어디 당신이 문제: 한 해 부 자르고 눈 랜드마크에서 마우스 망막의 공간적 방향에 대 한 분석 가이드

여기에 설명 된 모든 메서드는 기관 동물 관리 및 사용 위원회 (IACUC)의 애 크 론 대학에 의해 승인 되었습니다. 1.를 사용 하 여 우수한 곧바로 근육 랜드마크 망막 방향 식별 참고: 우수한 곧바로 근육 등 망막 (표 1)에 대 한 랜드마크입니다. 실험 등 망막의 표시를 요구 하지 않으면 1 단계를 생략 하 고 2 단계로 계속. 마우스 안락사에 대 한 승인된 기관 동물 관리 및 사용 위원회 프로토콜을 따릅니다. 세계의 일반적인 방향을 식별, 화상을 직접 안락사 (그림 1A) 직후 각 막 공 막 국경 근처 비 강 및 임시 canthi 사이 지 각 막에 표시를 확인 합니다. 굽기로 펜 10 초간가 열 하 고 다음 두 번째 미만 등 각 막에 펜 끝을 감동 하 여 표시를 확인 합니다.참고: 들고 있지만 펜에 대 한 각 막에 너무 오래 펑크 세계를 일으킬 것입니다.참고: 일부 있지만 펜 빛을 방출 할 하는 동안 재료의 테이블에 에서 나열 된로 펜 dark-adapted 실험에 대 한 안전 옵션가 열 될 때 빛을 방출 하지 않습니다. Enucleation, 곡선된 겸 자 사용 하 여 부드럽게 눈을 소켓에 밀어 그립 밑에서 세계를. 세계;를 제거 하는 시 신경 절단 하지 마십시오 대신, 천천히 들어올립니다 세계 그것의 소켓에서 동시에 움직이는 동안 부드럽게 왼쪽에서 오른쪽으로 세계는 소켓에서 뺍니다.참고:이 모션 곧바로 근육이 마침내 세계 소켓에서 완전히 제거 될 때 세계에 연결 된 남아 있게 됩니다. 시 신경 또한 종종 세계에 연결 된 유지 됩니다. 절 개 매체를 포함 하는 페 트리 접시에 곧바로 연결 된 근육으로 전 세계를 전송 합니다. 어느 눈은 왼쪽된 눈과 오른쪽 눈은 있는지 확인 합니다.참고:는 것 그들의 실험 프로토콜에 정렬 한 적절 한 해 부 매체를 사용 해야 합니다. 절 개 범위에서 시각적으로 지 각 막 화상 찾아서 식별과 우수한 곧바로 근육 그것은 관련 (그림 1A). G (0.9 m m x 25 m m) 화상 표시에서 각 막 ( 재료의 표참조), 펑크 바늘 해 부가 위 또는 20를 사용 하 여. 뛰어난 근육을 이등분 하는 시 신경으로 세계에 컷을 덜어 깊은 확인 합니다. 이 컷을 격리 하 고 재건 망막 그림 1B 및 1 C에 표시 됩니다. 부드럽게 망막의 부분 노출 될 때까지 단계 1.6에서에서 빵 꾸로 만든 구멍을 찢 어를 포 셉 ( 재료의 표참조)의 두 세트를 사용 하 여 망막을 분리 하기 시작 합니다.참고: 그것은 중요 한 것이 너무 강력 하 게 찢 어 서, 부드럽게 할 수 더 눈물로 덜어 잘라내기 발생할 수 있습니다. 집게를 사용 하 여 애타게 떨어져는 공 막에서 망막까지 공 막 엔 완전히 제거 되었습니다. 망막은 완전히 격리 될 때까지 집게와 조리개, 렌즈, 유리, 및 모든 나머지 구조를 제거 합니다.참고: 프로토콜 수 있습니다 수 일시 중지 여기. 조직 s opsin immunohistochemistry 고정 될 것 이다, 단계 3.5 계속. 2.를 사용 하 여 맥락 막 게 랜드마크 망막 방향 식별 참고: 맥락 막 게 sclera 눈의 뒷면에 존재 하는 및 비 강 극 (그림 2B 와 2c; 임시 극에서 실행 표 1). 마우스 안락사에 대 한 승인된 기관 동물 관리 및 사용 위원회 프로토콜을 따릅니다. 세계의 일반적인 방향을 식별, 화상을 직접 안락사 (그림 2A) 직후 각 막 공 막 국경 근처 비 강 및 임시 canthi 사이 지 각 막에 표시를 확인 합니다. 