلى أسفل (5 دقيقة، 250 x g) وإزالة التربسين من بيبيتينج وتجميد هذه الأنابيب في-20 درجة مئوية لاستخدامها في المستقبل. عزل الحمض النووي باستخدام أدوات متوفرة تجارياً وإجراء PCR باستخدام “pAC95_PCR” أو “SID4X_PCR” كبسولة تفجير (الجدول 1) للتحقق من وجود البروتين الانصهار داخل في خط الخلية. استخدام الحمض النووي المستخرج من السطر الوالدية كعنصر سلبي، و SID4x-dCas9-KRAB بلازميد الحمض النووي كعنصر إيجابي. استخدام مزيج رئيسي بوليميريز عالية الدقة مع 50-100 نانوغرام من الحمض النووي وركوب الدراجات الشروط التالية: 98 درجة مئوية لمدة 30 ق، 25 دورات ل (98 درجة مئوية لمدة 10 s، 58 درجة مئوية لمدة 30 ق، 72 درجة مئوية لمدة 2 دقيقة)، 72 درجة مئوية لمدة 5 دقائق ، عقد في 4 درجات مئوية. للتحقق من التعبير عن البروتين الانصهار على مستوى الحمض النووي الريبي، إجراء قبكر مع الحمض النووي الريبي المستخرج من الخط الخلية باستخدام أدوات متوفرة تجارياً. استخدام كبسولة تفجير “dCas9_qPCR” (الجدول 1)، وبروتوكول قبكر خطوة واحدة في خطوة 6.3 لهذا البروتوكول. للتحقق من مستوى بروتين تعبير الانصهار، نفذ الغربية وصمة عار على ليساتيس من خط الخلية. استخدام العلم لمكافحة أو مكافحة-ها الأجسام المضادة للكشف عن البروتين الانصهار. 2-دليل الحمض النووي الريبي التصميم ملاحظة: هذا البروتوكول مصمم للاستخدام مع الجيش الملكي النيبالي دليل U6 استنساخ المتجهات التي تم إنشاؤها من قبل مختبر الكنيسة ومتاح على أدجيني (أدجيني 41824). لإنشاء نسخة من هذه النواقل تحتوي على المقاومة بوروميسين التي سمحت لنفس الاستراتيجية الاستنساخ ك 41824، انتقلنا في موقع الاستنساخ لأغراض متعددة من هذا متجه إلى ناقل pGL3-U6-سجرنا-PGK-بوروميسين (أدجيني 51133). أما 41824 أدجيني أو الإصدار لدينا مع بوروميسين (106404 أدجيني) متوافقة مع الاستراتيجية الاستنساخ المبينة أدناه. الحصول على باسيبيرس 600-900 من تسلسل الحمض النووي لكل المنطقة التنظيمية للفائدة. استخدام مواقع الربط عامل النسخ و/أو الكروماتين إمكانية الوصول لتوجيهات بشأن أين يمكن تحديد المنطقة التي تهم (الشكل 2A).ملاحظة: بينما المثال في الشكل 2 ألف يتميز بالقدرة على المنبع والمصب، من الممكن أيضا لاستهداف العناصر التنظيمية التي تقع داخل إينترونس. ضع كافة تسلسل الحصول عليها في ملف نصي واحد باستخدام تنسيق FASTA. تحديد المنطقة مراقبة سلبية واحدة على الأقل التي لا يتوقع أن تتغير مع الظروف التجريبية، كمروج للجينات التي يتم التعبير عنها لا في خط الخلية للفائدة. الحصول على تسلسل الحمض النووي لهذه المنطقة وإضافته إلى ملف نص بتنسيق فاستا.ملاحظة: نحن نستخدم دليل الكشف استهداف مروج IL1RN 25 كعنصر تحكم سلبية لجميع المناطق نحن نستهدف. يمكن للمستخدمين أيضا تحديد تسلسل إينتيرجينيك قرب منطقة الفائدة التي لا تحتوي على مواقع الربط عامل النسخ كعنصر سلبي. ومع ذلك، إذا كان يجري استهداف مواقع متعددة في نفس الوقت، يبسط منطقة تحكم سلبي واحد التصميم التجريبي وتفسير النتائج. إذا كان محسن المستهدفة إينترونيك، قد يكون من المفيد أن المستهدف منطقة إينترونيك في المكان نفسه يحتوي على عنصر تنظيمي المفترضة كعنصر تحكم سلبية إضافية، كالانصهار dCas9 قد تتداخل مع النسخ. تحديد مناطق السيطرة الإيجابية، مثل المروجين هي الأهداف المفترضة للمناطق التنظيمية التي تهم، أو المروجين للجينات التي يتم نسخها عاليا في خط الخلية للفائدة. الحصول على تسلسل الحمض النووي لهذه المناطق وإضافته إلى ملف نص بتنسيق فاستا. استخدم برنامج مثل هش ه26 (http://www.e-crisp.org/E-CRISP/) في تسلسل الحمض النووي التي ولدت للعثور على دليل الكشف مع انخفاض قبالة-الأهداف (ومن الناحية المثالية 0-3). دليل الكشف تتكون من 20 النيوكليوتيدات المنبع لفكرة المجاورة بروتوسباسير (بام)، الذي يأخذ الشكل “نج” ل dCas9 من س. المقيّحة. على الموقع الإلكتروني-هش، حدد الكائن حي اهتمام باستخدام القائمة المنسدلة. الجمعية الجينوم تظهر إلى يمين اسم الأنواع. حدد زر الاختيار إدخال تسلسل FASTA . نسخ في تسلسل فاستا من فوق ولصقها في مربع الحوار. التأكد من تضمين لكل تسلسل رأس FASTA.ملاحظة: ما يصل إلى 50 تسلسل يمكن الاستعلام في وقت واحد. حدد زر الاختيار المتوسطة و تصميم واحد في القائمة المنسدلة. انقر فوق الزر بدء البحث سجرنا. سيتم فتح علامة تبويب جديدة في مستعرض، وسيتم عرض النتائج. تحميل تسلسل المرشح بالنقر فوق الزر تنزيل تقرير Excel تنسيق جدولي لكافة سلاسل الاستعلام معا. افتح التقرير جداول باستخدام Excel أو برنامج تحرير نص. استخدام مستعرض الجينوم التسخن على بلاط المرشح جرنة كامل طول سلاسل (23 باسيبيرس) للجينوم. في مستعرض، انتقل إلى موقع ويب مستعرض الجينوم التسخن (http://genome.ucsc.edu). ضمن المقطع أدواتنا، موقع كلمة بلاط وانقر فوقه. سيتم فتح “الأداة البحث” بلاط. استخدم القوائم المنسدلة الموجودة ضمن نص بلاط البحث الجينوم لتحديد الجمعية الكائن الحي والجينوم للفائدة. نسخ تسلسل الحمض النووي الريبي دليل من تقرير جدولي التي تم إنشاؤها بواسطة هش ه ولصقها في مربع الحوار. التأكد من أن كل تسلسل رأس FASTA فريدة من نوعها، ثم انقر فوق إرسال في الجزء السفلي من مربع الحوار.ملاحظة: ما يصل إلى 25 تسلسل يمكن النظر في وقت واحد. على صفحة نتائج البحث بلاط ، ستظهر التحالفات لكل دليل تسلسل الحمض النووي الريبي، مع كل خط يمثل محاذاة. ومن الناحية المثالية، ينبغي أن تكون محاذاة واحدة لكل دليل الحمض النووي الريبي، مما يشير إلى الطابع الفريد لهذا الدليل الحمض النووي الريبي. تجنب الأدلة التي تتناسب مع مواقع متعددة في الجينوم إذا كان ذلك ممكناً. بحث دليل الحمض النووي الريبي الترجمة والتوزيع داخل المنطقة من الفائدة، انقر فوق الارتباط المستعرض تحت المقطع الإجراءات لواحد من الكشف دليل المستعلم عنها. ستظهر مستعرض الجينوم وسيتم توسيط في الدليل المحدد الجيش الملكي النيبالي. استخدم أزرار التصغير في الجزء العلوي من الصفحة لتصور توزيع دليل أخرى حددها الكشف هش ه داخل منطقة الفائدة. حدد 4 يفضل عدم تداخل دليل الحمض النووي الريبي تسلسلات التي توزع في جميع أنحاء المنطقة للفائدة (الشكل 2). إذا كانت المنطقة التي تهم تتجاوز 600 شركة بريتيش بتروليوم، النظر في إضافة أدلة إضافية 1-2. تجنب دليل الكشف مع الامتدادات هوموبوليميريك والمدقع GC المحتوى، هذه الميزات يمكن أن تعوق دليل الحمض النووي الريبي استنساخ العملية وتقليل دليل الحمض النووي الريبي استهداف الكفاءة. مرة واحدة وقد تم اختيار الأدلة، إنشاء ملف يحتوي على تسلسل الحمض النووي الريبي (23 النيوكليوتيدات) دليل كامل لكل الدليل المطلوب، ومن ثم إزالة النوكليوتيدات 5 ‘، وكذلك”بام”(نج) من نهاية 3’. وتسهل هذه الخطوة يأمر اليغو. إضافة التسلسل التالي لنهاية 5 ‘ تسلسل اليغنوكليوتيد: جتجااجاكجااكاككج. إضافة التسلسل التالي لنهاية 3 ‘ تسلسل اليغنوكليوتيد: جتتتاجاجكتاجااتاجك.