לטווח ארוך In Vivo מעקב של תאים דלקתיים הדינמיקה בתוך דרוזופילה הגלמים
Summary
כאן אנו מציגים פרוטוקול עבור הדמיה לחיות הפצע ותיקון ההיענות דלקתיות המשויך ברזולוציה גבוהה-עתיים ויוו. שיטה זו משתמשת השלב הגולמי של פיתוח דרוזופילה כדי לאפשר לטווח ארוך הדמיה ומעקב של אוכלוסיות תאים מסוים לאורך זמן והוא תואם עם איון יעיל מציאה RNAi בתיווך גנים.
Abstract
במהלך לתגובה דלקתית מהירה כדי נזק לרקמות, תאים של מערכת החיסון המולדת מגויסים במהירות כדי פגיעה באתר. פעם לפצע, תאים חיסוניים מולדת לבצע מספר רב של פונקציות חיוניות, כמו להילחם זיהום, ניקוי פסולת נמק ועירור מטריקס התצהיר. כדי להבין באופן מלא את מגוון אירועים איתות המסדירים את התגובה החיסונית, חשוב לבחון את התנהגויות מורכבות של (ואת האינטראקציות המתרחשות בין) מרובות תא שושלות ויוו, ואת בזמן אמת, עם הערך הגבוה רזולוציה-עתיים. את המוגבהת אופטי, את ללקוחות שלנו גנטי של עוברי דרוזופילה הקמנו דרוזופילה כמודל שלא יסולא בפז על תמונת-לחיות, לנתח את ההיבטים הבסיסיים של תאים דלקתיים התנהגות, כולל מנגנוני פיזור התפתחותית, סיווג של גופות מוות ו/או חיידקים פתוגנים, גיוס לפצעים. עם זאת, עבודה עדכנית עכשיו הוכיחה כי העסקת שלב יותר מאוחר יותר במחזור דרוזופילה – הגולם דרוזופילה – מציע מספר יתרונות ברורים, לרבות יעילות RNAi משופרת, יותר הדמיה תקופות, ו באופן משמעותי תא החיסון במספרים גדולים. כאן נתאר פרוטוקול לתיקון הפצע הדמיה ואת התגובה דלקתיות המשויך ברזולוציה גבוהה-עתיים ב הגלמים דרוזופילה בשידור חי. כדי לבצע את הדינמיקה של epithelialization מחדש ודלקת, אנו משתמשים מספר של מסוים ויוו פלורסנט סמנים עבור אפיתל והן תאים חיסוניים מולדת. אנחנו גם להוכיח את היעילות של fluorophores צילום-להמרה, כגון קאךה, אחרי תת-קבוצות תאים חיסוניים מסוים, כדי לעקוב אחר אופן הפעולה שלהם הם נודדים, נחישות מהאתר, פציעה.
Introduction
לתגובה דלקתית יעילה הוא מרכזי עבור כל האורגניזם להילחם בזיהום, לנקות פסולת שננהל את התיקון של רקמות פצועים1. אמנם תגובה זו התוצאה הבלתי נמנעת של רוב נזק לרקמות, דלקת דורש רגולציה קפדנית כי נמצא קשור לתגובה דלקתית לא הולם למגוון רחב של מחלות אנושיות שונות (כולל כרונית ללא ריפוי פצעים, הצטלקות יתר, נטייה לסרטן)1,2,3. נתון זה הרלוונטיות הקלינית, זה הכרחי כדי להשיג הבנה מפורטת יותר של המנגנונים המולקולריים הסלולר נהיגה את התגובה דלקתית כדי לפתח אינדיקטורים prognostic חדשה ואסטרטגיות לטיפול מגוון כרונית דלקתית תנאים, אשר עשויים להגן על רקמות תיקון מפני דלקת ממושכת ומיותר.
בשנים האחרונות הפך דרוזופילה מערכת מודל ומבוססת ובעל ערך לנתח תכונות יסוד של תגובת דלקתית והתפאורה מפני חרקים האנושי4,5. בזמן הנוכחי, דרוזופילה מציע ללקוחות שלנו גנטי גדול בהרבה ממה שאפשרי כיום במודלים ניסויים אחרים (כגון עכברים או דג זברה), המתיר מדויק מניפולציה גנטית-עתיים ויוו (כדי להשבית או יתר אקספרס לכל הגן עניין בתוך סוגי תאים ספציפיים בנקודה מוגדרת התפתחותית זמן-) ואת הקלות של הגנום כולו מסכי6,7. באופן מסורתי, רוב המחקרים הדמיה חיה של ריפוי הפצע, דלקת דרוזופילה בוצעו בשלבים עובריים, העוברים הם משותק (בניגוד דרוזופילה הזחלים או מבוגרים), שקוף אופטית המאפשרת ברזולוציה גבוהה ללא תחרות ויוו הדמיה8. זה איפשר לחוקרים להמחיש את גיוס מהיר וחזק דרוזופילה תאים חיסוניים מולדת (hemocytes) לאתר הפצע בתגובה לפגיעה מכנית או לייזר המושרה האפיתל מתחלקים9, 10 , 11 , 12 , 13 , 14. על ידי שילוב של מחקרים אלו הדמיה לחיות עם מניפולציה גנטית, לימודי עוברי דרוזופילה חשף הרבה חלבונים תא החיסון חשוב לשלוט תאים דלקתיים התנהגות בתוך vivo. לדוגמה, זוהתה homolog סיד-1 דרייפר (ITAM מחשבים המכילים חלבון) כמו חשוב “לפגוע קולטן’ זה שמתווכת תאים חיסוניים דרוזופילה גיוס2O H2-תלוי באופן לאתרים של נזק15. רמות דרייפר בתוך תאים חיסוניים בתורו מווסתות על ידי סידן-induced JNK איתות גבוהות במורד הזרם של מוות גופה ספיגת12. Hemocyte תנועתיות נוסף דורש שינויים cytoskeletal מורכבים לתאם את ההעברה מכוונת כלפי הפצע וזה תלוי פעילות הרגולטורים cytoskeletal כגון ה bundling אקטין חלבון תמונה מרתקת-16 ומשפחת רו קטן GTPases Rac, רו9.
