JoVE Journal > Neuroscience
Summary
Abstract
Introduction
Protocol
Results
Discussion
Disclosures
Acknowledgements
Materials
References
русский

Automatically Generated
Please note that all translations are automatically generated. Click here for the English version.
Neuroscience

Методы для обнаружения новых соединений, модулирует гамма - аминомасляная кислота рецепторов типа синапсах

Published: August 16, 2018
doi:
10.3791/57842
, ,
1Discovery Neuroscience, Pharma Research and Early Development,Roche Innovation Center Basel, 2HiQScreen Sàrl 6

Summary

Здесь мы представляем протоколы обнаружить соединений, активных на рецепторы ГАМКA , от привязки к физиологии и фармакологии.

Abstract

Эта рукопись представляет пошаговые протокол для проверки соединений на гамма аминомасляной кислоты типа рецепторов (ГАМКA) и его использование на выявление новых молекул в доклинических анализов из рекомбинантных в пробирке рецептор к их фармакологических эффектов на родной рецепторов в ломтики грызунов мозга. Для соединений привязки на сайте бензодиазепиновых рецепторов первым шагом является настройка основной экран, который состоит из разработки лиганд привязки анализов на клеточные мембраны, выражая основных подтипов ГАМКA . Затем воспользовавшись экспрессии гетерологичных рецепторов ГАМКA грызунов и человека в Xenopus Ооциты или ГЭС 293 клетки, это возможно для изучения, электрофизиологическое анализов, физиологические свойства различных рецепторов подтипы и фармакологические свойства определенных соединений. Система ооцитов Xenopus будут представлены здесь, начиная с изоляцией ооцитов и их микроинъекции с различных мРНК, до фармакологическая характеристика с помощью двух электродом напряжения зажимы. Наконец в грызунов мозга фрагменты записи будут описаны которые используются в качестве вторичного физиологических тестов для оценки активности молекул в их родной рецепторов в четко определенных нейронов цепи. Внеклеточные записи с помощью реакции населения несколько нейронов продемонстрировал наряду с применением наркотиков.

Introduction

Здесь мы представляем протоколы для открытия активных соединений в ГАМК-А рецепторов, от привязки к физиологии и фармакологии. В поисках Роман молекулами специфически для ГАМК-А рецепторов, это важно определить, как можно точнее, подтип интерес и оценки специфика вновь установленных соединений (например, для обзора, см. Рудольф и Knoflach1или2Sieghart). Типичный путь в лекарственных препаратах и шаги, которые должны быть достигнуты показанного на рисунке 1.

Связывание анализов были и по-прежнему используются в качестве первого шага в лекарственных препаратах. В случае ГАМК-А рецепторов они оптимизированы для выявления соединений, привязанные к сайт связывания бензодиазепинов рецептора, где привязать терапевтически полезные и безопасных препаратов. Другие методы, с помощью флуориметрический изображений пластины читателя (FLIPR) мембраны потенциальных красный краситель на основе анализов3, обнаружить соединений как барбитураты, привязанные к дополнительные сайты, которые являются менее желательным ввиду их нежелательных профиль побочного эффекта. Кроме того используются красители непосредственно могут активировать ГАМК-А рецепторов, таким образом под сомнение полезность этих анализов для наркотиков discovery4. Обязательные анализы только может предоставить доказательства того, что данного соединения можно привязать к специфическим рецептором класса. В пробирке анализов с клеточных мембран используются для идентификации селективного человека ГАМКA α5β3γ2 рецепторов лиганды. Временно transfected клеток HEK293, выражая человеческие ГАМКA α5β3γ2, α1β3γ2, α2β3γ2 и α3β3γ2 рецепторов используются для подготовки мембраны для этих анализов. Эффект лигандами обнаруживается путем измерения сцинтилляционные [3H] флумазенил привязан к мембранных рецепторов (торможение [3H] флумазенил привязки). Основным преимуществом этого метода является, что быстрое и эффективное определение комплекса-сродство на рецептор интерес предоставляется на рецептор интерес.

Функциональные исследования необходимы для оценки функциональной активности соединений и предложить физиологические и фармакологические объяснение механизмов, вызванные привязка соединений на рецепторы. В настоящее время широко признается, что функциональные рецепторы ГАМКA результатом Ассамблеи пять подразделений вокруг оси pseudosymmetry, образованный ионных поры и результат от Ассамблеи пять одинаковых субъединиц. Большая часть рецепторов ГАМКA состоят из двух или более различных подразделений. Основных мозга ГАМК-А рецепторов, например, состоит из α1, β2 и γ2 субблоки в стехиометрии 2, 2 и 1 соответственно5,6. Воссоздание в хост-системе как Xenopus Ооциты или HEK293 клетки дает возможность быстро изучение фармакологических свойств рецепторов.

