In Situ Técnicas de hibridização para amostras de Coral adultas parafina
Summary
O objetivo do presente protocolo é executar hibridação in situ em amostras de coral adultas que foram incorporadas em parafina e seccionadas em lâminas de vidro. Este é um método qualitativo usado para visualizar a expressão espacial de uma sonda de anti-sentido RNA em tecidos de parafina.
Abstract
Os corais são invertebrados oceano importantes que são cruciais para a saúde geral do oceano, bem como a saúde humana. No entanto, devido a impactos humanos tais como o aumento das temperaturas do oceano e a acidificação dos oceanos, os corais são cada vez mais sob ameaça. Para enfrentar esses desafios, avanços na biologia celular e molecular provaram para ser crucial para o diagnóstico da saúde dos corais. Modificar algumas das técnicas usadas em medicina humana poderia melhorar consideravelmente a capacidade dos investigadores para tratar e salvar os corais. Para resolver isso, um protocolo para a hibridação in situ utilizada principalmente em medicina humana e biologia do desenvolvimento evolutiva foi adaptado para uso em adultos corais sob estresse.
A finalidade desse método é Visualizar a expressão espacial de uma sonda de RNA no tecido coral adulto que foi incorporado em parafina e seccionado em lâminas de vidro. Este método concentra-se na remoção da parafina e reidratação da amostra, pré-tratamento da amostra para garantir a permeabilidade da amostra, pré-hibridação de incubação, hibridização da sonda RNA e visualização da sonda RNA. Este é um método poderoso quando usando organismos não-modelo para descobrir onde genes específicos são expressos, e o protocolo pode ser facilmente adaptado para outros organismos não-modelo. No entanto, o método é limitado, em que é essencialmente qualitativa, porque a intensidade de expressão pode variar dependendo da quantidade de tempo utilizado durante a etapa de visualização e a concentração da sonda. Além disso, a paciência é necessária, como este protocolo pode levar até 5 dias (e em muitos casos, mais tempo) dependendo da sonda sendo usado. Finalmente, coloração de fundo específico é comum, mas essa limitação pode ser superada.
Introduction
Os corais são construtores de ecossistema crítico e importante para a biodiversidade no oceano e a saúde humana1,2,3. Eles estão sob ameaça devido à mudança climática e outros estressores antropogênicas, e muitas espécies de corais são considerados criticamente em perigo. Assim, há uma necessidade significativa de ferramentas celulares e moleculares diagnosticar os corais sob estresse. Além disso, lá é pouco compreendida sobre onde os genes são expressos dentro tecido coral adulto e, portanto, pouca compreensão das funções destes genes. Para resolver esse problema, nós adaptamos o protocolo hibridação (ISH) em situ , comumente usado em medicina humana e biologia do desenvolvimento evolutiva, para uso em amostras de tecido de parafina de corais adultos. Esta técnica é mais poderosa quando usado em corais adultos que foram submetidos a um evento estressante como a exposição ao stress de calor. No entanto, esta técnica pode ser usada em uma ampla gama de tecidos e estágios de vida em corais e não está limitada a apenas tensão térmica corais4,6,7. Além disso, esta técnica pode ser usada em tecidos ou células de qualquer metazoan enquanto há informações de sequência de cDNA disponível.
A finalidade desse método é a visualização de sondas de RNA dentro de tecido coral adulto que foi preservada e incorporado em parafina e seccionados em slides. Este método é uma poderosa ferramenta de diagnóstico que permite a visualização dos ácidos nucleicos dentro de tecido coral adulto. Este método foi desenvolvido inicialmente para o diagnóstico médico, e ele se tornou uma ferramenta popular em campos como a biologia do desenvolvimento e biologia evolutiva do desenvolvimento8,9,10. ISH é também um método crítico, particularmente em sistemas não-modelo, quando genômica e dados de sequência de transcriptomic estão disponíveis, mas padrões de expressão de gene espaciais são desconhecidos. Para o trabalho de diagnóstico em sistemas não-modelo, essa técnica é poderosa porque pode indicar quais as células e tecidos expressam um gene de interesse e podem levar a mais abordagens terapêuticas alvo8,9,10, 11,12. Por último, esta técnica é qualitativa e mais poderoso quando combinado com a expressão de gene quantitativa dados11.