דרוזופילה הוא חרק holometabolous זה עובר שלבים זחל, הגולמי נוספים בעקבות מופרה, לפני שהגיע לבגרות17. הגולם דרוזופילה פותחה כמודל נוספים עבור פולשני לחיות-הדמיה של מגוון רחב של אירועים הסלולר דינמיים, כולל תא התפתחותי העברה18, חלוקת התא19, התא צמיחה20שריר התכווצות21. לאחרונה, זה כבר נקבעה כמודל רומן שבו ללמוד את הדינמיקה של הפצע תיקון ודלקת ויוו22,23.
בדיוק כמו העובריים, דרוזופילה הגלמים הם משותק שטיחות שקוף, לאחר ניתוח זהיר מ שלהם מקרים הגולמי אטום18. על ידי ניצול זה שקיפות אופטית, אחד יכול לעקוב אחר ההתנהגות ויוו של תאים חיסוניים מולדת (hemocytes) בתגובה הנזק רקמות בתוך רקמות הגולמי דרוזופילה , כגון כנף הגולמי22. האגף הגולמי קיים מבנה bilayered פשוטים, המורכב שני גיליונות אפיתל שטוח גדול המחוברים ברחבי הפריפריה כנף; חוץ-תאית הרווח בין שתי שכבות אלה אפיתל מתמלא hemolymph (דם חרקים), מספר גדול של תאי hemocytes24. בדיוק כמו עוברי, פגיעה מכנית או לייזר המושרה האפיתל האגף מפעיל גיוס מהירה של hemocytes האתר של פציעה23. עם זאת, בשלב זה הגולמי מציע כמה יתרונות חשובים עבור הדמיה מעל קודם העובריים. הגלמים פצוע יכול לדימות במשך זמן רב ובתקופות זמן (לפחות 5 שעות), אזור הרקמה יותר זמין עבור ההפרעות ניסיוני (כגון דור של פציעות מרובות), ישנם מספרים גדול משמעותית של hemocytes נוכח (בשלב הזה מתן מסלולים תא יותר ממרחק נוסף עבור עוצמה סטטיסטית משופרת במהלך הניתוח המתמטית). יתר על כן, היעילות של איון מציאה RNAi בתיווך גנים באופן ניכר שיפור בשלבים הגולמי, ומאפשר גנים רבים להיות ‘הפיל למטה’ טישו או באופן ספציפי זמן לעומת הגישה כל המוטציות מסורתיות יותר של העוברים.
על מנת לבצע את הדינמיקה של הפצע מחדש epithelialization ואת התגובה דלקתי המלווה בתוך המודל הגולמי החדש, יש ליצור שתי אוכלוסיות תאים שונים: האפיתל הגולמי של תאים חיסוניים מולדת (דרוזופילה hemocytes). מספר סמנים שונים (טבלה של חומרים) זמינים עבור תווית אלה שתי האוכלוסיות תאים שונים – הבחירה של סמן תלוי תהליך מסוים שילמדו. כדי לסמן את אפיתל הגולמי, קווים דרוזופילה המכיל גם ubiquitously ביטוי מתויג GFP E-קדהרין (שמתייג צמתי adherens) מנוצלים באופן שגרתי כדי לציין את העמדות של השוליים בתא, או לחלופין, על ה-GFP מתויג תחום אקטין-איגוד של Moesin (שמתייג את שלד התא אקטין) כדי להמחיש את הפצע-קצה אקטין כויץ הטבעת של מתקדמים בליטות. כדי לתייג את דרוזופילה hemocytes, hemocyte ספציפיים קמעונאי-Gal425 לביטוי נסיעה של RFP גרעינית (לצורך מעקב הגרעין), cytoplasmic GFP או מתויג GFP Moesin (כדי לתייג את שלד התא את הציטופלסמה או אקטין, בהתאמה). photoconvertible fluorophore (כגון קאךה) משמשים. למעשה, לעתים קרובות כדאי להשתמש מספר סמני תא החיסון בשילוב, כדי לאפשר ניתוח בו זמנית של תנועת גרעיני ושל המורפולוגיה תא (ראה תוצאות נציג). עם זאת, מכיוון פרוטוקול זה כרוך השימוש דרוזופילה הגלמים, רק שילובים של סמנים גנטיים כי הם קיימא עד אמצע-הגולמי שלבים יכול להיות מנוצל. כמו כן, עובריים מניות קטלני לא יהיה מתאים. . זה לא צפוי להיות בעיה כאשר הדמיה שליטה (או פראי-סוג) גלמי אבל חשוב לקחת בחשבון בעת גנים הם לנוק או overexpressed, כדי להעריך את ההשפעה שלהם על סגירת הפצע או דלקת. במקרה של lethality מוקדם נגרמת על ידי ג’ין נוקאאוט (או ביטוי) Gal80ts הבונה יכול לשמש כדי לעודד את נוקאאוט מונחה Gal4 בהמשך פיתוח (ראה דיון).