ملاحظة: تسلسل النهائي ينبغي أن يكون النيوكليوتيدات 59 منذ وقت طويل، وتبدو مثل هذا: جتجااجاكجااكاككج-الهدف (19 nt)-جتتتاجاجكتاجااتاجك. ضمان أن كل عنصر تنظيمي مستهدفين مع محسن-ط 4 على الأقل النوكليوتيد فريدة مصممة لذلك. ترتيب هذه التسلسلات جنبا إلى جنب مع الإشعال “U6_internal” المدرجة في الجدول 1. 3-دليل استنساخ الحمض النووي الريبي ملاحظة: دليل الحمض النووي الريبي الاستنساخ عن طريق الجمعية جيبسون قد ثبت أن ذات كفاءة عالية في أيدينا، مما أسفر عن مئات مستعمرات كل لوح، مع قليل إذا أي مستعمرات موجودة في ناقلات فقط. هذه الكفاءة أمر حاسم للحفاظ على تعقيد أثناء استنساخ المجمعة. وهناك ميزة أخرى للجمعية جيبسون الاستنساخ هو أن المستخدمين لا داعي للقلق حول وجود إنزيم التقييد قطع الموقع في دليل الحمض النووي الريبي أنهم يحاولون إدراج ناقل الاستنساخ U6. ومع ذلك، هذا البروتوكول يمكن تكييفها لأنزيم التقييد التقليدية القائمة على الاستنساخ إذا رغبت في ذلك. إعادة تشكيل أوليجوس دليل الحمض النووي الريبي بتركيز نهائي من 100 ميكرومتر في الماء عالي النقاوة (خالية من رناسي، خالية من الدناز). ينبغي أن يكون هناك على الأقل 4 أوليجوس دليل منفصل الحمض النووي الريبي لكل منطقة من الفائدة. لكل منطقة تنظيمية ذات الاهتمام، إنشاء تجمع من جميع أوليجوس المقابلة لمنطقة الاهتمام. في أنبوب ايبندورف، الجمع بين 5 ميكروليتر من كل اليغو الحمض النووي الريبي دليل المعاد تشكيلها الفردية لكل منطقة. مزيج المسبح جيدا قبل فورتيكسينج، ثم إزالة ميكروليتر 1 وتمييع هذا 1: 200 الكوة في الماء عالي النقاوة.ملاحظة: إذا رغبت في ذلك، تجمعات هذه تستهدف المناطق التنظيمية الفردية يمكن كذلك الجمع بين لتوليد مجموعة معقدة تستهدف مناطق متعددة. ما يصل إلى 50 المناطق التنظيمية قد تستهدف في أن واحد في مجمع واحد (الشكل 3). أداء بكر قصيرة مع الإشعال U6 لإرفاق مناطق التماثل أوليجوس قبل الجمعية جيبسون. أسس حوالي 40 ستضاف إلى كل اليغو، تسفر عن منتج شركة بريتيش بتروليوم ~ 100 يحتوي على التماثل كافية لناقل U6 على طرفي. لكل دليل تجمع الجيش الملكي النيبالي، إعداد من 20 ميكروليتر بكر مع مزيج رئيسي بوليميريز عالية الدقة والمكونات التالية: 1 ميكروليتر من تجمع اليغو المخفف من الخطوة 3، 2، 1 ميكروليتر من U6 إلى الأمام التمهيدي (10 ميكرومترات)، 1 ميكروليتر من U6 عكس التمهيدي (10 ميكرومترات) ، والماء يصل إلى 20 ميكروليتر. احتضانها في cycler حرارية مع الشروط التالية: 98 درجة مئوية لمدة 30 ق، 10 دورات ل (98 درجة مئوية لمدة 10 s، 55 درجة مئوية لمدة 30 ق، 72 درجة مئوية لمدة 2 دقيقة)، 72 درجة مئوية لمدة 5 دقائق، وعقد في 4 درجات مئوية. تشغيل 5 ميكروليتر من رد فعل في 1-2% [اغروس] هلام مع سلم وزن الجزيئي منخفض. يجب أن يكون المنتج النهائي ~ 100 باسيبايرس (الشكل 2). تنظيف رد فعل التمديد مع مجموعة تنقية الحمض النووي القائم على العمود، والوت في 20 ميكروليتر من شطف المخزن المؤقت المنصوص عليها في هذه المجموعة.ملاحظة: كما المنتج قصيرة، تجنب استخدام حبة-على أساس عمليات تنظيف، التي ترمي إلى استبعاد الأجزاء الصغيرة أقل من 100 شركة بريتيش بتروليوم. التحديد الكمي لتنقية الحمض النووي باستخدام فلوروميتير أو جهاز المطياف الضوئي (يتوقع العائد 10-20 نانوغرام/ميكروليتر). إدراج دليل الحمض النووي الريبي يمكن تخزينها في-20 درجة مئوية، أو يمكن استخدامها مباشرة في الجمعية جيبسون مع ناقل U6 خطية. لإعداد المستلم U6 ناقل الاستنساخ للجمعية جيبسون، إعداد خلاصة إنزيم التقييد. إذا كانت العديد من ردود الفعل الجمعية جيبسون التي يتعين القيام بها، إعداد النبذ متعددة لضمان العائد يكفي لناقلات قطع. استخدام وحدات 20 إنزيم أفليي و 1 ميكروغرام من بلازميد في رد فعل 20 ميكروليتر مع المخزن المؤقت إنزيم التقييد الملائمة. احتضان في 37 درجة مئوية ح 1-2. تنظيف في ملخص مع الخرز أو مجموعة تستند إلى عمود لتنقية الحمض النووي والوت في 20 ميكروليتر من شطف المخزن المؤقت. التحديد الكمي لتنقية الحمض النووي باستخدام فلوروميتير أو جهاز المطياف الضوئي. يمكن تجميد عينات في-20 درجة مئوية لاستخدامها في وقت لاحق. أداء الجمعية جيبسون على ناقلات استعداد وإدراج. إعداد جيبسون الجمعية ردود الفعل على الجليد. استخدام 50 نانوغرام من الناقل و 7 نانوغرام الإدراج في رد فعل 20 ميكروليتر. يضعف إدراج 01:10 في الماء عالي النقاوة لتسهيل بيبيتينج. إعداد ناقلات فقط جيبسون الجمعية رد فعل، باستخدام 50 نانوغرام الناقل والاستعاضة عنها الإدراج مع الماء. احتضان ردود الجمعية جيبسون لمدة 15 دقيقة عند 50 درجة مئوية، يليها عقد في 4 درجات مئوية. نقل المنتجات المجمعة الجليد. تمييع المنتجات المجمعة 1:4 في الماء عالي النقاوة على الجليد. على سبيل المثال، إضافة 5 ميكروليتر من المنتج الجمعية جيبسون 15 ميكروليتر من الماء عالي النقاوة. تحويل منتجات الجمعية جيبسون المخفف. تحسن كفاءة عالية الخلايا المختصة على الجليد وجعل 25 ميكروليتر مختبرين لكل تحويل. إذا كان المطلوب هو مجموعة معقدة تستهدف مواقع متعددة، إذابة خلايا كافية إلى أنابيب مختلفة تنفيذ تحويلات مستقلة متعددة من نفس تجمع جرنة المعقدة. لكل منتج المخفف، إضافة 1 ميكروليتر من هذا التخفيف إلى مل 1.7 ايبندورف الأنبوبة التي تحتوي على 25 ميكروليتر من الخلايا المختصة. مزيج من خلال يسددها الأنبوب بإيجاز. احتضان هذه الأنابيب على الجليد لمدة 30 دقيقة. صدمة الحرارة الخلايا لمدة 30 ثانية في 42 درجة مئوية، ثم نقل فورا إلى الجليد لمدة 2 دقيقة. إضافة 300 ميكروليتر وسائل الإعلام شركة نفط الجنوب (تريبتوني 2%، 0.5% خميرة مقتطف، 10 مم كلوريد الصوديوم، 2.5 مم بوكل، 10 مم مجكل الجلوكوز2و 10 مم MgSO4، و 20 مم) وترك الخلايا استرداد ل 1 ساعة عند 37 درجة مئوية مع الهز (300 لفة في الدقيقة). وخلال هذا الوقت، الحارة لوحات أجار مع الأمبيسلّين/كاربينيسيلين إلى 37 درجة مئوية في حاضنة. استخدم لوحة واحدة لكل تحويل. لوحة 50 ميكروليتر من الخلايا ووضع اللوحات في حاضنة 37 درجة مئوية بين عشية وضحاها. لحمامات السباحة استهداف مواقع فردية ومباشرة في 3-5 مل مرق رطل (جدول المواد) التي تتضمن الأمبيسلّين/كاربينيسيلين (1 ملغ/مل) واحتضان بين عشية وضحاها مع تهتز عند 250 دورة في الدقيقة في 37 درجة مئوية مينيبريبس. حصاد الخلايا وعزل الحمض النووي. لاستهداف عدة مواقع مكتبات الحمض النووي الريبي دليل كبير، استخدام مكشطة طبق لجمع جميع المستعمرات من كل لوحة فردية إلى ماكسيبريب واحد (150 مل الثقافة السائلة). ويمكن تيسير هذا بصب ~ 5 مل من رطل مع المضادات الحيوية المناسبة في أنبوب فالكون 50 مل وتجريف المستعمرات في الأنبوب. لمكتبات استهداف مواقع فردية، كشط اللوحات في مينيبريب (3-5 مل سائل الثقافة). احتضان هذه الثقافات مع المضادات الحيوية المناسبة ح 3-5 في 37 درجة مئوية مع الهز 250 لفة في الدقيقة. القيام باستخراج الحمض النووي باستخدام مجموعة النتائج في محضرات خالية من الذيفان. تحديد كمية الحمض النووي باستخدام فلوروميتير أو جهاز المطياف الضوئي. يمكن استخدامها على الفور في تعداء البلازميدات أو المخزنة في-20 درجة مئوية لاستخدامها في المستقبل. لتأكيد وجود تسلسل الحمض النووي الريبي دليل داخل ناقل U6 لتجمعات صغيرة تستهدف مواقع واحد، استخدم سانغر التسلسل في مينيبريب المعدة مع التمهيدي “U6_PCR_R” المدرجة في الجدول 1. نظراً لتجميع دليل الكشف، تسلسل الهدف جرنة باسيبير 19 سوف تسفر عن قواعد مختلطة، ولكن ينبغي سليمة مروج U6 ودليل الحمض النووي الريبي سقالة المحيطة بهذا التسلسل. 4-تعداء محسن-i ملاحظة: للحصار ناجحة من استجابة الإستروجين استخدام محسن-ط في الخلايا إيشيكاوا، من الضروري أن حرمان الخلايا الإستروجين عن 5-7 أيام قبل تعداء بالإبقاء عليها في الفينول الأحمر ربمي حرة مع 10% الفحم-جردت FBS و 1% البنسلين/ستربتوميسين. الخلايا يجب أن يكون مثقف في هذه الوسائط أثناء وبعد تعداء إذا كان يحاول منع استجابة الإستروجين. نحن نوصي باستخدام من الفينول الأحمر التربسين مجاناً مجاناً ومرور الخلايا في كامل الفينول الأحمر ربمي. لوحة تعداء، قبل يوم من الخلايا (أما البرية من نوع أو ستابلي معربا عن SID4X-dCas9-KRAB) في لوحة 24-جيدا في كونفلوينسي 30-50% (~ 60,000 الخلايا الواحدة وكذلك لخلايا إيشيكاوا). لوحة خلايا كافية أن ترانسفيكشنز يمكن أن يؤديها في التكرارات، وتشمل الآبار تكون transfected مع عنصر تحكم دليل الكشف.  تأكد من أن الخلايا موزعة بالتساوي جيدا برفق الهز اللوحة بعد طلاء الخلية كما هو الحال في الخطوة 1.1.7.ملاحظة: يفترض هذا البروتوكول استعمال الكواشف الأيوني تعداء المستندة إلى الحويصلية. انهانسر يوفر طريقة بديلة لأنواع الخلايا التي تكون حساسة جداً لهذه الكواشف. يجب أن يكون الأمثل تعداء الظروف لخط الخلية الفائدة قبل محاولة تجارب أنا محسن. في اليوم التالي، إعداد ترانسفيكشنز وفقا لتعليمات الكاشف تعداء المفضل. للخلايا إيشيكاوا، استخدام 550 نانوغرام من بلازميد المجموع لكل بئر من صفيحة 24-جيدا. تمييع والبلازميدات إلى نهائي تركز 0.020 ميكروغرام/ميكروليتر في وسائل الإعلام الحرة المصل (1.1 ميكروغرام من الحمض النووي في 52 ميكروليتر من الحجم الإجمالي للآبار 2 ترانسفيكتينج). استخدام 3 ميكروليتر من تعداء كاشف لكل 1 ميكروغرام من الحمض النووي، ودوامه، واحتضان كما هو موضح في الخطوة 1.2. إضافة 25 ميكروليتر من الخليط النهائي لكل بئر.ملاحظة: لمجموعات مستهدفة من مواقع، استخدم نفس الوزن من بلازميد لكل موقع الفردية ومن ثم تعبئة وزن بقايا مع بلازميد تحكم (الرنا دليل فارغة استنساخ متجهة أو دليل الكشف استهداف منطقة مراقبة سلبية مثل IL1RN مروج). بالنسبة ترانسفيكشنز عابرة، استخدم أي بنسبة 3:2 Cas9 الانصهار: دليل الحمض النووي الريبي بلازميد. يمكن إضافة البلازميدات المحتوية على الصحفيين الفلورسنت لرصد كفاءة تعداء. في ح 36 وظيفة تعداء، تغيير الوسيطة باستخدام الفينول الحمراء مجاناً ربمي مع 10% الفحم جردت FBS و 1% البنسلين/ستربتوميسين (للخلايا إيشيكاوا) والعرض بوروميسين (التركيز النهائي: 1 ميكروغرام/مل) والنيوميسين (التركيز النهائي: 300 نانوغرام/مليلتر). إذا كانت الخلايا الحساسة لكاشف تعداء، يمكن تغيير وسائل الإعلام في وقت سابق، ولكن ينبغي أن تضاف المضادات الحيوية لا أقدم من تعداء بعد 24 ساعة.ملاحظة: انتظر 24 ساعة على الأقل بعد إضافة المضادات الحيوية قبل الحصاد الخلايا. ويمكن الكشف عن التغييرات التعبير بسبب محسن-ط في أقرب وقت ح 48 وظيفة تعداء وتصل إلى 5 أيام بعد تعداء. إذا كان العمل مع الخلايا إيشيكاوا التي حرمت من الإستروجين، تؤدي 8-ح 10 نانومتر 17β-استراديول (E2) التعريفي اليوم بعد العلاج بالمضادات الحيوية وثم حصاد الخلايا مباشرة. 5-الخلية الحصاد واستخراج الحمض النووي الريبي إعداد المخزن المؤقت تحلل مع 1% β-mercaptoethanol (BME). ضمان أن هناك يكفي الخليط تحلل BME (300 ميكروليتر لكل جيدا يجري حصاد). نضح الوسائط باستخدام الشافطة فراغ. تغسل الخلايا مرة واحدة مع حجم متساو لبرنامج تلفزيوني 1 x (500 ميكروليتر) وأسبيراتي لإزالة برنامج تلفزيوني قدر الإمكان. إضافة 300 ميكروليتر BME تحلل الحل لكل بئر ماصة متعددة باستخدام. “الماصة؛” الحل تحلل أعلى وأسفل 8-10 مرات، ونقل إلى لوحة الآبار العميقة أو 1.7 مل ايبندورف أنابيب على الجليد. ويمكن استخراج الحمض النووي الريبي فورا، أو يمكن أن تجمد ليساتيس في-80 درجة مئوية لتجهيزها مستقبلا. لاستخراج الحمض النووي الريبي من ليساتيس، استخدام أدوات متوفرة تجارياً يشمل علاج الدناز. الوت في أصغر حجم الموصى بها من الماء عالي النقاوة (خالية من رناسي، خالية من الدناز) أو شطف المخزن المؤقت والتحديد الكمي للجيش الملكي النيبالي. للحصول على عدد قليل من العينات، استخدم فلوروميتير أو جهاز المطياف الضوئي. للحصول على إعداد كبيرة من العينات، استخدام مجس فلورسنت التي يكشف الجيش الملكي النيبالي والتدبير على قارئ لوحة. يمكن تجميد عينات في-80 درجة مئوية قبل أو بعد القياس الكمي. 