Hızlı izole edilmesi HEK hücrelerden Mitoribosome

Tüm memeli hücre kültür işleri bir biyolojik güvenlik kabin içinde gerçekleştirilmesi gerekir. Steril ekipmanları kişi içeren hücreler kullanın. Nitril eldiven ve önlük giymek ve iyi doku kültürü pratik izleyin. 1. hücre kültürü HEK293S süspansiyon hücre içinde Dulbecco’nın modifiye kartal Orta (% 10 tetrasiklin-Alerjik fetal Sığır serum (FBS), 5 μg/mL blasticidin ve 200 μg/mL Azitromisin, 37 ° C ve % 5 CO2ile takıma DMEM) korumak. 9 x T175 şişeler çap. Hücreleri % 90 confluency hasat ve onları vasıl 500 x g 5 dk. Resuspend Freestyl % 5 ile desteklenmiş pelleted hücrelerde spin aşağı FBS tetrasiklin ücretsiz. Bir otomatik hücre sayaç kullanarak hücreleri saymak ve hücre konsantrasyonu 1.5 x 106 hücre/mL Bacalı sallayarak şişesi için ayarlayın.Not: Bu genellikle bir 1000 mL Bacalı şişesi 300 mL başlangıç bir birime karşılık gelir. Hücreleri 37 ° C ve % 5 CO2 120 rpm (50 mm sallayarak çapı) sallayarak bir kuluçka kuluçkaya. 2 gün sonra hücreleri saymak ve hücre yoğunluğu 3.0 x 106 hücre/mL üzerinde ise hücreleri bölmek için devam edin. 2 x 10 mL taze medya hücrelerde Resuspend 2 x 150 mL hücre kültürü 5 dakika süreyle 500 g, 2 x 250 mL konik şişelerde aşağı iplik hücreleri bölme ve bir 2 x 1, 000 mL Bacalı şişeler son hücre yoğunluğu için uygun birimi içeren transfer 1.5 106 hücre/mL, Örneğin bir başlangıç 2 x 300 mL x 3.0 x 106 hücre/mL yoğunluğu hücre. Hücreleri 37 ° C ve % 5 CO2 120 rpm (50 mm sallayarak çapı) sallayarak bir kuluçka kuluçkaya. İki gün sonra hücreleri saymak ve hücre yoğunluğu 3.0 x 106 hücre/mL üzerinde ise hücreleri bölmek için devam edin. Hücreler tarafından iplik 4 x 150 mL hücre kültüründe 5 dakika süreyle 500 g 4 x 250 mL konik şişe aşağı 2 x 10 mL taze medya hücrelerde Resuspend ve 2 x 2000 mL Bacalı şişesi 1.5 x son hücre yoğunluğu için uygun birimi içeren transfer Split 106 hücre/mL, Örneğin 2 x 700 mL 3.0 x 106 hücre/mL başlangıç hücre yoğunluğu düşük. Hücreleri 37 ° C ve % 5 CO2 120 rpm (50 mm sallayarak çapı) sallayarak bir kuluçka kuluçkaya. İki gün sonra hücreleri saymak ve hücre yoğunluğu 3.0 x 106 hücre/mL üzerinde ise hücreleri bölmek için devam edin. 2 x 700 mL dökerek hücreleri bölme hücre kültürü içine 2 x 2800 mL şişe ve 2 x 1 L. hacmi ulaşmak için 2 x 300 mL taze medya ile kontör Bacalı Hücreleri 37 ° C ve % 5 CO2 120 rpm (50 mm sallayarak çapı) sallayarak bir kuluçka kuluçkaya. 24 saat sonra hücreleri saymak ve hücre yoğunluğu 3,0-4,0 106 hücre/mL x arasında ise hücre hasat. 2. mitokondri yalıtım Gerekli arabellekleriNot: 2 L hücrelerden bir hazırlık için miktarları verilmiştir. Aşağıdaki hisse senedi çözümleri mitokondrial yalıtım arabellek (MIB), sukroz/mannitol arabellek (SM4), deneysel arabellek (MIBSM), resuspension arabellek (SEM) için önceden hazırlayın. Marka 0,5 L MIB arabellek: 50mM HEPES-KOH, pH 7.5, 10 mM KCl, 1.5mM MgCl2, 1 mM EDTA, 1 mM EGTA, 1 mM DTT, proteaz inhibitörleri. 100 mL SM4 arabellek olun: 280 mM sükroz, 840 mM mannitol, 50 mM HEPES-KOH, pH 7.5, 10 mM KCl, 1.5 mM MgCl2, 1 mM EDTA, 1 mM EGTA, 1 m M DTT, proteaz inhibitörleri. Yapmak 160 mL MIBSM arabellek: 120 mL MIB tampon + 40 mL SM4 arabellek. 