במחקרים האחרונים שלנו, נעה לתוך השלב הגולמי איפשר לנו לאסוף מספיק נתונים מסלול תא החיסון כדי לנתח את התנהגות דלקתיות באמצעות מודלים מתמטיים מתוחכם, אשר בתורו אפשרה לנו להסיק פרטי הרומן של הפצע attractant דלקתיות אותות23. לדוגמה, גישה זו חשף כי chemoattractant הפצע מתפשט באיטיות דרך הרקמה מודלק ב 200 μm2/min, קצב איטי מאשר קודם לכן הציע מולקולות קטנות המועמד כגון ATP או H2O2 מדווחים טשטוש26,27,28,29; מולקולות קטנות “נזק” אלה נוטים במקום לשמש אותות מתירניות. יתר על כן, על-ידי ביצוע הפעולה ארוכת טווח של תאים חיסוניים מולדת כפי שהם לפתור מן פצע ראשוני נחשפים שנייה (עשוי ב timepoints שונים לאחר הראשונה), שחשפנו תקופה זמנית ‘הקהיה’ במהלך אילו תאים חיסוניים עיוורים פציעות עוקבות23. על ידי ניצול הפוטנציאל הדמיה לטווח ארוך של המודל הגולמי, יחד עם דרוזופילה גנטי ללקוחות שלנו, אחד לא יכול לנהוג את אופן הפעולה של אוכלוסיות תאים חיסוניים מסוים (כגון רק אלה תאים חיסוניים גייס לאתר הפצע) ב תגובה עלבונות עוקבות, באמצעות fluorophore photoconvertible30 אשר יכול לבוא לידי ביטוי אך ורק בתוך שושלת היוחסין תא החיסון23.
כאן נתאר פרוטוקול להמחיש את הדינמיקה של הפצע ותיקון את התגובה דלקתית המשויך ברזולוציה-עתיים גבוהה באמצעות מגורים הגלמים דרוזופילה . אנו מספקים מתודולוגיה מפורט כדי לכסות את השלבים הנחוצים לביצוע ההכנה הראשונית גלמי (דיסקציה, הרכבה) עוקבות בתיווך לייזר ובפציעתם ואת ההדמיה זמן לשגות. אנו מתארים גם את השימוש צילום-להמרה fluorophores להתיר תיוג של תאים חיסוניים מסוים קבוצות משנה ויוו. לטווח הארוך, נוכל לדמות כי המודל הגולמי דרוזופילה החדש יפתח אפשרויות מרגשות ניקוד הדינמיקות איתות מורכבים שבבסיס התגובה דלקתיים ברקמות. על-ידי החלת ניתוחים סטטיסטיים מתוחכמים יותר אחד עשויות לחשוף את התכונות של תגובת שאמורים להיות נגיש ניסיוניים, בעוד יעילות משופרת RNAi יכול להלוות עצמה ליישום של הגנום כולו ההקרנה בתוך תאים חיסוניים ויוו לזהות שחקנים הרומן ויסות התנהגות תא החיסון.
Protocol
Representative Results
Discussion
תגובת דלקתית חריפה נזק לרקמות הוא תהליך מורכב, דינמי מאוד חיוני שננהל את התיקון של רקמות פצוע, לרבות פינוי של פסולת נמק ומאבק נגד זיהום. מלא להבין, לפענח את ההיבטים הבסיסיים של תגובה זו, זה קריטי כי מחקרים הם שבוצעו ויוו על דגימות חיים תלת-ממדי כדי הפעולה המדויקת, האינטראקציות השונות תא שושלות מעורב להיות אחריו באופן מדויק לאורך זמן. ניתוח בזמן אמת של הדינמיקות האלה תא מאפשרת אפיון מפורט יותר של פנוטיפים מוטציה מאשר סטטי יחיד בזמן נקודות מדגימות קבוע באמצעות טכניקות אימונוהיסטוכימיה קלאסי. באופן מסורתי, רוב המחקרים הדמיה לחיות באמצעות מודל דרוזופילה גנטית צייתן השתמשו עובריים לשלב ההתפתחות fruitfly בשל המוגבהת האופטי שלה נייחות לעומת שלבים התפתחותיים מאוחר יותר4 , 5. עם זאת, לאחרונה הקבוצה שלנו ואחרים פיתחו הגולם דרוזופילה כמודל הרומן לבצע ברזולוציה גבוהה לטווח ארוך הדמיה של הפצע תיקון ודלקת בו-זמנית ויוו8,22 ,23. גישה זו המתעוררים מציע פוטנציאל לטווח ארוך מרגש של היבטים יסודיים unraveling אופן הפעולה של תאים דלקתיים, ניתן להתאים נוסף כדי לחקור את התנהגות דינמית של שושלות תאים אחרים (כגון דרוזופילה adipocytes 38) בעקבות פגיעה ברקמות.