6-التحديد الكمي “تغييرات التعبير الجيني” استخدام قبكر خطوة واحدة وتسلسل الحمض النووي الريبي الحصول على كبسولة تفجير qPCR للجينات للفائدة والجين التدبير المنزلي واحد على الأقل أن يتم التعبير عن قرب مستوى الجينات المستهدفة ولا تتغير عبر الظروف التجريبية. ومن الناحية المثالية، سوف تمتد هذه كبسولة تفجير مفرق إكسون-إكسون لتجنب تضخيم الحمض النووي. اختبار هذه الإشعال على الحمض النووي الريبي التي تم الحصول عليها من خط خلية للفائدة. استخدام تذوب تحليل منحنى للتحقق من إنتاج منتج واحد. إذا لم يتم إنتاج منتج واحد، اختبار أزواج إضافية التمهيدي. لكل محسن-ط ومراقبة دليل الحمض النووي الريبي تعامل عينة، تحديد يجب جزيئي كم عدد الجينات في هذه العينة. ينبغي أن تشمل هذه المجموعة من المورثات الجينات التدبير المنزلي، مثل كتكف أو جابده. قم بإعداد ردود الفعل qPCR. تمييع جميع العينات بتركيز نفسها في المياه، حيث أن 50 نانوغرام من مجموع الجيش الملكي النيبالي هو بيبيتيد بسهولة، وهناك ما يكفي تضعف الجيش الملكي النيبالي لكل رد فعل. على سبيل المثال، تضعف الجيش النيبالي الملكي في ~16.6 نانوغرام/ميكروليتر واستخدام ميكروليتر 3 من الحمض النووي الريبي في كل رد. إبقاء الجيش الملكي النيبالي على الجليد أثناء إعداد يمزج الرئيسي. إعداد يمزج رئيسي منفصل لكل الجينات التي تقاس باستخدام مجموعات qPCR المتاحة تجارياً في خطوة واحدة. استخدام وحدة تخزين رد فعل 20 ميكروليتر مع ميكروليتر 1 من كل التمهيدي (10 ميكرومترات حل الأسهم). قم بإعداد ردود الفعل هذه على الجليد. في صفيحة رد فعل المناسب ل cycler الحرارية، إضافة عينات الحمض النووي الريبي تليها يمزج الرئيسي. ختم مع السدادة لوحة وتخلط بلطف من فورتيكسينج أو بيبيتينج. بإيجاز الطرد المركزي اللوحة (ز 140 x 60 s) التأكد من أن السائل في الجزء السفلي من الآبار. احتضان اللوحة في cycler حرارية النحو التالي (أو كأدوات يرشد): 48 درجة مئوية لمدة 30 دقيقة، 95 درجة مئوية لمدة 10 دقائق، دورات 40 من (95 درجة مئوية لمدة 15 ثانية، 60 درجة مئوية لمدة 1 دقيقة). الحصول على قيم التصوير المقطعي للجينات كل قياس داخل كل عينة. استخدام الأسلوب Ct النسبية للتعرف على التغيرات في التعبير الجيني. طرح Ct الجينات التدبير المنزلي من الأشعة المقطعية لكل الجينات من أهمية بالنسبة لكل عينة لتوليد القيم المقطعية طبيعية. تعامل العينات، يستغرق في المتوسط من القيم المقطعية طبيعية لكل الجينات لعنصر التحكم. ثم يمكن حساب سجل الأساس 2-مقياس حظيرة القمع بطرح نموذج محسن-i يعامل تطبيع Ct لكل الجينات من نفس القيمة لمراقبة تعامل العينة للجينات المقابلة. لتحديد التغيرات العالمية في التعبير الجيني بعد العلاج محسن-i، إعداد العينات لتسلسل الحمض النووي الريبي استخدام مجموعة أدوات متوفرة تجارياً متوافقة مع تكنولوجيا التسلسل الخاص بالمستخدم. الاستخدام ~ 500 نانوغرام من الحمض النووي الريبي لابتداء من المواد وإعداد مكتبات replicates البيولوجي 2 على الأقل. 7-التحقق من استهداف الجينوم محددة من SID4X-dCas9-KRAB باستخدام رقاقة-seq ملاحظة: يحتوي على بروتين الانصهار SID4X-dCas9-KRAB علامة حانمه علم وعلامة حانمه هكتار، ولكن تم الحصول على نتائج أفضل لرقاقة seq مع الأجسام المضادة العلم. المستخدم إذا رغبت في ذلك، يمكن إجراء المزيد من التجارب seq رقاقة عوامل النسخ التي يحتمل أن تتأثر بمحسن-i، أو H3K27ac، علامة النشاط محسن أن يتناقص بمحسن-ط. ومع ذلك، يتطلب كل تجربة رقاقة seq 10 × 106 خلايا، خطة ذلك تبعاً لذلك. ترانسفيكت الخلايا التي تحتوي على تجمعات محسن-i. لوحة 10 × 106 خلايا في طبق استنبات الأنسجة 15 سم. ويمثل كل طبق 1 رقاقة seq التجربة بالنسبة لعامل واحد من الفائدة. وفي اليوم التالي ترانسفيكت الخلايا باستخدام 20 ميكروغرام من مجموع الحمض النووي للطبق الواحد. ترانسفيكشنز في خطوط الخلايا ستابلي معربا عن SID4X-dCas9-KRAB، أن الحمض النووي تكون بركة بلازميد دليل الكشف تستهدف جميع المواقع ذات الأهمية، واختيارياً بلازميد التعبير عن البروتين الفلورسنت. بالنسبة ترانسفيكشنز عابرة، استخدم أي بنسبة 3:2 dCas9 الانصهار البروتين: دليل الحمض النووي الريبي بركة. لرقاقة seq TFs أو هيستون تعديلات أخرى، تنفيذ تعداء دليل الحمض النووي الريبي تحكم إضافي واحد على الأقل على طبق آخر. علاج الأطباق مع بوروميسين (1 ميكروغرام/مل) والنيوميسين (300 نانوغرام/مل) في ح 24-48 وظيفة تعداء. انتظر 24 ساعة على الأقل قبل الحصاد الكروماتين. الكروماتين الحصاد من الأطباق.ملاحظة: لدراسة آثار محسن-ط على ملزمة ER الجينوم في الخلايا إيشيكاوا، إجراء علاج نانومتر E2 ح 1 10 على أطباق transfected مع مراقبة دليل الكشف وأنا محسن قبل الحصاد. لدراسة آثار محسن-ط على H3K27ac، وتؤدي ح 8 10 نانومتر التعريفي E2 على الأطباق transfected مع مراقبة دليل الكشف وأنا محسن قبل الحصاد. تطبيق 500 ميكروليتر من 37% فورمالدهيد على كل طبق (تركيز النهائي من 1%). دوامة اللوحات بإيجاز. واسمحوا لوحات الجلوس في درجة حرارة الغرفة لمدة 10 دقائق. أضف 1 مل من 2.5 م جليكاين (تركيز النهائي من 125 مم). دوامة اللوحات بإيجاز. من أجل إيقاف تشغيل وسائط الإعلام مع الفورمالدهيد وجليكاين. إضافة وحدة تخزين متساوية (~ 20 مل) من برنامج تلفزيوني الباردة x 1. من أجل إيقاف برنامج تلفزيوني. نضح مع المضخة فراغ لإزالة برنامج تلفزيوني قدر الإمكان. ضع الأطباق على الجليد. إضافة 3-5 مل من البرد 1 × برنامج تلفزيوني أو فارنهام تحلل المخزن المؤقت (5 ملم أنابيب pH 8.0، 85 ملم بوكل، 0.5% NP-40) مع 1 × مثبط البروتياز (أضيف فقط قبل الاستخدام) لكل لوحة. كشط الطبق مع مكشطة لوحة ونقل الحل إلى أنبوب مخروطي 15 مل على الجليد. بيليه الكروماتين بالغزل أسفل أنابيب في أجهزة الطرد مركزي لمدة 5 دقائق في 4 درجات مئوية في 1000 x غ. تجاهل المادة طافية وتخزين الكريات في-80 درجة مئوية للاستخدام في المستقبل، أو المضي قدما في البروتوكول seq رقاقة من خيار استخدام جسم المضادة علم أو الأجسام المضادة التي تستهدف الأخرى عوامل النسخ أو تعديلات هستون من الفائدة (H3K27ac، H3K9me3).