굽기로 펜 10 초간가 열 하 고 다음 두 번째 미만 등 각 막에 펜 끝을 감동 하 여 표시를 확인 합니다.참고: 들고 있지만 펜에 대 한 각 막에 너무 오래 펑크 세계를 일으킬 것입니다. 눈을 enucleate 하 고 전송 해 부 매체를 포함 하는 페 트리 접시에 세계. 어느 눈은 왼쪽된 눈과 오른쪽 눈은 있는지 확인 합니다.참고:는 것 그들의 실험 프로토콜에 정렬 한 적절 한 해 부 매체를 사용 해야 합니다. 시각적으로 찾아서 뒷면 (그림 2B, 2c) 눈의 맥락 막 균열을 확인 합니다.참고: 맥락 막 게 적외선 라이트20아이피 내부 표시 이기도합니다. 마우스에 여전히 눈 이라면 될 것 이라고 지 굽기는 우수한 극에 페 트리 접시에 세계 동양.참고:는 지 느 러 미의 존재 화상의 세계, 비 강 및 시간적 측면의 식별에 대 한 수 만큼 오른쪽 또는 왼쪽 눈 인지 문서화 되었습니다: 오른쪽 눈 이면 코 맥락 막 게 화상 및는 tempora의 오른쪽에 있을 것입니다 화상의 왼쪽 l 맥락 막 게 될 것입니다. 왼쪽된 눈 이면 시간적 맥락 막 게 화상의 오른쪽에 있을 것입니다 그리고 비 맥락 막 게 화상의 왼쪽에 있을 것입니다.해 부가 위 또는 20를 사용 하 여 G (0.9 x 25 m m) 등 화상은 세계에 ( 재료의 표참조) 확인 한 펑크 바늘. 확인 하십시오 얕은 덜어 시 신경으로 컷 등 각 막 화상은. 이 컷 절연 (그림 2D) 후 지 망막의 식별을 위해 허용 하는 맥락 막 균열에 수직 될 것입니다. 시 신경으로 다음 두 개의 깊은 덜어 삭감: 해 부의 칼 날을 줄 하나는 눈의 뒤에 시간적 맥락 막 게 라인을 위 및 해 부의 칼 날을 줄 하나를 비 맥락 막과가 위 눈의 뒷면에 게 선입니다. 이 상처는 그림 2D 와 2E고립과 재건 망막에 표시 됩니다.참고: 또는 시간적 맥락 막 균열에 깊은 상처를 만들 수 있습니다 하 고 불필요 한 컷 등 각 막 화상을 만드는 코 맥락 막 균열에서 얕은 상처를 만들 수 있습니다. 적은 덜어 삭감으로 망막의 정확한 방향에 대 한 수 있습니다. 부드럽게 망막의 부분 노출까지 2.7 및 2.8 단계에서 빵 꾸로 만든 구멍을 찢 어를 포 셉 ( 재료의 표참조)의 두 세트를 사용 하 여 망막을 분리 하기 시작 합니다.참고: 그것은 중요 한 것이 너무 강력 하 게 찢 어 서, 부드럽게 할 수 더 눈물로 덜어 cut(s) 발생할 수 있습니다. 집게를 사용 하 여 애타게 떨어져는 공 막에서 망막까지 공 막 엔 완전히 제거 되었습니다. 망막은 완전히 격리 될 때까지 집게와 조리개, 렌즈, 유리, 및 모든 나머지 구조를 제거 합니다.참고: 프로토콜 수 있습니다 수 일시 중지 여기. 조직 s opsin immunohistochemistry 고정 될 것 이다, 단계 3.5 계속. 3. 라벨 마우스 망막에 S opsin 그라데이션 참고: s-opsin photopigment 식 비대칭으로 복 부 망막1, 망막의 복 부 절반에 대 한 우수한 마커 만들기 배포 됩니다. 이 메서드는만 고정 및 immunostained 조직 (표 1). 다음 단계는 상기 방법 중 하나를 사용 하 여 해 부 되어 있는 망막에 적용할 수 있습니다. 마우스 안락사에 대 한 승인된 기관 동물 관리 및 사용 위원회 프로토콜을 따릅니다. 안락사, 직후 눈을 enucleate 하 고 세계 해 부 매체와 페 트리 접시에 놓습니다. 