ישנם מספר גורמים קריטיים במהלך ההכנה, הדמיה של הפצועים הגלמים דרוזופילה שיקבע את איכות התוצאות הדמיה שתוארו לעיל. ניתן לטעון השלב הקשה ביותר של הפרוטוקול המתואר היא ניתוח זהיר של מיקום מדויק של הגלמים לפני ופצעו והדמיה. הגלמים בשלב התפתחותי זה הם רגישים במיוחד, אפילו מינורי נזק בשוגג הגלמים הכנה בשלבים יפגום באופן משמעותי את הניסוי; כל הגלמים ייתכן שקיימו נזק מכוון חייב להיות מושלך מהניסוי מאז נזק זה יכול להפעיל משלו תגובה דלקתית, אשר עשוי להוביל עוד השלכות פרושות לרווחה (או אפילו מערכתית) על תאים דלקתיים התנהגות במקומות אחרים הגולם. עקב הפיתוח המתמשך של הגלמים מנוצל בניסויים אלה (אשר עוברים rearrangements לרקמות משמעותי להתכונן לבגרות רקמות), לעיתים הגלמים יעברו במהלך דימות. מתגלגל הגולמי הוא, לעומת זאת, עשויה להתרחש אם גלמי יש לא היה רכוב כראוי עם משטח שטוח ביותר של האגף (או רקמות אחרות לדימות) בקשר ישיר עם coverglass; שימוש בדבק heptane ב לייצב את הגלמים על הזכוכית המכסה צריך למזער תנועה זו לא רצויים. מסיבה זו, זהירות רבה יש לקחת גם להימנע הם מוציאים את הגלמים עמדותיהם מסודרים בקפידה בעת העברת הדגימות בין מיקרוסקופים; באופן אידיאלי, הלייזר wounding יצורפו המיקרוסקופ אותו כדי לשמש עבור הדמיה בצילום מואץ עוקבות, צילום-המרה.
בנוסף מיומנות של דיסקציה הגולמי, הרכבה צעדים, גנוטיפ המדויק של הגלמים דרוזופילה בשימוש תהיה השפעה משמעותית על איכות הנתונים הדמיה שנוצר. לדוגמה, מספר העותקים של הנהג Gal4 ושל מבנים UAS (למשל UAS-GFP או קאךה UAS) במרחק גנוטיפ הגולמי בודדים יקבע את יחס אות לרעש במהלך דימות עוקבות. ככלל, עותקים רבים יותר של Gal4 או UAS לבנות הנוכחי, יגדל הרמה הכוללת של חלבון פלואורסצנטי (למשל GFP או קאךה) בתוך הרקמה. הרמה האופטימלית של חלבון פלואורסצנטי, עם זאת, יהיה איזון זהיר בין זריחה רקמות והתעלות מספיק כדי לאפשר באיכות גבוהה הדמיה (ומאפשר שימוש כוחות לייזר נמוכה, ירידה photobleaching הדמיה לאורך זמן ממושך תקופות) אבל מבלי לגרום fluorophore-induced רעילות הסלולר; המספר האופטימלי של המבנים Gal4 ו UAS ניסוי ישתנו בהתאם מנהלי התקן מסוים fluorophores בשימוש. צריך לקחת כדי לגייס את הגלמים 25 ° c (או לעיל, עד 29 ° C) כי מערכת Gal4-UAS טמפרטורה רגיש ולא יהיו יעילות על טמפרטורות נמוכות31. על מנת להשיג רמות נוספות של שליטה על הרקמה או זמן-יחודיות של Gal4 –מונע הביטוי, Gal4-UAS מערכת מדכא. שבולם Gal80 יכול גם להיות כלולה גנוטיפ הגולמי39. Gal80 יכול לשמש גם כדי לדכא פעילות Gal4 בתוך רקמה מסוימת (באמצעות Gal80 של רקמות ספציפיות) או בזמן מסוים (באמצעות חום Gal80 רגיש). מערכת Gal4-UAS יכול להיות משולב עם עוד מערכות בינאריות עצמאיות אחרות (כגון לקסה –lexAop ומערכות QF –QUAS ) כדי ליצור דרוזופילה שבו יש מספר מבנים (למשל fluorophores, קווים RNAi או מבנים גנטיים אחרים) הביע בו זמנית במגוון של רקמות שונות39.
השימוש המודל הגולמי דרוזופילה החדש מציע מספר יתרונות על פני הגישה המסורתית יותר העובר. בהשוואה ההדמיה לטווח קצר (עד 3 h) הזמינים ב שלב 15 עוברי (השלב שבו ביותר עובריים ופצעו מחקרים מבוצעים) גלמי יכול לדימות לאורך תקופות ארוכות יותר באופן משמעותי בזמן (בתוך המנהל עד לבגרות לאחר 96 שעות התפתחות הגולמי ). יתר על כן, מספר גדול בהרבה של hemocytes (דרוזופילה מולדת תאים חיסוניים) הם מתנה בתוך רקמות הגולמי (ו זמין עבור הדמיה) לעומת מספר מוגבל יותר מתנה בתוך העובר, זה מה שאיפשר לנו לאסוף יותר באופן משמעותי הדמיה נתונים על התנהגות hemocyte באמצעות המספר הכולל זהה של דגימות. ויותר חשוב, זה, בתורו, איפשר לנו להחיל מודלים מתימטיים מתוחכמים יותר לנתח את התנהגות hemocytes ולחלץ תכונות הרומן של הפצע attractants, תגובה דלקתית אחרת נותרו ניסיוניים לא נגיש23. יתרון נוסף של המודל הגולמי נמצא זה נוקאאוט מציאה RNAi בתיווך גנים באופן משמעותי יעיל יותר מוקדם העובריים, המאפשר ניתוח משופרת של רקמות או גנים ספציפיים זמן איון באמצעות מערכות בינאריות כגון מערכת Gal4-UAS 39. היעילות של RNAi בשלב זה ובכך נפתח את היכולת לבצע בקנה מידה גדול (או אפילו מוטים הגנום כולו) RNAi מסכי כדי לחפש רומן השחקנים המעורבים הפצע. לתקן או בהתנהגות התא דלקתיות.
