蛍光住セル完全の栄養細胞周期の遅い成長社会細菌Myxococcus ザンサス

1. 準備との成長M. ザンサス系統 注: は、表 1と表 2を参照してください。 カナマイシン (50 μ g/mL) を添加した 10 mM トリス塩酸 pH 8.0、1 mM KH2PO4 pH 7.6, 8 mM MgSO422, 1 sitone スープ (CTT) 成長中 1% (w/v) 膵臓のダイジェスト (例えば、バクト casitone)、カゼインを準備かオキシテトラサイクリン (10 μ G/ml)。それ以来他の細菌による汚染のリスクを減らすためにすべてのメディアにゲンタマイシン (10 μ G/ml) を追加M. ザンサス細胞が自然に耐性があります。 1 %5 mL を接種する CTT 関連を含む野生の 1 つ新たに育てられた植民地と抗生剤を参照」と入力 (WT) DK1622 23, SA4420 (ΔmglA)24SA4797 (ΔmglA、ΔpomX/PpomZ mCherry pomX)16, SA8241 (ΔmglA、 ftsZ+/PnatftsZ-gfp)、または SA4749 (ΔmglA、 parB+/PnatparB-yfp) で、1 日目の朝。 シングルを再懸濁しますM. ザンサスCTT が生殖不能の管に抗生物質を添加した、全体の懸濁液を 50 mL の三角フラスコを 5 mL の 1% を含むに転送 1 0 μ L の植民地 CTT。注: は十分な aeriation と最適な成長を保証するのに 10 回文化のボリュームと三角フラスコを使用します。 220 rpm、暗闇の中で揺れ、32 ° C で 8 世代 (4-6 時間の世代時間約 40-48 h) のセルを育てなさい。急激な成長の段階で細胞を維持 (外径550 < 1.2) 静止した段階に達することからそれらを防ぐためです。必要な場合は、新鮮な 1 %ctt 培 0.1 の OD550に関連する抗生剤を参照に細胞を希釈 – 0.2。注: 単一細胞顕微鏡用最適外径550は、0.5 – 0.7。この OD550で十分な細胞数により細胞パラメーターの統計的解析と同様に、定量化するイメージごとことがあります。 2. 顕微鏡用試料の調製 注: 顕微鏡で見られるようにセルを顕微鏡観察に配置して、栄養素を含む agarose パッドでカバーします。Coverslip がプラスチックに接着または機械的に提供するために金属製のフレームをサポートします。顕微鏡検査の準備で、1% の agarose/TPM/0.2% の大きいパッド CTT 準備されるべき事前 2.1 2.3 の手順で説明するように。ここで使用される特定の製品の材料の表も参照してください。 TPM バッファー (10 mM トリス塩酸 pH 7.6, 1 mM KH2PO4 pH 7.6, 8 mM MgSO4) の 500 mL を準備し、オートクレーブまたはフィルター滅菌ボトル上部フィルターを使用しています。注: 滅菌のバッファーは、室温で数ヶ月保存できます。 1% アガロースゲル顕微鏡 0.2% 溶液を準備 CTT (80 ml の TPM バッファーの 1 %ctt 培地 20 mL 寒天 1 g を混ぜて)。Agarose が溶融するまで電子レンジで加熱します。注: 0.2 %ctt はセル成長および飢餓を防ぐように十分です。顕微鏡の中で CTT の高濃度は、高いバック グラウンド蛍光になります。 (11.5 cm × 11.5 cm 角シャーレ、溶融 agarose の約 60 mL が必要です) の 0.5 cm の厚さに溶融の agarose が付いてペトリ皿を記入し、室温まで冷ます。注: agarose のパッドは 4 ° c 湿度の高い環境で 2 日間保存できます。 あらかじめ使用前に少なくとも 15 分の 32 ° C で 1% agarose/TPM/0.2% CTT パッドを温めます。