Representative Results

ويبين الشكل 1 تخطيطي لسير العمل المبينة في البروتوكول. وصممت لتحديد المساهمات من القدرة على ربط ER قرب الجين ينظم الإستروجين MMP17، التي لديها 3 مواقع الربط القريبة كما حددتها شريحة-seq (الشكل 2A)، دليل الكشف لكل منطقة. تصميم دليل الكشف، نافذة bp 600-900 من تسلسل المحيطة بكل لائحة تحديد موقع ملزمة للفائدة ووضع في برنامج تصميم دليل الحمض النووي الريبي. الناتج دليل تسلسل الحمض النووي الريبي مع توقع إيقاف المستهدفة كانت محاذاة مواقع للجينوم البشري باستخدام بلاط 2-0. أربعة غير متداخلة دليل الكشف التي امتدت المنطقة التي تعرف بواسطة seq رقاقة وفرط دناسي اختيرت لاستهداف (الشكل 2). وأضيفت إلى كل نهاية لتسهيل استنساخ المتلقين للمعلومات وما يترتب على ذلك 59 النوكليوتيدات الشظايا صدرت تسلسل إضافية (الجدول 1). ولدى وصوله، أجرى دليل الكشف المخفف وتجميعها حسب الموقع، وبكر قصيرة لإضافة مناطق التماثل قبل الجمعية جيبسون. يظهر الشكل 2 دليل المنتج الحمض النووي الريبي دليل المتوقعة بعد بكر قصيرة استخدام كبسولة تفجير “U6_internal” (الجدول 1)، التي ستضيف باسيبيرس 20 من تسلسل لكل نهاية باسيبير 59 بلغة الجيش الملكي النيبالي، أسفر عن تسلسل باسيبير ~ 100. وبعد الجمعية جيبسون، برك دليل الحمض النووي الريبي هذه تحولت إلى البكتيريا ومينيبريبس بلازميد أعدت في اليوم التالي. ويبين الشكل 2D النتائج من تجربة تسلخ محسن، حيث يتم استهداف معززات متعددة القريبة MMP17 وحدها، وفي الجمع بين استخدام محسن-i. يتم الإشارة إلى المواقع المستهدفة بمحسن-ط مع مسدس أسود. تم transfected دليل الحمض النووي الريبي والبلازميدات استهداف المواقع المشار إليها في حرمان الإستروجين إيشيكاوا خلية خط ثابت معربا عن SID4X-dCas9-KRAB. بعد يومين، تم تغيير الوسائط وتمت إضافة بوروميسين إلى إثراء للخلايا ترانسفيكتيد. في اليوم التالي، كانت الخلايا تحصد بعد علاج استراديول شمال البحر الأبيض المتوسط 8 ح 10. الجيش الملكي النيبالي معزولة، وأنجز قبكر خطوة واحدة. في هذا المثال، المواقع 1 و 2 اللازمة لرد إستروجين كامل من MMP17، بينما لا تساهم الموقع 3 تحت هذه الظروف (الشكل 2D، الممرات الثاني إلى الرابع). عندما تكون نشطة فقط مواقع 2 أو 3 (السادس والسابع)، تشبه الإستروجين استجابة عندما تكون أية مواقع نشطة (الثامن)، مما يوحي بأن هذه المواقع لا يمكن أن تسهم بشكل مستقل. موقع 1 يمكن أن تسهم بعض التعبير بحد ذاته (v)، ولكن ينظر إليه بنشاط أكبر عندما تنشط المواقع 1 و 2 (رابعا). للتعامل مع القدرة على 10 قرب 4 جينات مختلفة في وقت واحد (الشكل 3 ألف)، مجموعات معقدة من دليل الكشف تم إنشاؤها تحتوي على 42 محسن أدلة وأدلة المروج 16. تم تجميع دليل الحمض النووي الريبي أوليجوس قبل الدليل الأولى الجيش الملكي النيبالي تمديد بكر (3.3 خطوة)، والناتجة عن PCR منتجات تنقية وجنبا إلى جنب مع ناقل الاستنساخ U6 بوروميسين فارغة استخدام الجمعية جيبسون. في أعقاب الجمعية جيبسون، إجراء تحويلات مستقلة متعددة ومطلي. اللوحات كشط إلى رطل ويسمح لها أن تنمو خارج عن ح 2-4 قبل ماكسيبريب. ويبين الشكل 3B تخفيضات الممثل في التعبير الجيني حسب qPCR عند هذه تجمعات الحمض النووي الريبي دليل تم transfected إلى حرمان الإستروجين إيشيكاوا خلية خط ثابت معربا عن SID4X-dCas9-KRAB وتعامل كما هو موضح أعلاه (الشكل 2D). تخفيضات من محسن-i مماثلة لتلك التي حصل عليها استهداف المروج للجينات المستهدفة المفترضة. يبين الشكل 3 آثار تخفيف دليل الكشف عن الحد الاستجابة الإستروجين باستخدام محسن-ط. مواقع 01:50 تمييع بركة دليل الحمض النووي الريبي لاستهداف محسن القرب من G0S2 لا تزال تعطي تخفيض كبير في التعبير الجيني، مما يوحي بأن محسن أنا يمكن أن تستخدم لاستهداف يصل إلى 50 مرة. ومع ذلك، إبطال مفعول يمكن أن تضعف، مما يشير إلى أن مئات المواقع لا يمكن أن تكون مستهدفة في وقت واحد ما لم يتم استخدمت أساليب أكثر حساسية للكشف عن. رقم 1. بروتوكول التخطيطي لتشريح محسن متعدد باستخدام محسن–أولاً تم تصميم دليل الكشف (أحمر وأزرق) باستخدام هش ه والمحددة باستخدام مستعرض الجينوم التسخن. ويتم اختيار أربعة دليل الكشف التي تمتد عبر مناطق الاهتمام (النسخ مواقع الربط عامل كما حددتها شريحة seq). دليل الحمض النووي الريبي النوكليوتيد التي قد تم تجميعها حسب منطقة الاهتمام (أحمر وأزرق) الخضوع بكر إضافة مناطق التماثل (برتقالي) قبل الجمعية جيبسون والتحول. هي transfected برك بلازميد الناتجة عن طريق ليبوفيكشن في خطوط الخلايا ستابلي معربا عن SID4X-dCas9-KRAB أو في البرية من نوع الخلايا بالتزامن مع بلازميد SID4X-dCas9-KRAB. يمكن transfected دليل الحمض النووي الريبي بلازميد برك منفردة لاستهداف موقع واحد في وقت واحد، أو