Фармакологические свойства соединений затем изучаются с внеклеточного записей в мозг ломтики7. Этот метод позволяет исследовать влияние соединений на синапсах и обеспечивает эффективный способ подтверждения функционального воздействия соединений определяется в системах гетерологичных выражения на уровне родного рецепторов в общем нейрональных окружающей среды. ГАМК синапсах могут также быть оценены на молекулярном уровне измерения воздействия соединений на тормозной постсинаптический токов (IPSCs)8. Однако протокол используется здесь и на основе записи зажим поклеточного патч в срезах головного мозга является более подробно и дает меньше пропускной способности.

Наконец сильные и слабые стороны в пробирке скрининга Каскад, используется для идентификации α5β3γ2-селективные лигандов обсуждаются в перспективе различных методов и их внутренние ограничения. Эта работа должна предоставить экспертов и не экспертов в области рецепторов ГАМКA полезный обзор комбинации различных в vitro подходы используются для решения обнаружения новых модуляторы этих лиганд закрытый ионных каналов.

Protocol

Xenopus laevis размещены и обрабатываются согласно директивам животных кантона Женева. 1. лиганд привязки Подготовка анализа пластины Приготовить 1,5 Л аналитического буфера с 5 мм KCl, CaCl 1,25 мм2, 1,25 мм MgCl2120-мм NaCl и 15 мм трис; Отрегулируйте пэ-аш с HCl 7.4. Подготовьте соединений для испытания на 50.76 мкм (например, 5 мкл, комплекса на 10 мм в 980 мкл аналитического буфера в пробки microcentrifuge). Смешайте их хорошо с помощью вихревого машины высокой скоростью для 2-5 s. Подготовка предварительного разбавления составные флумазенил ссылки путем дозирования 1 мкл, комплекса (10 мм) 1 970 мкл аналитического буфера. Смешайте их хорошо с помощью вихревого машины высокой скоростью для 2-5 s. Разбавить [3H] флумазенил Стоковый раствор с assay buffer 4 ° C до 4 Нм в 50 мл полипропиленовые трубы. Пипеткой 50 мкл/ну аналитического буфера в колонках 1 и 3 – 11 из 96-луночных микропланшетов как показано в структуре плиты, представлены на рисунке 2. Пипетка 73,2 мкл соединений, разбавляют в 50.76 мкм (см. шаг 1.1.2) в колонке 12 пластины. Разбавить каждое соединение, с помощью геометрической прогрессии через 9 шагов (1E-10 -1E–06 M), с 23.12 объем передачи мкл и заполнения колонки 3 – 11. Тщательно перемешать разрежения. Измените наконечник после каждого разрежения. Разбавить клеточных мембран Оттепель клеточных мембран, ранее изолированных от HEK293 избытком человека рецептор ГАМКA (0,025 – 0,15 мг/мл) для получения 80 мл при комнатной температуре (RT) и передачи подвеска пробирного буфер при 4 ° C. Ресуспензируйте мембраны решение еще на 4 ° C с ткани гомогенизатор для s 30 – 40 на 10 000 – 12 000 об/мин. Разбавить диазепама для элемента привязки неспецифические (NSB) Разбавьте Стоковый раствор диазепама 4 мм с Пробирной буфера к концентрации 40 мкм в 5 мл. Начало реакции Пипетка 50 мкл 4 Нм [3H] флумазенил в каждой скважине 96-луночных пластины и сохранить его в контейнере ледяной воды. 100 мкл подготовки мембраны подтип рецепторов ГАМКA иметь концентрацию белка 0.5 мг/мл. Пипетка 50 мкл 40 мкм диазепама в колонке 2. Инкубируйте пластину за 1 час на льду. Добавьте 50 мкл аналитического буфера в каждой скважине 96-луночных фильтра плиты для последующих мембранного разделения и измерения радиоактивности и остановить реакции позже. Остановить реакции Подготовьте Отмывающий буфер с 50 мм трис-HCl, рН 7,4. Фильтр решения с помощью комбайн 96-луночных клеток. Вымойте пластину 3 x с 300 мкл ледяной Отмывающий буфер в колодец. Печать в нижней части пластины с пластиковой пленкой и 40 мкл сцинтилляционные коктейль для жидких сцинтилляция подсчитывая каждый хорошо и протрите его с этанол 70%. Осторожно встряхните пластину для по крайней мере 1 час на RT. Пусть он стоять по крайней