עם זאת, דרוזופילה הגלמים בבירור לא ניתן להשתמש כדי ללמוד על הפנוטיפים הנובעים מוטציות גנטיות אשר הם מתחלקים קטלני; מחקרים הדמיה לחיות פונקציונלי של גנים חיוניים התפתחות ולכן עדיין יתבצע בו עוברי, אלא אם כן מציאה RNAi בתיווך גנים נוקאאוט זמן או רקמות ספציפיות באופן מאפשר פיתוח להתרחש דרך בשלבים הגולמי. העובר נשאר גם בדגם הבחירה ללמוד לחיות-התמונה תכונות מסוימות של התנהגות תא החיסון, לרבות פיזור התפתחותית של התאים החיסוניים מ מוצאם, קשר-עיכוב של גפיים, phagocytosis בגופות אפופטוטיים להיפגע שנוצר במהלך התפתחותי רקמות פיסול5,8 אשר לא נצפו עוד דגמים הגולמי. למרות מחקרים דרוזופילה הזחלים ומבוגרים סיפקו תובנה חשובה המנגנונים בפצע דלקת ותיקון40,41,42,43, 44 הדמיה לחיות מחקרים בשלבים אלה הוכיחו קשה בשל אופיו ניידים מיסודו של הדגימות. בעוד הזחלים. יכול להיות מורדם כדי לאפשר תקופות קצרות של הדמיה לחיות, בשל אופיו הזמני של ההרדמה, לתקן רק קצר תמונות של הפצע בשידור חי או תגובה דלקתית יכול להיות מטמיעים45. מחקר שנערך לאחרונה פיתחה כעת פרוטוקול משופרת המאפשרת הדמיה וקהילותיהם של ריפוי46, הפצע זחל למרות הכנה והדמיה עדיין נשארים מאתגרת יותר במידה ניכרת מאשר עוברי או הגלמים. לטווח הארוך, נוכל לדמות את זה על-ידי ניצול השלב ההתפתחותי המתאים ביותר לתת מענה לכל שאלה ספציפית, מחקרים כל ארבעת השלבים האלה דרוזופילה שונות – מן העוברים דרך ותקופות זחל הגולמי לבגרות (כל אחד עם משלהם יתרונות ייחודיים, מגבלות) – תספק משלימים תובנות המנגנון המולקולרי וסלולריות נהיגה הפצע תיקון ודלקת.
בעתיד, פרוטוקול זה עבור ופצעו והדימות לטווח ארוך של הגלמים דרוזופילה ניתן להתאים בקלות ללמוד מגוון של תופעות הקשורות דלקת ויש לו פוטנציאל מרחיק לכת עבור חשיפת הרומן תכונות של התגובה פצע דלקתי. השילוב של הדמיה לטווח ארוך, יחד עם היישום של photoconvertible fluorophores (כגון קאךה), הן בעלות ערך רב להבנת הדינמיקה של התנהגות מולדת תא החיסון והבנתי בפרט, הרחוק פחות שלב ברזולוציה של התגובה דלקתית של הפצע. על-ידי תיוג ספציפית או הפרט או subpopulations של תאים חיסוניים (כגון אלה מגויס לפצע) ניתן יהיה לנתח כיצד חשיפה אחת cue סביבתיים (כגון גופה או פציעה) משפיע על הבאים בתגובה המערכת החיסונית של התא יותר מאוחר תהיה מוכן. ניתן לשנות את התנהגות דלקתיות דרוזופילה hemocytes על ידי התנסויות קודמות – לדוגמה, הם אינם בשלה להגיב לפגיעה ברקמות מאת phagocytosis מוקדמת בגופות אפופטוטיים להיפגע במהלך פיתוח12 אבל זה נותר לראות אם רמזים סביבתיים אחרים לגרום לקרקע אירועים דומים. למרות מחקרים של פצעים הגולמי עד כה התמקדו תגובה דלקתית הטבועה, המודל כנף הגולמי מספקת הזדמנות אידיאלית שתי תמונות לחיות גם ומנתחים המנגנונים לתיקון הפצע אפיתל. יתר על כן, שיטת הדמיה הגולמי הזה יכול להתאים גם לחקור את התנהגות דינמית של אחר שושלות תאים בתגובה רקמת נזק38, האגף הגולמי עצמו או רקמות אחרות הגולמי נגיש בקלות (כגון עיניים, הרגליים או בית החזה). בסופו של דבר, על ידי שילוב של ללקוחות שלנו גנטי של דרוזופילה יחד עם הקלות של הדמיה הגולמי לטווח ארוך, תיקון אפיתל הרומן או דלקתיים הרגולטורים יכול שלא נחשפו באמצעות היישום של הגנום כולו דפיקה למטה לא משוחד גישות.