어느 눈은 왼쪽된 눈과 오른쪽 눈 망막 해 부 후 망막 방향 식별입니다 있는지 확인 합니다.참고:는 것 그들의 실험 프로토콜에 정렬 한 적절 한 해 부 매체를 사용 해야 합니다. 망막의 부분 노출 될 때까지 부드럽게 각 막에 구멍을 찢을 집게 (자료 테이블)의 두 세트를 사용 하 여 망막을 시작 합니다.참고: 그것은 중요 한 것이 너무 강력 하 게 찢 어 서, 부드럽게 할 수 눈물로 망막을 발생할 수 있습니다. 집게를 사용 하 여 애타게 떨어져는 공 막에서 망막까지 공 막 엔 완전히 제거 되었습니다. 망막은 완전히 격리 될 때까지 집게와 조리개, 렌즈, 유리, 및 모든 나머지 구조를 제거 합니다.참고: 프로토콜 수 있습니다 수 일시 중지 여기. 사용 하 여 망막은 ex vivo 실험 하는 경우 다음 단계를 수행 하기 전에 실험을 실시 합니다. 해 부가 위를 사용 하 여 할 망막에 4 구호 상처 그래서 평평 거짓말 것입니다. 집게와 막에 망막의 각 모서리를 부드럽게 눌러 니트로 막 (자료 테이블)에 최대 망막 신경 절 세포 쪽 탑재 합니다.참고: 완화 상처의 위치 수 임의 망막 방향에 대 한 s opsin 그라디언트를 사용 하 여. 집게를 사용 하 여 전송 탑재 망막 24-잘 접시 (자료 테이블)의 첫 번째 잘 가득 1 mL 4 %paraformaldehyde (자료 테이블)의 고정을 위한. 실내 온도 (자료 테이블)에 궤도 통에 24-잘 접시를 놓고 40 분 정확 하 게 망막을 수정 합니다.참고: 모든 다음 세척 및 인큐베이션 단계 궤도 통에 24-잘 접시와 함께 완료 되어야 한다. 잘 1 mL의 0.1 M PBS 가득한 두 번째 그것을 전송 하 여 실 온에서 15 분 동안 망막을 씻어. 두 번 순차적으로 0.1 M PBS 가득 세 번째 및 네 번째 우물에 망막을 전송 하 여이 단계를 반복 합니다. 차단 솔루션 (1.7% 트라이 톤 X-100 그리고 5.2% 당나귀 정상 혈 청 0.1 M PBS에, 참조 테이블의 재료)의 다섯 번째 잘 포함 1 mL에 탑재 된 망막을 전송 하 고 하룻밤 4 ° c.에 품 어 토끼 반-s-opsin 1 차적인 항 체를 추가 ( 재료의 표참조) 1: 500의 농도에 차단 솔루션 및 4 ° c.에 3 일 동안 품 어 순차적으로 각 실 온에서 10 분 동안 1 mL의 0.1 M PBS 가득한 6 우물에 그것을 배치 하 여 망막에서 초과 1 차적인 항 체 6 번을 씻어. 망막에 신선한 차단 솔루션 (1.7% 트라이 톤 X-100 그리고 5.2% 당나귀 정상 혈 청 0.1 M PBS에) 잘 놓고 당나귀 안티 토끼 알 렉 사-594 이차 항 체를 추가 ( 재료의 표참조). 4 ° c.에 하룻밤 이차 항 체와 망막을 품 어 순차적으로 각 실 온에서 10 분 동안 신선한 0.1 M PBS의 1 mL 가득 6 웰 스에 배치 하 여 망막에서 초과 이차 항 체 6 번을 씻어. 0.1 m M PBS를 포함 하는 배양 접시에 탑재 된 망막을 전송 집게를 사용 하 여. 망막 이상 연결 될 때까지 부드럽게 망막 사이의 막 집게의 끝을 삽입 하 여 니트로 막에서 망막을 놓습니다. 부드럽게 망막 유리에 붙어 때까지 집게와 괴롭히는 여 유리 현미경 슬라이드에 망막을 탑재 하 고 페 트리 접시에서 슬라이드를 제거 합니다. Aquamount와 함께 슬라이드에 망막을 커버 하 고 #1.5 coverslip로 그것을 커버. 슬라이드 슬라이드 트레이에 배치 ( 재료의 표참조) 하 고 실 온에서 한 시간 동안 앉아. 냉장고와 저장소 슬라이드 트레이에서 슬라이드 돌아가기 ( 재료의 표참조) 사용에 4 ° C에서. 