мере еще час на RT. Измерения радиоактивности (в CPM), поместив пластину на сцинтилляционный счетчик. Разрешить измерение 3 мин в колодец. Анализ данных Определите, что означает для 8 реплицирует из неспецифических привязки (NSB) и общий (ТБ) также как дубликаты или triplicates образцов. Вычислите % конкретной привязки (SB) для среднего значения каждого образца по следующему уравнению:Здесь,Общая SB = среднее Тбайт минус означает НСБ. Участок в абсциссе % SB против в координации концентрации ингибитора. Соответствуют данные, с помощью одного сайта конкуренции анализ уравнения:Здесь,y = % SB,A = минимальная y,B = максимальная y,C = IC-50,X = журнал10 концентрации конкурирующих комплекса,D = наклон кривой (коэффициент Хилл). Рассчитать сродство (Ki) с помощью половины максимальной тормозной концентрации (IC50), Константа диссоциации (Kd) [3H] флумазенил на соответствующих мембраны9и концентрация [3H] флумазенил в assay по следующему уравнению данных с помощью: 2. рецептор выражение и записи в Xenopus ооцитов Яичники уборка и подготовка ооцитов Подготовить стерильный раствор Барт с 88-мм NaCl, 1 мм KCl, 2,4 мм NaHCO3, 10 мм HEPES, 0,82 мм MgSO4.7H2O, 0,33 мм Ca (№3)2.4H2O и 0,41 мм CaCl2.6H2O, рН 7,4 , дополняется 100 единицы/мл пенициллин, стрептомицин 100 мкг/мл и 0,25 мкг/мл Амфотерицин б. Подготовьте 1 средний x OR2 (не CaCl2) 88.5 мм NaCl, 2,5 мм KCl, 1 мм MgCl2.6H2O, рН 7,4 мм HEPES, 5. Жертва Xenopus Laevis женщин, глубокий наркоз для 20 мин в охлаждении Метансульфонат Tricaine (при концентрации 150 мг/Л, отрегулированного на рН 7,4) и бикарбонат натрия (300 мг/Л) следуют обезглавливание. Урожай яичников быстро с чистой ножницы, пинцет и поместите их в чашках Петри 2 (10 см) заполнены с 40 мл 1 x Барт решения и антибиотики/противогрибковое. Магазин-отделить яичников на срок до 2 недель в растворе Барт на 4 ° C. Для диссоциации, вырезать яичников с чистым лезвием в мелких фракций (1 – 2 см3) и инкубировать их в 50 мл OR2 среды без CaCl2 (OR2-noCaCl2) содержащий коллагеназы 0,2% (тип I) в 17 — 19 ° C в spinner 100 мл Колба с медленным агитации за 4-5 ч. Убедитесь, что магнитный бар размещены примерно 3-5 см выше нижней части счетчика колбу чтобы избежать дробления яйцеклетки. После 4-5 ч, убедитесь, что большая часть яйцеклеток освобождаются от их фолликула (т.е., они плавают вокруг индивидуально). Мыть их 5 x 200 мл OR2 дополнена 1,8 мм CaCl2. Передача defolliculated ооцитов Петри (10 см) заполнены Барт решения и антибиотики/противогрибковые и держать их по крайней мере на ночь на 17 ° C перед инъекцией mRNA или cDNA. На следующий день, выбрать, под бинокль, здоровые яйцеклетки, представляя четкие и различных животных против полюса растительный (темно-коричневый для животных полюс против светло-желтый для растительных полюса). Использование чистой пипетки Пастера и распоряжаться яйцеклетки по одному в стерильных конические хорошо плиту 96-инъекции.Примечание: Без специального ухода необходимо для размещения яйцеклеток для инъекции мРНК; принимая во внимание, что для инъекции cDNA, необходимо ориентировать яйцеклеток с полюсом вверх животных. mRNA или cDNA Автоматический впрыск Синтез мРНК, использование коммерчески доступных комплект инструкций рекомендуемой. Чистые инструменты и таблицу с РНКазы и носить соответствующие защитные перчатки.Примечание: Качество мРНК определитель приносить хорошее выражение, и это необходимо для предотвращения деградации мРНК во время процедуры инъекции. Подготовить cDNAs использование коммерчески доступных комплект и растворить необходимое количество в бидистиллированной воде в концентрации 0,2 мкг/мкл. Придать 10 – 50 nL мРНК раствора в концентрации 0,2 мкг/мкл, или 10 nL cDNA раствора в концентрации от 0,02-0,2 мкг/мкл, предпочтительно в пакетах 95 яйцеклеток. Для мембранных белков, требующих несколько подразделений (т.