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
ברצוננו להודות לחברי של מרטין, Nobes, ריצ’רדסון, מעבדות עץ לדיון מועיל. אנו מודים גם המתקן Bioimaging וולפסון (אוניברסיטת בריסטול, אנגליה), בלומינגטון מניות מרכז (אוניברסיטת אינדיאנה, ארה ב), וינה דרוזופילה מרכז המשאבים ( דרוזופילה מניות), Flybase (עבור מעודכנים דרוזופילה ג’ין ביאור). עבודה זו נתמכה על ידי מענק פרוייקט MRC בערב ווו (מר/J002577/1), Wellcome אמון בכיר מלגת וו ו Wellcome אמון החוקר פרס עד אחה”צ.
Materials
| Drosophila stocks | |||
| ubiquitous GFP-tagged E-cadherin ;Ubi-p63E-shg.GFP; (chrII) |
Kyoto Stock Center, DGRC | #109007 | Ubi-p63E promoter sequences drive expression of Drosophila E-cadherin (shotgun) tagged at the C-terminal end with GFP. |
| ubiquitous GFP-tagged E-cadherin ;;Ubi-p63E-shg.GFP (III) |
Bloomington Drosophila Stock Centre (Indiana University) | #58742 | Ubi-p63E promoter sequences drive expression of Drosophila E-cadherin (shotgun) tagged at the C-terminal end with GFP. |
| ubiquitous GFP-tagged Moesin P{sGMCA}3.1 |
Bloomington Drosophila Stock Centre (Indiana University) | #59023 | The ubiquitously expressed sqh promoter/enhancer drives expression of a fragment of Moesin (that includes the actin binding sequences) tagged with GFPS65T. |
| hemocyte specific serpent-Gal4 driver ;srp-Gal4; |
Generated by Katja Bruckner | Generated by Katja Bruckner | Expression of ScerGAL4 fused to a polyA tail is under the control of 2 genomic sequences from upstream of Drosophila serpent. Ref: Brückner, K., Kockel, L., Duchek, P., Luque, C.M., Rørth, P., Perrimon, N. The PDGF/VEGF receptor controls blood cell survival in Drosophila. Dev Cell. 7 (1), 73–84, doi: 10.1016/j.devcel.2004.06.007 (2004). |
| UAS-nuclearRFP w1118;;P{UAS-RedStinger}6 |
Bloomington Drosophila Stock Centre (Indiana University) | #8545 or #8547 | UAS regulatory sequences drive expression of the DsRed.T4 form of RFP which is tagged at the C-terminal end with a nuclear localisation signal |
| UAS-cytoplasmicGFP ;;P{UAS-GFP.S65T} |
Bloomington Drosophila Stock Centre (Indiana University) | Multiple stocks available (e.g. #1522) | Expression of the S65T version of GFP by UAS regulatory sequences; the S65T variant exhibits increased brightness. |
| UAS-photoconvertibleKaede w1118;; P{UAS-Kaede.A}3 |
Bloomington Drosophila Stock Centre (Indiana University) | #26161 | Kaede protein emits bright green fluorescence after synthesis, but changes efficiently to a bright stable red fluorescence on irradiation with UV. |
| GFP-tagged spaghetti squash w1118;;P{sqh-GFP.RLC} |
Bloomington Drosophila Stock Centre (Indiana University) | #57145 | The sqh coding region, which is tagged at the C-terminal end with a T:AvicGFPS65T tag, is expressed under the control of the natural sqh promoter. |
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Ingredients for fly food media | Fly food media is made according to standard procedures (see Greenspan, R. 1997. Fly Pushing: The Theory and Practice of Drosophila Genetics. Cold Spring Harbor Press. 1-191 pp.) | ||
| maize | Wild Oats, Bristol, UK (or equivalent supplier) | Contact supplier direct | organic |
| soya flour | Wild Oats, Bristol, UK (or equivalent supplier) | Contact supplier direct | organic |
| malt extract | Wild Oats, Bristol, UK (or equivalent supplier) | Contact supplier direct | organic |
| molasses | Wild Oats, Bristol, UK (or equivalent supplier) | Contact supplier direct | organic |
| Difco agar | BD Biosciences, Fisher Scientific | DF0142-15-2 | For preparation of fly food |
| Propionic acid | Sigma | 402907 | For preparation of fly food |
| Nipagen | Sigma | 79721 | For preparation of fly food |
| Dried baker's yeast | Redstar, Dutscher Scientific, UK LTD | Redstar, Dutscher Scientific, UK LTD | For preparation of fly food |
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Sample preparation and mounting | |||
| Parafilm | Sigma | P7793-1EA | For preparation of heptane glue |
| Fine sable paintbrush | Daler-Rowney (or equivalent) | #0 or 1 | |
| Forceps | Fisher Scientific (or Fine Science Tools) | NC9404145 | Dumont #5 |
| Glass bottomed dishes for imaging | MatTek | P35G-0-10-C | We suggest using 35mm petri dishes, with at least a 10mm Microwell, 0.085-0.13mm cover glass, uncoated. Dishes with larger microwells will enable increasing numbers of pupae to be mounted and imaged in a single experiment. |
| Heptane | Sigma | 51730-5ML | For preparation of heptane glue |
| Double sided sticky tape (e.g. Scotch) | Agar Scientific | AGG263 | For preparation of heptane glue |
| 50ml tube (for heptane glue) | Falcon tubes from Fisher Scientific | 14-432-22 | For preparation of heptane glue |
| Glass microscope slides | Agar Scientific | AGL4244 | For dissection of Drosophila pupae |
| Dissecting stereo microscope with brightfield | Leica (or equivalent) | M50 | For dissection of Drosophila pupae |