注: 顕微鏡用細胞を準備するには、2.4 2.8 の手順に従います。 滅菌ガラス基板を配置 (60 mm × 22 mm、厚さ: 0.7 mm) 中間 (図 1A) に穴があるプラスチックや金属のフレームにこのフレームは薄い coverslip の機械サポートとして機能し、顕微鏡の中にドリフトを低減するのに役立ちます。フレームに coverslip をテープで固定します。 フレームを準備するには、1 mm の厚さの金属板から 75 mm × 25 mm のフレームをカットし、真ん中に、適切なサイズの穴 (20 mm × 30 mm この実験で) をカットします。 指数関数的に成長の 10-20 μ L を追加M. ザンサス、coverslip のセル。 マーカとして細胞またはコマ撮り録画で蛋白質の追跡を簡素化する細胞に蛍光の 0.5 μ m の微粒子を追加します。 TPM バッファー内微小球 1: 100 を希釈し、数ヶ月まで 4 ° C で保存します。使用する前に徹底的に振る、希薄化後の微粒子の 5-10 μ L をセルに追加します。注: ここで微小蛍光にあるすべての一般的な青、緑、黄色と赤蛍光チャネルが使用されました。 大きな予め温めておいた 1% agarose/TPM/0.2% CTT パッドの coverslip のサイズは約小さなパッドをカット、細胞 (図 1B) の上に置きます。蒸発を防ぐために、湿度の高い環境で細胞を維持するために 1% agarose/TPM/0.2% CTT agarose パッド上に coverslip を配置します。注: coverslip を単独では少なくとも 2 時間の重要な蒸発を防ぐ。コマ撮り録画もう 1% agarose/TPM/0.2% CTT のパッドと coverslip のサンドイッチは、蒸発を防ぐためにパラフィン フィルムでシーリングをします。 アガロース パッドの下部を付けるセルに 15 〜 20 分のための 32 ° C で顕微鏡サンプルをインキュベートします。微速度顕微鏡観察記録を開始します。 3. 顕微鏡のセットアップと時間経過の取得 注: ここで説明したプロトコル 100 X オート フォーカス機能付き広視野倒立顕微鏡用に開発された/1.30 NA 油 PH3 目的、X、Y 電動ステージ、sCMOS カメラ、光源、緑色蛍光用フィルター、赤い蛍光または黄色蛍光蛋白質および温度制御培養チャンバー。この室内は、一定温度、光から保護されているセルを保持します。 顕微鏡を開始する前に、インキュベーション室と 1 ~ 2 h の 32 ° C に顕微鏡を予熱します。注: 顕微鏡のセットアップによっては暖房が時間がかかります。予熱はドリフトの低減が不可欠ですし、オート フォーカス制御システムを安定します。 顕微鏡を切り替え、顕微鏡制御ソフトウェアを起動します。正しい目標を選択し、正しいミラーおよび取得フィルター相緑蛍光、蛍光、レッドまたは黄色蛍光タンパク質のイメージと同様にコントラストの画像。注: 顕微鏡は通常顕微鏡制御と画像の獲得のための好みのソフトウェアで提供されます。ここで市販のソフトウェアは、顕微鏡と画像集録を制御する使用された (材料の表を参照してください)。 目的の 32 ° C でプレインキュベートしたサンプルの下にレンズの上に高品質のイマージョン オイルの滴を追加します。サンプルは顕微鏡のステージに配置される場合、対物レンズの損傷を避けるために最も低い可能な Z 位置に目的を配置します。顕微鏡ステージ上にサンプル、目的に向かって「穴側」と金属フレームを配置します。ステージ ホルダーにサンプルを安全に固定します。 目標に近づく Z 方向にステージを移動することによって、細胞に焦点を当てます。オイルはサンプルの下側にしましたが、対物レンズを作る、遅い段階を移動接触。X でステージを移動/複数の単一セルまでの Y 方向は、ビューの領域で可視セルが焦点面で。取得した画像を後で調整するためにビューの領域は、その少なくとも 1 つの蛍光微粒子を確認します。