е., heteromeric α1β2γ2 ГАМК-А рецепторов), смесь соответствующей мРНК или cDNAs желаемого соотношения (например, 1:1:1 или 1:10:1). Держите яйцеклетки в 17 ° C для предотвращения экспрессию белков теплового шока, ооциты; Храните микроплиты в области хранения, термо контролем. Распустить тест соединения, которые были положительный результат в assay привязки в OR2 0.1-1000 мкм для электрофизиологических записей и утилизируйте их покинуть в полипропиленовые плиту 96-луночных плоское дно. Плазмиды для выражения Следуйте инструкции коммерчески доступных наборов для синтеза мРНК с бактериальной T7 или T6 промоторов и сделать 20 мкл раствора на 0,2 мкг/мкл в РНКазы свободной воды. Подготовка по меньшей мере 20 мкл раствора, содержащего эукариоты вектора выражения для выражения cDNA, обычно на 0,2 мкг/мкл, растворенного в бидистиллированной воде. Микроинъекции в яйцеклетку и визуализации ее качества Придать 10 – 50 nL раствора, содержащего плазмида (см. шаг 2.3.1 и 2.3.2) с использованием стекла микро Инъекционная игла с кончика диаметре до 100 мкм монтируется на микроманипулятор, оборудованных с системой выброса давления или систему автоматизированной впрыска.Примечание: В примере, рассмотренном здесь, ооциты вводят партиями 95 с автоматизированной системой подходит для использования с mRNA или cDNA. Заполните инъекционной иглы с 1 мкл концентрированного красителя как метиленовый синий на 1% и вставляют ооцитов, с использованием стандартной процедуры (или в ядре для cDNA в цитоплазме мРНК). Распоряжаться вводят ооциты около 1 мин в кипящей воде. Пополам яйцеклеток с лезвием бритвы под бинокль.Примечание: Краска остается локализованных, как показано на рисунке 3E, позволяя точные наблюдения инъекции. Двух электродом напряжения зажим записи Место хорошо пластины, содержащих яйцеклеток в автоматизированной системе, которая использует принцип иллюстрируется на рисунке 4.Примечание: В отличие от системы зажима патч, показано на рисунке 5, истинный мембранного потенциала клеток читается электродом напряжения. Программа системы автоматической записи, используя значок-интерфейс с, например, схемы, показано на рисунке 6 для определения концентрации деятельности отношения. Кривой Анализировать результаты с помощью соответствующего программного обеспечения, с помощью кривой активации иллюстрированный концентрации, участок амплитуда тока как функция логарифма агонист концентрации. Соблюдайте сигмоид кривой, которая впоследствии может быть оснащен эмпирическое уравнение Хилл в форме:Здесь,Y= фракции вызвала ток,EC 50 = концентрация для активации 50%,x = концентрация комплекса,nH = коэффициент Хилл или очевидной кооперативности. Нормализовать течений к единству, разделив амплитуда каждого ответа против значения записаны в самую высокую концентрацию для анализа данных, полученных от ряда ячеек. Определить средний и стандартные ошибки и осознать кривой с использованием стандартно доступного программного обеспечения. 3. Электрофизиологические записи в срезах головного мозга Примечание: Гиппокампа крысы фрагментов готовятся в соответствии с руководящими принципами национальных и институциональных. Подготовка фрагментов гиппокампа Подготовить рассечение искусственных церебрально спинномозговой жидкости (dACSF) с 124 мм NaCl 124, 2,5 мм KCl, 1,25 мм х2PO4, 2 мм MgSO4.7H2O, 2,5 мм CaCl2 2 H2O, 26 мм NaHCO3, глюкоза 10 мм и 4 мм сахароза, загазованность в бутылке с смесь 95% O2 и 5% CO2. Подготовка записи искусственных церебрально спинномозговой жидкости (rACSF) с 124 мм NaCl, 5 мм KCl, 1,25 мм х2PO4, 2 мм MgSO4.7H2O, 2,5 мм CaCl2 2 H2O, 25 мм NaHCO3и 10 мм глюкозы загазованность в бутылке с смесь 95% O2 и 5% CO2. Анестезировать крыс с помощью смеси 2,5% изофлюрановая и чистый кислород и обезглавить их. Вырежьте головы после средней линии с тонкой пара ножниц. Вырежьте череп вдоль средней линии без повреждения основной ткани. Удаление черепа с помощью пинцета и лопаточкой штраф зачерпнуть из мозга. Мозг в газированные dACSF раствора в RT и вскрыть левой гиппокампа формирования тонкой шпателем. Поперечные срезы (толщиной 400 мкм) из средней части гиппокампа разрезаемых тканей измельчитель и передавать их записи камеры с использованием кисти живописи. Поддерживать фрагменты в РТ по 45 мин. Perfuse ломтики с газированные rACSF на 35 ° C и в размере 1,5 мл/мин пузыря решение с смесь 95% O2 и 5% CO2.