في تركيبة لاستهداف مواقع متعددة في وقت واحد. Transfected الخلايا تعامل مع المضادات الحيوية لإثراء للخلايا التي تحتوي على دليل الكشف. في ح ~ 72 وظيفة تعداء، يتم حصاد الخلايا. ويمكن استخراج الأحماض النووية قبكر أو تسلسل الحمض النووي الريبي أو ما يليها رقاقة الرجاء انقر هنا لمشاهدة نسخة أكبر من هذا الرقم- الرقم 2. دليل الحمض النووي الريبي تشريح التصميم ومحسن ل MMP17. (أ) الجينوم مستعرض لقطة من معززات ألفا زمنياً ER (رمادي) هدفا لقرب MMP17. وقد تم تعديل هذا الرقم من كارلتون، et al. 18- (ب) “دليل الحمض النووي الريبي” تصاميم 3 ملزم مواقع18. الموقع ملزم للائحة كما حددتها شريحة seq هو الهدف، وبلاط الكشف دليل 4 عبر هذه المنطقة. يمكن أيضا استخدام إشارة حساسية دناسي، التي تمتد عبر الموقع ملزم، تعريف تسلسل المستهدفة لدليل تصميم الحمض النووي الريبي. تم الحصول على رقاقة seq وبيانات “النظام المنسق دناسي” من الخلايا إيشيكاوا تعامل مع 10 نانومتر استراديول حاء – 1 (ج) دليل الممثل تسلسل الحمض النووي الريبي التي على استعداد للجمعية جيبسون، بعد أن خضع بكر قصيرة إضافة مناطق التماثل. (د) التعبير النسبي من MMP17 يقاس عن طريق qPCR عقب استهداف مناطق محددة مع محسن-ط وهو علاج استراديول شمال البحر الأبيض المتوسط 8-h10. التعبير بالنسبة إلى مستوى MMP17 في الخلايا التي لا تعامل مع استراديول كتكف والتعبير. دليل مراقبة الكشف تستهدف المروج IL1RN. تمثل كافة أشرطة الخطأ ووزارة شؤون المرأة، وتشير العلامات النجمية مزدوجة ف < تشير العلامات النجمية 0.01 وواحد ف < 0.05 في اختبار t المزدوجة. وقد تم تعديل هذا الرقم من كارلتون، وآخرون. 18- الرجاء انقر هنا لمشاهدة نسخة أكبر من هذا الرقم- الشكل 3. استهداف متعددة القدرة على القرب من جينات مختلفة في أن واحد مع تجميع محسن–أولاً (أ) التخطيطي لمواقع الربط والمروجين مستهدفين في المجمعة محسن-ط. (ب) آثار على التعبير كما تقاس قبكر بعد العلاج E2 في الخلايا إيشيكاوا transfected مع محسن-i بلازميد بركة (الأخضر)، أنا مروج بلازميد بركة (الأزرق) أو التحكم جرناس (أبيض)18. ويلاحظ انخفاضا كبيرا في جميع الجينات مع محسن-i. تم تعديل هذا الرقم من كارلتون، وآخرون. 18- (ج) آثار على مستويات التعبير G0S2 بعد العلاج E2 في الخلايا إيشيكاوا transfected مع كميات مختلفة من دليل الكشف استهداف G0S2. يمكن ملاحظة انخفاض كبير حتى مع كميات صغيرة من دليل الحمض النووي الريبي (01:50 إضعاف)، مما يوحي بأن يصل إلى 50 موقعا قد استهدفت في وقت واحد. تمثل كافة أشرطة الخطأ ووزارة شؤون المرأة، وتشير العلامات النجمية مزدوجة ف < تشير العلامات النجمية 0.01 وواحد ف < 0.05 في اختبار t المزدوجة. الرجاء انقر هنا لمشاهدة نسخة أكبر من هذا الرقم- الاسم التسلسل U6_internal_F تتكتجكتتاتاتاتكتجتجااجاكجااكاككج U6_internal_R جاكتاجككتاتتتاكتجكتاتتتكتاجكتكتاااك U6_PCR_F ككاتكاجتكجاكتجاتككجتا U6_PCR_R آآآآآآجكاككجاكتكجتجككا gRNA_qPCR_F جكتاجااتاجكاجتاااتاجكتاجتككج gRNA_qPCR_R آآآآجكاككجاكتكجتجكك dCas9_qPCR_F جتجاككجاججاتجاجاا dCas9_qPCR_R أجكتجكتكاكجتكاكتت pAC95_PCR_F أجاجاجااجتجاجكك pAC95_PCR_R كجتكاككجكاتجتاجاج SID4X_PCR_F كاتاجااكتججكتجتكج SID4X_PCR_R تكجتجكتكتاتككتكتكك الجدول 1. الإشعال المستخدمة للملحق دليل الحمض النووي الريبي وتسلسلها، قبكر، والكشف عن البروتين الانصهار.

Discussion

ويصف هذا البروتوكول طريقة بسيطة ومرنة لتشريح وظيفة محسن في موقع جينومي الذاتية دون تغيير تسلسل الحمض النووي جسديا. بينما مماثلة في مفهوم إلى كريسبر المنشورة سابقا تدخل بروتوكولات استخدام dCas9 KRAB27، يختلف محسن-i هذه البروتوكولات في 3 طرق رئيسية. أولاً، يستخدم محسن-i SIN3A مجال التفاعل MAD120 تحقيقا للتعطيل محسن. يمكن إنقاذهم التعطيل محسن استخدام مثبطات هداك، مما يدل على أن الآلية الرئيسية للتعطيل هداك تعتمد. على عكس التدخل كريسبر dCas9 KRAB، أنا محسن لا يؤدي إلى ترسب H3K9me3. هذا المرجح يرجع ذلك إلى حقيقة أن محسن-i تعتمد على إدخال دليل الكشف، مع الخلايا يتم حصادها في 3 أيام بعد تعداء عابرة. في كريسبر التدخل، يلاحظ زيادة في H3K9me3 في 7 أيام بعد توصيل12. وأخيراً، ينص البروتوكول على محسن-ط استراتيجية لاستهداف مواقع متعددة في نفس الوقت ورصد كفاءة الاستهداف. في فسيفساء seq17، dCas9 KRAB يستخدم لاستهداف معززات متعددة في وقت واحد، ولكن هذا الأسلوب يعتمد على خلية واحدة تسلسل الحمض النووي الريبي التعرف على التغيرات في التعبير، وتكتشف العديد من الجينات (مثل الجينات الإستروجين استجابة) بسبب انخفاض حساسية من خلية واحدة من الحمض النووي الريبي-ما يليها محسن أنا توفر طريقة يمكن الاعتماد عليها لدراسة القدرة على فرادى ومجتمعة لأي الجينات.