| Microscissors | John Weiss International | 103123 | Miniature Research Scissors (straight) |
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Laser ablation and imaging | |||
| Nitogen ablation laser | Spectra-Physics (or Andor equivalent) | Model VSL-337ND-S | For wounding, this should be attached to a widefield imaging system |
| Multilaser confocal laser-scanning microscope (CLSM) | Leica (or equivalent) | TCS AOBS SP8 or SP5-II attached to a Leica DMi8 inverted epifluorescence microscope (or equivalent) | Ideally including a motorised stage for multi-site and 'mosaic' scanning, plus ‘hybrid’ GaAsP detectors (that offer much greater sensitivity and boosting of low signal) |
| Environmental chamber | Life Imaging Services (or equivalent) | "Microscope Temperature Control System" | Attached to Confocal microscope for temperature control during imaging |
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Image Analysis Software | |||
| FRAP software module | Leica (or equivalent) | CLSM FRAP software module | For performing photoconversion of photoconvertible fluorophores such as Kaede |
| ImageJ (image analysis software) | National Institutes of Health (NIH) | https://imagej.nih.gov/ij/ | Schneider, C.A., Rasband, W.S., Eliceiri, K.W. "NIH Image to ImageJ: 25 years of image analysis". Nature Methods 9, 671-675, 2012. |
| ImageJ plugin "Manual Tracking" | National Institutes of Health (NIH) | https://imagej.net/Manual_Tracking | |
| ImageJ plugin "TrackMate" | ImageJ, NIH | https://imagej.net/TrackMate | Tinevez, JY.; Perry, N. & Schindelin, J. et al. (2016), "TrackMate: An open and extensible platform for single-particle tracking.", Methods 115: 80-90, PMID 27713081 |
| Volocity (high performance 3D imaging software) | Perkin Elmer | Volocity 6.3 | For image analysis |
| IMARIS (image analysis software) | Bitplane | IMARIS for Cell Biologists | For image analysis |
References
- Eming, S. A., Wynn, T. A., Martin, P. Inflammation and metabolism in tissue repair and regeneration. Science. 356 (6342), 1026-1030 (2017).
- Crusz, S. M., Balkwill, F. R. Inflammation and cancer: advances and new agents. Nature Reviews Clinical Oncology. 12 (10), 584-596 (2015).
- Martin, P., Nunan, R. Cellular and molecular mechanisms of repair in acute and chronic wound healing. British Journal of Dermatology. 173 (2), 370-378 (2015).
- Razzell, W., Wood, W., Martin, P. Swatting flies: modelling wound healing and inflammation in Drosophila. Disease Model and Mechanism. 4 (5), 569-574 (2011).
- Wood, W., Martin, P. Macrophage Functions in Tissue Patterning and Disease: New Insights from the Fly. Development Cell. 40 (3), 221-233 (2017).
- Mohr, S. E., Smith, J. A., Shamu, C. E., Neumüller, R. A., Perrimon, N. RNAi screening comes of age: improved techniques and complementary approaches. Nature Reviews Molecular Cell Biology. 15 (9), 591-600 (2014).
- Muñoz-Soriano, V., López-Domenech, S., Paricio, N. Why mammalian wound-healing researchers may wish to turn to Drosophila as a model. Experimental Dermatology. 23 (8), 538-542 (2014).
- Weavers, H., Wood, W. Creating a Buzz about Macrophages: The Fly as an In Vivo Model for Studying Immune Cell Behavior. Developmental Cell. 38 (2), 129-132 (2016).
- Stramer, B., et al. Live imaging of wound inflammation in Drosophila embryos reveals key roles for small GTPases during in vivo cell migration. Journal of Cell Biology. 168 (4), 567-573 (2005).
- Wood, W., Faria, C., Jacinto, A. Distinct mechanisms regulate hemocyte chemotaxis during development and wound healing in Drosophila melanogaster. Journal of Cell Biolog. 173 (3), 405-416 (2006).
- Razzell, W., Evans, I. R., Martin, P., Wood, W. Calcium flashes orchestrate the wound inflammatory response through DUOX activation and hydrogen peroxide release. Current Biology. 23 (5), 424-429 (2013).
- Weavers, H., Evans, I. R., Martin, P., Wood, W. Corpse Engulfment Generates a Molecular Memory that Primes the Macrophage Inflammatory Response. Cell. , (2016).
- Stramer, B., Winfield, M., Shaw, T., Millard, T. H., Woolner, S., Martin, P. Gene induction following wounding of wild-type versus macrophage-deficient Drosophila embryos. EMBO Reports. 9 (5), 465-471 (2008).
- Matsubayashi, Y., Coulson-Gilmer, C., Millard, T. H. Endocytosis-dependent coordination of multiple actin regulators is required for wound healing. Journal of Cell Bioliogy. 210 (3), 419-433 (2015).
- Evans, I. R., Rodrigues, F. S. L. M., Armitage, E. L., Wood, W. Draper/CED-1 Mediates an Ancient Damage Response to Control Inflammatory Blood Cell Migration In Vivo. Current Biology. 25 (12), 1606-1612 (2015).
- Zanet, J., Stramer, B., Millard, T., Martin, P., Payre, F., Plaza, S. Fascin is required for blood cell migration during Drosophila embryogenesis. Development. 136 (15), 2557-2565 (2009).
- Bainbridge, S. P., Bownes, M. Staging the metamorphosis of Drosophila melanogaster. Journal of Embryology and Experimental Morphology. 66, 57-80 (1981).