후 슬라이드 coverslipped 24 시간 동안, 매니큐어를 사용 하 여 건조를 방지 하기 위해 슬라이드의 측면을 봉인.참고: 프로토콜 수 수 일시 중지 여기. 4. 사용 하 여 재건 S-opsin 망막 방향 식별 하와 망막 Immunostained Confocal 현미경 또는 카메라 부착을 가진 epifluorescent 현미경 s opsin 그라데이션 시각화 ( 재료의 표참조)는 망막 전체 망막은 하나의 이미지(그림 1B, 2D, 3A, 및 에서에서 볼 수 있도록 이미지 3D). 이것은 낮은 확대 섹션에서 망막을 상상 하 고 다음 이미지를 함께 바느질 하 여 행 해질 수 있다. 그래서 그들은 식별 된 망막을 이름을 지정 합니다. 예를 들어, 이름을 수 첫 번째 망막 재건 “Retina1”. 다운로드 및 https://imagej.nih.gov/ij/download.html에 ImageJ를 설치. 개축 될 하지만 폴더를 비워 각 망막에 대 한 개별 폴더를 만듭니다. 예를 들어 “Retina1” 라는 폴더를 만듭니다. 이 망막을 재구성 하는 데 필요한 모든 파일은 이후 단계에서이 폴더에 배치 됩니다.참고:이 폴더 포함 해야 유일한 파일은 Retistruct에 의해 분석할 파일. 아래 열거 하는 이외의 모든 파일 Retistruct 소프트웨어에서 열 수 없는 망막을 만들 것입니다. 파일을 선택 하 여 ImageJ에 망막의 이미지를 엽니다 → “Retina1” 선택 하 고 열기. 이미지를 지금 변경 하지 않고 “image.png” 폴더 제목으로 저장 “망막” 파일 → 다른 이름으로 저장 → PNG를 선택 하 여 1.참고: 파일 “image.png” 재건에 대 한 망막으로 인식 하도록 Retistruct 소프트웨어에 대 한 순서로 선정 해야 합니다. 세그먼트 선 도구를 사용 하 여 망막의 가장자리를 대략적으로. 망막의 테두리에서 두 개의 인접 한 관광 명소를 클릭 하 여 세그먼트 선 도구는 기본적으로 “” 윤곽을 만드는 두 개의 인접 한 관광 명소 사이의 점 들을 연결 것입니다. 전체 망막 설명 될 때까지 반복 합니다. 망막 개요 분석을 선택 하 여 “Retina1” 라는 폴더에 “outline.roi”로 저장 → 도구 → ROI 관리자 → [t] → 저장 →를 추가 합니다.참고: 망막의 가장자리 식별할 수 있습니다 어디 배경 전환 s opsin 얼룩. 광학 디스크의 테두리 개요 세그먼트 선 도구 단계 4.7에서에서 지시 하는 대로 사용 합니다. 광학 디스크 개요 분석을 선택 하 여 “Retina1” 라는 폴더에 “od.roi”로 저장 → 도구 → ROI 관리자 → [t] → 저장 →를 추가 합니다.참고: 광학 디스크 망막, 중간 작은 구멍으로 식별 되 고 해 부의 품질에 따라 달라 집니다.참고: Retistruct 개조 (“image.png”, “outline.roi”, 및 “od.roi”)에 필요한 파일을 모두 해야 이제 저장 폴더 “Retina1”. 다운로드, 설치, 및 Retistruct 프로그램, Sterratt, 그 외 의 보충 자료 섹션에서 Retistruct 사용자 가이드에 설명 된 지침에 따라 24 창 등장 했다 Retistruct 클릭 상단에 있는 “열기” 아이콘 창의 왼쪽 하 고 “Retina1” 디렉터리 폴더를 선택 합니다. 이미지 창 없음 눈금 막대 있는지 나타내는 나타납니다. “닫기”를 클릭 하 고 망막의 이미지 상자에 나타납니다. 