هو الخطوة الأكثر أهمية من محسن-i تعداء، الذي ينبغي أن يكون الأمثل لخط الخلية للفائدة. يعتمد هذا البروتوكول على العلاج بوروميسين لإثراء للخلايا ترانسفيكتيد، ولكن من الممكن أن الدليل المشترك ترانسفيكتينج الكشف مع بروتين فلوري والفرز للخلايا الفلورسنت باستخدام التدفق الخلوي قد تكون أفضل طريقة إثراء لبعض الخلايا أنواع. نوصي بمراقبة مستوى التعبير دليل الكشف و SID4x-dCas9-KRAB qPCR استكشاف الأخطاء وإصلاحها والتأكد من تعداء. إذا كان دليل الحمض النووي الريبي مستويات منخفضة (عتبة دورة > 30)، المستخدمين قد تنظر أيضا في دليل بديلة استراتيجيات إنتاج الحمض النووي الريبي مثل في المختبر النسخ28. من الممكن أيضا أن على الرغم من المستويات العالية جرنة، دليل الحمض النووي الريبي استهداف البروتين SID4x-dCas9-KRAB عدم الكفاءة، ويلزم في هذه الحالة تحديد مختلف دليل تسلسل الحمض النووي الريبي. خلال أداء رقاقة seq على البروتين الانصهار مع الكروماتين من محسن-i تعامل الخلايا، يمكن رصد كفاءة الاستهداف. إذا كان هناك إشارة عالية من KRAB-SID4x-dCas9 في منطقة الفائدة، ويتم الكشف عن أي تغييرات التعبير عن الجينات المستهدفة المفترضة، ثم المنطقة المحتمل لا يسهم في التعبير عن ذلك الجين ظروف دراستها.

واحد الحد المحتملة من محسن-i أنه قد تتراكم آثار خارج الهدف إذا كان يتم استهداف مواقع كثيرة جداً في وقت واحد. ومع ذلك، قد كريسبر استراتيجيات التدخل لضربة قاضية أقل قبالة الآثار المستهدفة من [رني]29، خاصة عند استخدام خط خلية [بولكلونل] الإعراب عن dCas9 KRAB. بينما شهدنا ملزمة الجينوم خارج الهدف من SID4X-dCas9-KRAB عند استهداف 10 مواقع في نفس الوقت، أننا لم نحدد التغييرات التعبير الجيني نتيجة لتلك الأحداث ملزمة. قد اتصل ببعض القدرة على المروجين متعددة و/أو القدرة على الأخرى، فمن الممكن أن العديد من الجينات يمكن أن تغير التعبير عند استهداف محسن واحد، على الرغم من أنه من غير الواضح إذا كان هذا الشكل من تنظيم الجينات المشتركة. للتأكد من أن التغييرات التعبير لاحظت هي سبب استهداف محسن محددة، وليس خارج الهدف آثار، يمكن للمستخدمين تنفيذ محسن-ط مع مجموعتين متميزة من دليل غير متداخلة الكشف تستهدف نفس المنطقة. وبالإضافة إلى ذلك، يمكن كذلك تأكيد الحذف الوراثية من المنطقة باستخدام Cas9 نوكلاس المختصة إثارة على التعبير الجيني.

كوظائف أنا محسن من خلال ديسيتيليشن هستون، فمن الممكن أن قدراته التعطيل تقتصر على المنشطات التي تحتوي على مستويات كبيرة من هيستون acetylation. وهناك مجموعة متنوعة من اندماج القمعية البديلة التي قد تكون أكثر فعالية في استهداف معززات محددة. الحمض النووي ميثيلترانسفيراسي الأنشطار إلى dCas9 يمكن استخدامها للحد من التعبير الجيني عندما استهدف معززات القاصي30، لكن هذا القمع في كثير من الأحيان لا عابر. الانصهار القمعي آخر يستخدم المجال صديق GATA1 (FOG1)، مما يؤدي إلى هيستون تريميثيليشن يسين 27 H3 وتقمع التعبير الجيني في مستويات مماثلة ل dCas9 KRAB عبر مجموعة متنوعة من خطوط والمروجين الخلية31. من المثير للاهتمام، إضافة نسخ أكثر من FOG1 إلى dCas9 خفض إمكانات قمعية في المروجين، مما يوحي بأن تقدم نسخة واحدة من المجال SID التعطيل محسن أكثر من 4 نسخ المستخدمة حاليا في محسن-i. فمن الممكن أن بعض المكاني قد تستفيد من استهداف المزدوج بتركيبات مختلفة من اندماج dCas9 أعلاه. على سبيل المثال، يمكن تحقيق القمع طويلة الأجل مستقرة بتوصيل واحد من dCas9-DNMT3a و dCas9-KRAB32. فقط استهدفوا معظم هذه الأنشطار القمعية لمحور واحد في وقت واحد، وأنه لا يزال غير واضح وهو الأكثر فعالية في التعامل مع معززات متعددة في وقت واحد.

أنا محسن، بينما طريقة مناسبة لدراسة تركيبات من محسنات لحفنة من الجينات، ولا يزال إلى حد ما محدود الإنتاجية إذا لم يرغب المستخدم في دراسة القدرة المفترضة لمئات جينات. التطبيقات المستقبلية لهذه التقنية سوف تتضمن التقنيات المستندة إلى تصوير لتحديد الجينات متعددة في عينات متعددة في وقت واحد. الأهم من ذلك، أن هذه التكنولوجيات متوافقة مع الكشف المباشر من جزيئات الحمض النووي الريبي من، مما يلغي الحاجة لعزل الحمض النووي الريبي تستغرق وقتاً طويلاً. وستيسر هذه التكيفات التحقيق مع مجموعات أكبر من القدرة على.

Disclosures

The authors have nothing to disclose.

Acknowledgements

كان يدعمها هذا العمل في المعاهد الوطنية للصحة/NHGRI R00 HG006922 والمعاهد الوطنية للصحة/نهجري R01 HG008974 إلى J.G.، ومعهد السرطان هنتسمان. وأيد J.B.C. “برنامج التدريب في المعاهد الوطنية للصحة” في T32GM007464 علم الوراثة.