注: 最適な条件でビュー (2,048 x 2,048 ピクセルまたは 133.1 x 133.1 μ m) の地域ごとの 15-30 セルの細胞密度を達成すべき。 顕微鏡に必要な場合に複数の波長とステージの位置の画像を取得することができる時間の経過実験を設定する顕微鏡制御ソフトウエアの多次元取得ウィザードを開きます。 [メイン] タブでは、タイムラプス複数の波長を有効にします。ウィンドウの左側にある追加のタブが表示されます。 タブの保存と取得した画像を保存するコンピューターのハード ドライブに空のフォルダーを選択するディレクトリの選択]をクリックします。連続データセットは、以前のものを上書きしないことを確認するファイルが存在する場合に基本名をインクリメントをアクティブにします。その後、実験日付と緊張の名前や実験のタイトルに名前を付けます。 コマ撮りのパラメーターを調整するタイムラプスタブをクリックします。期間は 24 時間に設定し、時間間隔を 20 分に設定します。時間ポイントの数が自動的に変更されます。注: 最適な時間間隔は、実験と分析対象とする細胞の機能に依存します。頻繁に画像関連の買収は、退色を引き起こす可能性があります。したがって、時間分解能と退色のトレードオフを経験的に見つけられなければなりません。4-6 h の倍加時間で取り込みが可能簡単に 5 分 (またはさらに小さい間隔必要な場合) の間隔で位相差顕微鏡の。24 h の時間経過とともに蛍光顕微鏡の画像は約 15-30 分の間隔で記録する必要がありますが必要なかどうか。 各時点で各画像の数を変更することによって取得する波長の波長タブをクリックを選択します。注: 各波長の新しいタブの左側に表示されます、多次元買収”ウィザードと波長を上から下への順序で取得されます。各波長取得設定を個別に変更できます。 上から最初の波長のタブをクリックします。照明のドロップ ダウン リストで位相コントラストを選択します。露出の 100 ms を選択し、取得のドロップ ダウン リストに毎回ポイントを選択します。ドロップ ダウン リストにしないを選択することで自動公開を無効にします。 ステップ 3.5.5 各時点で取得する必要があります各波長に対して繰り返します。実験のセットアップと蛍光に分類された蛋白質の説明ここでは、次のパラメーターを使用して露出: mCherry 融合蛋白質を 250 ms、YFP 融合蛋白質を 200 ms、GFP の融合蛋白質の 1,000 ms。注: ひずみおよび蛍光タンパク質ごとの最適な照明の設定は、ランプの強度と各波長の画像の取込時間を変更することによって事前に決定する必要があります。長すぎる画像集録時間は光毒性の効果を増加し、最終的に成長の逮捕や細胞の死に 。したがって、画像品質と細胞生存率のトレードオフを達成する必要があります。 同じ実験に記録されているセルの数を増やすの複数のステージ位置からの画像を取得します。 複数ステージ位置から画像を取得するには、[メイン] タブで複数ステージ位置をアクティブにします。[ステージ] タブをクリックし、ライブをクリックして、ビューのフィールドを見てください。 利益 (率 ROI) の領域は、ビューのフィールドまで、X ・ Y 方向のステージを移動します。保存、X 座標と Y 座標をクリックして、「+」ステージ] タブでステージを再度移動 X ・ Y 方向の新しい ROI が見つかるまで、座標保存もう一度「+」をクリックします。希望領域数が保存されるまで行きます。メモ: 蛍光画像の取得の場合、必ず関心 (ROIs) の領域ではないことに近すぎるお互いの光毒性を最小限に抑える。 セルに保存されている X-、Y-位置の違いをクリックしては、フォーカスと実験の過程で保存された Z 位置を一定に保つAFC を保持するをクリックしてハードウェアのオート フォーカスを開始するもう一度チェックしてください。 顕微鏡制御ソフトウエアの多次元取得ウィザードを取得をクリックして時間経過の録音を開始します。