200 mL PBS 4 ° C’de depolayın 5 mL SEM arabellek olun: 250 mM sukroz, 20 mM HEPES-KOH, pH 7.5, 1 mM EDTA. 4 x 10 mL stok çözümleri 20 mM HEPES-KOH, pH 7.5, 1 mM EDTA ve % 60’ı içeren kademeli sükroz gradyan için yapmak / /23% ve sukroz, anılan sıraya göre. Mitokondri yalıtımNot: Hızlı bir şekilde iş ve işlem boyunca buzda her şeyi tutmak önemlidir. Kullanmadan azot kavitasyon odası önce precool. 2 x 1 L hücreleri (3-4 santrifüj tüpü başına 109 hücre x) 1000 x g 7 dk, 4 ° c de Santrifüjü tarafından hasat Süpernatant özenle dikkatle boşaltmak ve 2 x 100 mL PBS pelleted hücrelerde hızlı bir şekilde resuspend. Hücreleri havuz. 1200 x g 10 dk, 4 ° c de resuspended hücreleri santrifüj kapasitesi Süpernatant özenle dikkatle boşaltmak ve Pelet (~ 20 g) ağırlığında. Pelet 120 mL MIB arabellekte resuspend. Hücreleri tarafından hafifçe karıştırarak 10 dakika için soğuk bir odada şişmeye izin. Azot kavitasyon odası buza koyun ve kirinden hücreleri azot kavitasyon odasına aktar. 45 mL SM4 arabellek ekleyin (1/3 resuspended hücre, yaklaşık 140 mL, 70 mM sukroz ve 210 mM mannitol son bir konsantrasyon verimli son hacim). 500 psi basınç ulaşıncaya kadar azot kavitasyon odası ve azot ile doldurun bağlayın. Musluklar ve 20 dakika buzda izole tutmak kapatın. Yavaş yavaş azot kavitasyon odasında basınç ve lysate toplamak (yaklaşık 185 mL). Hücre artıkları ve çekirdek 800 x g 15 dakika, 4 ° c de kaldırmak için lysed malzeme santrifüj kapasitesi Süpernatant ile tülbent içine bir ölçek üzerinde buz tuttu sağanak tarafından toplamak. Pelet atmayın. Pelet 90 mL MIBSM arabellekte resuspend (1/2 önceki ses). Teflon/cam Dounce homogenizer kullanarak homojenize ve 15 dk, 4 ° C. vasıl 800 x g aralıklarla tekrarlayın Süpernatant ile tülbent içine bir ölçek üzerinde buz tuttu sağanak tarafından toplamak. Bu süpernatant adım 2.2.11 süpernatant ile birleştirin. 1000 x g 15 dakika, 4 ° c de kombine supernatants santrifüj kapasitesi Süpernatant ile tülbent içine bir ölçek üzerinde buz tuttu sağanak tarafından toplamak. Pelet atmak ve 10.000 x g 15 dakika, 4 ° c’de ham mitokondri içeren süpernatant santrifüj kapasitesiNot: Pelet genellikle iki bölümden oluşur: gevşek ve sıkı. Dikkatlice gevşek Pelet sıkı bölümü bozmadan yıkayın. Sıkı Pelet 10 mL MIBSM arabellekte resuspend. Bir ticari Protein tahlil Kit veya benzer bir yöntemi kullanarak bir protein konsantrasyonu tahlil gerçekleştirin. Tipik konsantrasyon verimleri 2 kültür başlangıç l ~ 2 mg/mL ‘ dir. 200 adet RNase free DNaz eklenir ve eşit DNaz genomik DNA kaldırılması için karıştırmak 20 dakika soğuk odada bir rulo üzerinde döndürmek için bırakılır. 10.000 x g 15 dakika, 4 ° C de santrifüj kapasitesi ve 2 mL SEM arabellekte Pelet resuspend. Yavaşça kalan herhangi bir toplamları resuspend için küçük bir Teflon/cam Dounce homogenizer kullanarak lunaparkçı. Kırılma önlemek için değil daha–dan beş alçalarak geçer gerçekleştirmek. Buz üstünde tutun. 14 mL sukroz degradede dikkatle tüpün dibine % 60 sükroz stok arabelleği 1.5 mL pipetting tarafından SW40 tüpleri hazırlayın. Dikkatli bir şekilde rahatsız etmeden 4.5 mL % 32 sükroz stok arabelleği % 60 grubun üstüne ekleyin. 