상단에 있는 “속성” 버튼을 클릭 하 여 망막의 개요를 시각화 표시 색상 (그림 5A) 창 및 변경 윤곽선 색의 오른쪽. 중요: 오른쪽 눈 또는 (그림 5A) 왼쪽에 있는 패널의 왼쪽된 눈에서 망막 인지 지정 합니다. 왼쪽에 있는 “눈물 추가” 버튼을 클릭 하 고 눈물 또는 커트가 망막 눈물 (그림 5A)의 세 꼭지점을 클릭 하 여 지정 합니다. 이 컷의 세 꼭지점을 연결 하는 선을 만듭니다. 망막에 모든 상처에 대 한 반복 합니다. 등 쪽 망막 망막 개요의 임의의 지점에 클릭 하 여 지정 합니다. 대문자 “D”는 (그림 5B) 개요에 그 시점에서 표시 됩니다.참고: 등 망막 s opsin 그라디언트 반대 망막의 어두운 반 될 것입니다. 그러나, Retistruct에 지 망막 표시 아니다 “등”의 표시가이 단계에서 임의의 수는 망막의 등 절반을 식별 하는 신뢰할 수 있는 방법. 화면 (그림 5B)의 왼쪽 상단에 “재구성 망막” 버튼을 클릭 하 여 망막을 재구성 합니다. 재건축된 망막의 극 작 인하 개요 (그림 5C)와 같은 색상에 표시와 함께 표시 됩니다. 재건축된 망막과 관련 된 데이터의 모든 “Retina1” 폴더 디렉터리 (그림 5D)에 저장 되도록 화면의 오른쪽에 있는 “저장” 버튼을 클릭 합니다. 오른쪽 패널 (그림 5D)의 “PDF” 버튼을 클릭 하 여 복원된 망막을 저장 합니다. 상자 크기 사양에 대 한 묻는 나타납니다. 기본 크기는 다음 단계에 대 한 허용. 이 작업은 “Retina1” 폴더 디렉터리에 “image.polar.pdf”로 재건된 망막을 저장 됩니다. 그림판 프로그램 (또는 기타 이미지 처리 프로그램)에서 “image.polar.pdf”를 열고 “페인트 통” 도구를 사용 하 여 (또는 유사한) 검정 재건된 망막의 배경을 변경 하려면. “Retina1_reconstructed.tif” “Retina1” 폴더 디렉터리에 같은.tif 파일로 복원된 망막을 저장 합니다.참고: 프로토콜 수 수 일시 중지 여기. 회전 하는 “Retina_Rotator.m” (보충 자료 참조) 라고 하는 망막에 대 한 MATLAB 코드를 다운로드 합니다. 폴더에 다른 파일 코드 파일을 자체 폴더에 놓습니다. MATLAB, 버전 2007b 열 이상. MATLAB에서 그것을 여는 코드 파일에 더블 클릭. 명령 창에서 “Retina_Rotator”를 입력 한 다음 enter 키를 누르십시오. 검색 창이 나타납니다.참고:이 코드는 특정.tif 파일에 대 한. 회전 파일 올바른 형식에 없는 경우 코드는 회전 하지 망막 올바르게. 4.17-4.18 단계를 참조 하십시오. 위해 적절 한 형태로 복원 된 망막을 저장. 회전을 파일을 엽니다. 예를 들어 “Retina1_reconstructed.tif”를 선택 하십시오. 코드 다음 복원된 망막 분석 하 고 자동으로 원본 파일이 있는 폴더에 “Retina1_reconstructed_rotated.tif”로 회전된 망막을 저장 합니다. 망막 분석 코드가 완료 된 후 창이 나타납니다 이전과 비교 (그림 3B 와 3 C;에 대 한 회전 후 망막의 이미지를 보여주는 3E 피 규 어 및 3 층).참고:이 코드는 바닥에 복 부 (밝은) 절반은 고 등 (흐릿한) 절반은 따라서 정확 하 게 방향을 s opsin 그라데이션1에 따라 망막 위에 재건된 망막을 회전 합니다. 만약 여부 망막에서 오른쪽 눈은 왼쪽된 눈 문서화 되었습니다, 비 강 및 일시적인 극의 위치는 또한 방향 (그림 3)의이 방법에서 추정 수 있습니다.