A abordagem descrita neste documento será de interesse para os investigadores que já projetou uma Digoxigenina (DIG)-rotulado sonda RNA (tanto o sentido e antisentido sondas) e estão agora prontos para realizar a hibridação in situ das sondas para uma amostra. Para executar este método, duas seções seriais de um tecido de parafina coral serão necessários para cada sonda sendo testada. Uma seção será usada para a sonda de sentido e o outro para a sonda antisentida. A sonda de sentido será um controle para indicar a ligação não-específica. Se a coloração é observada na sonda de sentido, então, a sonda antisentida não é específica para o RNA de interesse. Sondas podem ser projetadas para qualquer gene expressada. Neste protocolo, são usados vários exemplos que anteriormente foram encontrados para ser expressa durante o stress de calor em corais: homólogo B (Fos-B), proteína ativador (AP1), do oncogene viral do osteossarcoma murino de Fernandes e fator de necrose tumoral receptor 41 (41 TNFR)11. ISH usando sondas de RNA escavar-etiquetadas é preferível usando sondas radioactivas porque sua manipulação é muito mais seguro,10. Além disso, esta técnica é altamente sensível e pode ser executada em uma ampla gama de tecidos e embriões além da tensão térmica corais adultos13,14,15,16.
Protocol
Representative Results
Discussion
O método descrito neste protocolo foi modificado do trabalho anterior em médicos e evolutiva do desenvolvimento pesquisa8,9,10,12,17. Este protocolo incide sobre as nuances de uma hibridação in situ com uma sonda de anti-sentido RNA escavar-etiquetadas em corais adultos, que foram preservados e incorporados em parafina. Esse método pode ser facil…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Este trabalho foi financiado pelo prêmio nenhum. OCE-1323652 através da no.1012629 nacional Science Foundation oceano ciência Postdoctoral Fellowship e prêmio da Burroughs Wellcome fundo pós-doutorado programa de enriquecimento.
Materials
| Denhardt's solution | Affymetrix | 70468 50 ML | |
| Bioworld Alkaline phosphatase buffer | Fisher | 50-198-724 | |
| Slide mailers | Fisher | 12-587-17B | |
| Bioworld Alkaline phosphatase buffer | Fisher | 50-198-724 | |
| 50 mL Falcon tubes | Fisher | 14-959-49A | |
| UltraPure Salmon Sperm DNA solution | Invitrogen | 15632-011 | |
| PBS – Phosphate-Buffered Saline (10X) pH 7.4 | Invitrogen | AM9625 | |
| UltraPure DNase/RNase-Free Distilled Water, 10 x 500 mL | Invitrogen | 10977-023 | |
| UltraPure DNase/RNase-Free Distilled Water, 10 x 500 mL | Invitrogen | 10977-023 | |
| UltraPure Salmon Sperm DNA solution | Invitrogen | 15632-011 | |
| Slide white apex superior adhesive | Leica Biosystems | 3800080 | |
| PBS solution, pH 7.4 | Life Technologies | 10010072 | |
| Proteinase K, Molecular Grade, 2 mL | New England Biolabs | P8107S | |
| Super Pap Pen Liquid Blocker | Promega | 22309 | |
| DIG Anti-Digoxigenin-AP Fab fragments | Roche | 11093274910 | |
| BM Purple, 100 mL | Roche | 11442074001 | |
| DIG Wash and Block Buffer Set | Roche | 11585762001 | |
| NBT/BCIP | Roche | 11681451001 | |
| Formaldehyde solution, 500 mL size | Sigma-Aldrich | 252549-500ML | |
| SSC Buffer 20X concentration | Sigma-Aldrich | S6639-1L | |
| Acetic Anhydride | Sigma-Aldrich | 320102-100ML | |
| Formamide | Sigma-Aldrich | 47670-250ML-F | |
| Triethanolamine | Sigma-Aldrich | 90279-100ML | |
| Heparin sodium salt from porcine intestinal mucosa | Sigma-Aldrich | H3149-10KU | |
| Xylenes, AR (ACS), For Histological Use | VWR | MK866806 | |
| Ethanol | VWR | EM-EX0276-4S | |
| TE buffer | VWR | PAV6232 | |
| hybridization oven | VWR | 97005-252, 97005-254 | |
| Orbital shaker | VWR | 89032-088 |
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