1.5 mL % 23 sükroz stok arabelleği ve tekrar 1,5 mL % 15 sükroz stok arabelleği ile yineleyin. Sükroz degrade üstüne tüm mitokondrial süspansiyon (yaklaşık 3 mL) yükleyin. Santrifüj kapasitesi SW40 rotor, 139, 065 x g 60 dk için. Dikkatli bir şekilde kullanarak transfer pipet, genellikle 2-3 mL % 32 ve % 60 sükroz arabirimine geçiş kahverengi grup toplamak. Ek-arıtılmış mitokondri donma sıvı azot ve-80 ° C’de store 3. Mitoribosome hazırlık Gerekli arabellekleriNot: aşağıdaki hisse senedi çözümleri lizis arabellek, sukroz yastık/gradient ve resuspension arabellek için önceden hazırlayın. 10 mL lizis arabellek olun: 25 mM HEPES-KOH, pH 7.5, 150 mM KCl, 50mM MgOAc, % 2 Polietilen glikol octylphenyl eter, 2 mM DTT, proteaz inhibitörleri. 10 mL sukroz yastık arabellek olun: 1 M sukroz ( w/v), 20 mM HEPES-KOH, pH 7.5, 100 mM KCl, 20 mM MgOAc, % 1 Polietilen glikol octylphenyl eter, 2 mM DTT. 5 mL resuspension tampon yapmak: 20 mM HEPES-KOH, pH 7.5, 100 mM KCl, 20mM MgOAc, 2 mM DTT % 15- resuspension arabellek degradelerle doğrusal sükroz TLS-55 Polikarbonat tüplerde olun. Mitoribosome arıtma Buzda donmuş mitokondri çözdürün. 2 cilt lizis arabelleği eklemek,Örneğin eklemek 6 mL lizis arabellek 3 mL mitokondri. Hemen tüp birkaç kez ters çevirme ile karıştırın. Ve 5-10 dk lizis tamamlamak için buz üzerinde kuluçkaya lizis yardımcı olmak üzere küçük bir Teflon/cam dounce homogenizer ile homojenize. Lysed malzeme (yaklaşık 9 mL) santrifüj kapasitesi 30.000 x g 20 dk, 4 ° C çözünmez malzeme çıkarmak için de. Süpernatant Pelet dikkatle üzerinden dikkatle boşaltmak ve Pelet atın. Santrifüjü 30.000 x g de 20 dk 4 ° C’de süpernatant açıklama sağlamak için yineleyin. Süpernatant Pelet dikkatle üzerinden dikkatle boşaltmak ve Pelet atın. TLA 120.2 tüpler (Ultra net) sükroz yastık hazırlamak: 0.4 mL sukroz yastık tüp başına. Lysed malzeme mL başına bir tüp hazırlayın. Lysed mitokondri sükroz minderlerin üzerinde katman: yaklaşık 1 mL Tüp, bir lysate kaynaklanan ücret: 2.5:1 yastık oranı. Örneği 231 ‘, 550 x g TLA120.2 Open End 4 ° C’de 45 dk santrifüj kapasitesi Süpernatant atın ve kalan sükroz kaldırmak için resuspension arabelleği 100 µl sırayla tüplerini durulayın. Granül toplam 100 µl resuspension arabellek resuspend. Girdap üstünde yavaş hız 30 s kalan toplamları dağıtılması ve 17,949 x g microtube santrifüj 4 ° C’de 10 min için de santrifüj kapasitesi Dikkatle süpernatant toplamak ve aralıklarla tekrarlayın. A260mitoribosome emme ölçmek.Not: 7 A260, ile A260tipik verimidir: A280 oranı 1,3. Tüm örnek bir tek doğrusal sükroz Degrade tüp üzerine yükleyin. TLS-55 rotor, 213, 626 x g 4 ° C’de 120 dk santrifüj kapasitesi Geçişin fractionate, A260 optik yoğunluk belirlemek ve nükleik asit zirveye birlikte karşılık gelen kesir havuz.Not: Tipik A260: tepe A280 oranı > 1,6. Gerekirse, seçtiğiniz yöntemi kullanarak arabellek değişimi. Dönüşüm 1 A260 kullanarak son konsantrasyonu hesaplama 0.1 mg/mL =. Ek arıtılmış mitoribosome örnek resuspension arabellek ve store-80 ° C’de dondurmak