Materials

ZR 96-well Quick-RNA Kit Zymo Research R1053
Power SYBR Green RNA-to-CT 1-Step Applied Biosystems 4389986
AflII restriction enzyme NEB R0520S
Phusion High-Fidelity PCR Master Mix with HF Buffer NEB M0531L
NEBuilder HiFi DNA Assembly Master Mix NEB E2621L
FuGENE HD Promega E2312
DNA Clean & Concentrator Kit Zymo Research D4013
Buffer RLT Plus Qiagen 1053393
b-estradiol Sigma-Aldrich E2758
Human: Ishikawa cells ECACC 99040201
H3K27ac rabbit polyclonal Active Motif  39133
H3K9me3 rabbit polyclonal Abcam  ab8898
FLAG mouse monoclonal Sigma-Aldrich  F1804
ER alpha rabbit polyclonal Santa Cruz sc-544
pGL3-U6-PGK-Puro plasmid Addgene  51133 Shen et al., 2014
gRNA_cloningVector plasmid Addgene  41824 Mali et al., 2013
AflII U6 puromycin plasmid Addgene  106404 Carleton et al., 2017
SID4X-dCas9-KRAB plasmid Addgene  106399 Carleton et al., 2017
2-Mercaptoethanol Sigma-Aldrich M6250-10ML
UltraPure DNase/RNase-Free Distilled Water ThermoFisher Scientific 10977-023
Opti-MEM I Reduced Serum Medium Gibco 31985070
KAPA Stranded mRNA-Seq Kit, with KAPA mRNA Capture Beads Kapa Biosytems KK8420
Pierce Protease and Phosphatase Inhibitor Mini Tablets ThermoFisher Scientific A32959
Formaldehyde solution Sigma-Aldrich 252549-25ML
Geneticin Selective Antibiotic (G418 Sulfate) (50 mg/mL) ThermoFisher Scientific 10131035
LB Broth ThermoFisher Scientific 10855001
Quick-DNA Miniprep Kit Zymo Research D3020
Quick-Load Purple 2-Log DNA Ladder NEB N0050S
DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Consortium, E. P. An integrated encyclopedia of DNA elements in the human genome. Nature. 489 (7414), 57-74 (2012).
  2. Roadmap Epigenomics, C., et al. Integrative analysis of 111 reference human epigenomes. Nature. 518 (7539), 317-330 (2015).
  3. Andersson, R., et al. An atlas of active enhancers across human cell types and tissues. Nature. 507 (7493), 455-461 (2014).
  4. Perry, M. W., Boettiger, A. N., Bothma, J. P., Levine, M. Shadow enhancers foster robustness of Drosophila gastrulation. Curr Biol. 20 (17), 1562-1567 (2010).
  5. Lam, D. D., et al. Partially redundant enhancers cooperatively maintain Mammalian pomc expression above a critical functional threshold. PLoS Genet. 11 (2), e1004935 (2015).
  6. Patwardhan, R. P., et al. Massively parallel functional dissection of mammalian enhancers in vivo. Nat Biotechnol. 30 (3), 265-270 (2012).
  7. Savic, D., et al. Promoter-distal RNA polymerase II binding discriminates active from inactive CCAAT/ enhancer-binding protein beta binding sites. Genome Res. 25 (12), 1791-1800 (2015).
  8. Mali, P., et al. RNA-guided human genome engineering via Cas9. Science. 339 (6121), 823-826 (2013).
  9. Cheng, A. W., et al. Multiplexed activation of endogenous genes by CRISPR-on, an RNA-guided transcriptional activator system. Cell Res. 23 (10), 1163-1171 (2013).
  10. Hilton, I. B., et al. Epigenome editing by a CRISPR-Cas9-based acetyltransferase activates genes from promoters and enhancers. Nat Biotechnol. , (2015).
  11. Kearns, N. A., et al. Functional annotation of native enhancers with a Cas9-histone demethylase fusion. Nat Methods. 12 (5), 401-403 (2015).
  12. Thakore, P. I., et al. Highly specific epigenome editing by CRISPR-Cas9 repressors for silencing of distal regulatory elements. Nat Methods. 12 (12), 1143-1149 (2015).
  13. Groner, A. C., et al. KRAB-zinc finger proteins and KAP1 can mediate long-range transcriptional repression through heterochromatin spreading. PLoS Genet. 6 (3), e1000869 (2010).
  14. Qi, L. S., et al. Repurposing CRISPR as an RNA-guided platform for sequence-specific control of gene expression. Cell. 152 (5), 1173-1183 (2013).
  15. Fulco, C. P., et al. Systematic mapping of functional enhancer-promoter connections with CRISPR interference. Science. 354 (6313), 769-773 (2016).
  16. Joo, J. Y., Schaukowitch, K., Farbiak, L., Kilaru, G., Kim, T. K. Stimulus-specific combinatorial functionality of neuronal c-fos enhancers. Nat Neurosci. 19 (1), 75-83 (2016).
  17. Xie, S., Duan, J., Li, B., Zhou, P., Hon, G. C. Multiplexed Engineering and Analysis of Combinatorial Enhancer Activity in Single Cells. Mol Cell. 66 (2), 285-299 (2017).
  18. Carleton, J. B., Berrett, K. C., Gertz, J. Multiplex Enhancer Interference Reveals Collaborative Control of Gene Regulation by Estrogen Receptor alpha-Bound Enhancers. Cell Syst. 5 (4), 333-344 (2017).
  19. Gilbert, L. A., et al. CRISPR-mediated modular RNA-guided regulation of transcription in eukaryotes. Cell. 154 (2), 442-451 (2013).
  20. Ayer, D. E., Laherty, C. D., Lawrence, Q. A., Armstrong, A. P., Eisenman, R. N. Mad proteins contain a dominant transcription repression domain. Mol Cell Biol. 16 (10), 5772-5781 (1996).
  21. Alland, L., et al. Role for N-CoR and histone deacetylase in Sin3-mediated transcriptional repression. Nature. 387 (6628), 49-55 (1997).
  22. Konermann, S., et al. Optical control of mammalian endogenous transcription and epigenetic states. Nature. 500 (7463), 472-476 (2013).
  23. Rennoll, S. A., Scott, S. A., Yochum, G. S. Targeted repression of AXIN2 and MYC gene expression using designer TALEs. Biochem Biophys Res Commun. 446 (4), 1120-1125 (2014).
  24. Stampfel, G., et al. Transcriptional regulators form diverse groups with context-dependent regulatory functions. Nature. 528 (7580), 147-151 (2015).
  25. Perez-Pinera, P., et al. RNA-guided gene activation by CRISPR-Cas9-based transcription factors. Nat Methods. 10 (10), 973-976 (2013).
  26. Heigwer, F., Kerr, G., Boutros, M. E-CRISP: fast CRISPR target site identification. Nat Methods. 11 (2), 122-123 (2014).
  27. Parsi, K. M., Hennessy, E., Kearns, N., Maehr, R. Using an Inducible CRISPR-dCas9-KRAB Effector System to Dissect Transcriptional Regulation in Human Embryonic Stem Cells. Methods Mol Biol. , 221-233 (2017).
  28. Romanienko, P. J., et al. A Vector with a Single Promoter for In Vitro Transcription and Mammalian Cell Expression of CRISPR gRNAs. PLoS One. 11 (2), e0148362 (2016).
  29. Smith, I., et al. Evaluation of RNAi and CRISPR technologies by large-scale gene expression profiling in the Connectivity Map. PLoS Biol. 15 (11), e2003213 (2017).
  30. Liu, X. S., et al. Editing DNA Methylation in the Mammalian Genome. Cell. 167 (1), 233-247 (2016).
  31. O’Geen, H., et al. dCas9-based epigenome editing suggests acquisition of histone methylation is not sufficient for target gene repression. Nucleic Acids Res. 45 (17), 9901-9916 (2017).
  32. Amabile, A., et al. Inheritable Silencing of Endogenous Genes by Hit-and-Run Targeted Epigenetic Editing. Cell. 167 (1), 219-232 (2016).

Tags

CRISPREnhancer InterferenceGene RegulationTranscriptionGuide RNA DesignE-CRISPUCSC Genome BrowserBLATGenome AssemblyOff-targetProtospacer-adjacent MotifGenomics

Play Video
PDF
DOI
DOWNLOAD MATERIALS LIST
Cite This Article
Carleton, J. B., Berrett, K. C., Gertz, J. Dissection of Enhancer Function Using Multiplex CRISPR-based Enhancer Interference in Cell Lines. J. Vis. Exp. (136), e57883, doi:10.3791/57883 (2018).
Download Citation
Reprints and Permissions

View Video

✖

To prove you're not a robot, please enter the text in the image below

CAPTCHA Image
Play CAPTCHA Audio
Refresh Image