- Ninov, N., Martín-Blanco, E. Live imaging of epidermal morphogenesis during the development of the adult abdominal epidermis of Drosophila. Nature Protocols. 2 (12), 3074-3080 (2007).
- Gho, M., Bellaïche, Y., Schweisguth, F. Revisiting the Drosophila microchaete lineage: a novel intrinsically asymmetric cell division generates a glial cell. Development. 126 (16), 3573-3584 (1999).
- Puah, W. C., Wasser, M. Live imaging of muscles in Drosophila metamorphosis: Towards high-throughput gene identification and function analysis. Methods. 96, 103-117 (2016).
- Berh, D., Scherzinger, A., Otto, N., Jiang, X., Klämbt, C., Risse, B. Automatic non-invasive heartbeat quantification of Drosophila pupae. Computers in Biology and Medicine. 93, 189-199 (2018).
- Sander, M., Squarr, A. J., Risse, B., Jiang, X., Bogdan, S. Drosophila pupal macrophages–a versatile tool for combined ex vivo and in vivo imaging of actin dynamics at high resolution. European Journal of Cell Biology. 92 (10-11), 349-354 (2013).
- Weavers, H., Liepe, J., Sim, A., Wood, W., Martin, P., Stumpf, M. P. H. Systems Analysis of the Dynamic Inflammatory Response to Tissue Damage Reveals Spatiotemporal Properties of the Wound Attractant Gradient. Current Biology. 26 (15), 1975-1989 (2016).
- Fristrom, D., Wilcox, M., Fristrom, J. The distribution of PS integrins, laminin A and F-actin during key stages in Drosophila wing development. Development. 117 (2), (1993).
- Brückner, K., Kockel, L., Duchek, P., Luque, C. M., Rørth, P., Perrimon, N. The PDGF/VEGF receptor controls blood cell survival in Drosophila. Development Cell. 7 (1), 73-84 (2004).
- Diehl, H., Ihlefield, H., Schwegler, H. . Physik fur Biologen. , (1991).
- Stewart, P. S., McFeters, G. A., Huang, C. T. Biofilm control by antimicrobial agents. Biofilms II Process Analysis and Application. , 373-405 (2000).
- . Cell Biology by the Numbers Available from: https://books.google.com/books?id=9NPRCgAAQBAJ&pgis=1 (2015)
- Ando, R., Hama, H., Yamamoto-Hino, M., Mizuno, H., Miyawaki, A. An optical marker based on the UV-induced green-to-red photoconversion of a fluorescent protein. Proceeding of National Academy of Science U S A. 99 (20), 12651-12656 (2002).
- Brand, A. H., Perrimon, N. Targeted gene expression as a means of altering cell fates and generating dominant phenotypes. Development. 118 (2), 401-415 (1993).
- Schneider, C. A., Rasband, W. S., Eliceiri, K. W. NIH Image to ImageJ: 25 years of image analysis. Nature Methods. 9 (7), 671-675 (2012).
- Tinevez, J. -. Y., et al. TrackMate: An open and extensible platform for single-particle tracking. Methods. 115, 80-90 (2017).
- Grueber, W., et al. Projections of Drosophila multidendritic neurons in the central nervous system: links with peripheral dendrite morphology. Development. 134 (1), 55-64 (2007).
- Wood, W., Faria, C., Jacinto, A. Distinct mechanisms regulate hemocyte chemotaxis during development and wound healing in Drosophila melanogaster. Journal of Cell Biology. 173 (3), 405-416 (2006).
- Wood, W., et al. Wound healing recapitulates morphogenesis in Drosophila embryos. Nature Cell Biology. 4 (11), 907-912 (2002).
- Franz, A., Wood, W., Martin, P. Fat Body Cells Are Motile and Actively Migrate to Wounds to Drive Repair and Prevent Infection. Developmetal Cell. 44 (4), 460-470 (2018).
- del Valle Rodríguez, A., Didiano, D., Desplan, C. Power tools for gene expression and clonal analysis in Drosophila. Nature Methods. 9 (1), 47-55 (2012).
- Losick, V. P., Fox, D. T., Spradling, A. C. Polyploidization and Cell Fusion Contribute to Wound Healing in the Adult Drosophila Epithelium. Current Biology. 23 (22), 2224-2232 (2013).
- Babcock, D. T., et al. Circulating blood cells function as a surveillance system for damaged tissue in Drosophila larvae. Proceedings of National Academy of Science U S A. 105 (29), 10017-10022 (2008).
- Galko, M. J., et al. Cellular and Genetic Analysis of Wound Healing in Drosophila Larvae. PLoS Biology. 2 (8), e239 (2004).
- Brock, A. R., et al. Transcriptional regulation of Profilin during wound closure in Drosophila larvae. Journal of Cell Science. 125 (23), (2013).
- Wu, Y., Brock, A. R., Wang, Y., Fujitani, K., Ueda, R., Galko, M. J. A blood-borne PDGF/VEGF-like ligand initiates wound-induced epidermal cell migration in Drosophila larvae. Current Biology. 19 (17), 1473-1477 (2009).
- Burra, S., Wang, Y., Brock, A. R., Galko, M. J. Using Drosophila Larvae to Study Epidermal Wound Closure and Inflammation. Methods in Molecular Biology. 1037, 449-461 (2013).
- Kakanj, P., et al. Insulin and TOR signal in parallel through FOXO and S6K to promote epithelial wound healing. Nature Communications. 7, 12972 (2016).