注: 1 つのウィンドウ表示されます各波長を取得して取得した時点で、次の画像を取得するまでの時間数が表示されます追加のウィンドウが表示されます。 画像の品質を最大化し、必要な場合に焦点を当てる時間経過の録音で最初の数時間ポイント後セルがフォーカスでまだであるを確認します。 4. コマ撮りムービーや画像の配置の生成 注: いくつかの商業およびフリーソフトのパッケージ、画像取得と画像解析のために利用できます。我々 は市販のソフトウェアを使用して (材料の表を参照) と複数の事前インストールされているプラグインと追加のツール。 画像解析/処理ソフトウェアがインストールされているコンピューターで時間経過の録音から個々 の画像を保存します。 ソフトウェアを起動し、スタックとしてレビュー多次元データをクリックして画像を開く |基本ファイルを選択 |ディレクトリを選択して。多次元データのフォルダーを開きます。データセットをチェックし、表示をクリックしてくださいデータセットは、時間から 1 つの画像が終了するまで 1 つをポイントとして表示されます。(スタックを作成する) の波長をアクティブに、ロードの画像をクリックしてスタックにするすべての画像を選択します。すべての波長にこの手順を繰り返し、完成したスタックを保存します。 (省略可能)ファイルを使用して映画に必要なすべてのイメージを開く |オープン。注: お勧め画像を開く 1 つ買収した波長によって時に計算能力が制限されている場合、コンピューターを遅くしません。時間経過の録音、例えば開始、最後に、またはいくつかの時間ポイントの特定の部分をスキップする必要がある場合、これは完成した映画で調整できます。 ドリフトを補正する必要があるイメージのスタックを有効にします。アプリで位置合わせツールを開く |. 配置を自動画像と参照平面として初めて平面のポイントのソースとしてチェックスタック。ソース スタック] ボタンでスタックを選択し、[適用] をクリックします。メモ: 自動配置されます、いくつかの時間や計算パワーですが顕微鏡のセットアップのドリフトのビッグ スタックを修正するための良い方法です。この自動アライメントは、微粒子が含まれますがそれらなしで動作可能性がありますも場合にも動作します。 アライメントのスタックを保存します。 ・ ロワを使用します。注: 蛍光タイムラプス顕微鏡は簡単に大きな計算能力の多くを取る、これらの映画の下流の処理が遅くなるデータ ファイルのセットを作成します。したがって強くお勧め・ ロワを識別し、小さいファイルで動作するようにセルを隔離します。 矩形ツールを選択します。位相コントラスト画像の ROI を手動で描画することによって興味のセルの周り ROI を作成します。興味のセルが表示されている、全体の時間経過映画を通してフォーカスであることを確認します。 同じデータセットの第 2 波長のコマ撮りムービーを開きます。位相コントラスト画像から蛍光に投資収益率を転送する第 2 波長の画像は、地域で転送領域ツールを使用して |領域を転送。ソース イメージとターゲット イメージとして第 2 波長データセットとして位相コントラスト データセットを選択します。すべての地域を選択し、 [ok]を押します。 ステップ 4.6.2 同じデータセットの取得各波長に対して繰り返します。 ROI を選択して編集でスタックとして複製 |重複 |スタック…か、 Shift + Ctrl + Dキーを押します。ファイルで重複したスタックを保存 |保存元のデータと同じフォルダーにします。 同じデータセットの取得すべての波長の各 ROI について手順 4.6.4 Mov 形式または AVI 形式でムービーを生成するスタック経由でムービーの作成関数を開く |映画を作る。ソース スタック] ボタンと時間経過の録音を選択します。出力フォーマット、フレーム レート、フレームの数を選択し、[保存] をクリックします。