Примечание: После этого шага, ломтики готовы для электрофизиологических экспериментов. Запись одной популяции Спайк Поместите кусочек мозга в Микроскоп монтируется камера. Perfuse фрагмента в размере 3 мл/мин с rACSF. Вытяните микропипеткой боросиликатного стекла с пипеткой съемник, имея сопротивление ~ 2 MΩ.Примечание: Этот микропипеткой используется как запись электрода и электрически подключен к усилителю. Залейте раствор, содержащий 2 М NaCl микропипеткой и поместите его в пипетку держатель усилителя. Положение записи микропипеткой в слой pyramidale в регионе СА1 гиппокампа фрагмента, используя правильный микроманипулятор.Примечание: Расположение схематично представлена на рисунке 7. Место изолированные биполярного платины/Иридиум электрода в держатель на левой микроманипулятор.Примечание: Этот электрод используется как электрод стимуляции и электрически подключен к генератору стимул. Положение электродов стимуляции в Шаффер залогов в регионе СА1 гиппокампа фрагмента, используя правильный микроманипулятор.Примечание: Расположение схематично представлена на рисунке 7. Доставить импульс тока электрод стимуляции с помощью генератора стимул каждые 30 s (100 МКС длительностей, начиная 10 МКА) и постепенно увеличивать численность стимуляции, до тех пор, пока население всплеск (PS) появляется. Отрегулируйте стимул силы вызывают Л.С. соответствует 45% максимальной амплитуды, которые могут быть получены. PSs фильтруются на 2.4 кГц и оцифрованных на 20 кГц с использованием сигнала усилителя. Ингибирование паре пульс Подготовить срезы мозга (шаг 3.1) и действуйте, как описано ранее (шаги 3.2.1–3.2.7). Доставить двух импульсов тока (100 МКС длительности с интервалом 20 мс) электрод стимуляции каждые 30 сек с использованием генератора стимул. Установите стимул силы вызывают Л.С. соответствует 45% максимальной амплитуды. Соединения испытания Сделать разведений соединений должны быть опробованы в газированные фаго так что конечная концентрация ДМСО не выше, чем 0,1%. Решение управления на такой же концентрации, чем в составные решения добавьте ДМСО. Запись сингла (шаг 3.2) или парные пульс (шаг 3.3) PS вызываемые Шаффер залога стимуляцию каждые 30 s для по крайней мере 30 минут. В этот период базовой PS формы должны быть стабильными. Подготовьте стакан с rACSF газированные, содержащие фиксированные концентрации комплекса для проверки. Perfuse гиппокампа фрагмента с помощью этого решения пока еще записи одного или паре пульс PS. Оцените восстановления от составного действия, perfusing фрагмент газированные rACSF без соединения.Примечание: Для обратимых эффектов, PS возвращается к его первоначальной формы, наблюдается в базовый период до составного приложения. Анализ данных Средняя PS следы записан во время эксперимента в блоках по 4, используя программное обеспечение для анализа данных. Измерение амплитуды PS усредненной следов. Нормализация амплитуд в процентах от значения базовые записала 10 мин до perfusing соединение. Экспресс данных означает ± SEM.

Representative Results

Привязки:Assay в пробирке с клеточными мембранами с используется для идентификации селективного человека ГАМКA α5β3γ2 рецепторов лиганды привязки на аллостерический сайте BZD γ2 содержащие рецепторов. Временно transfected клеток HEK293, выражая человеческие ГАМКA α5β3γ2, α1β3γ2, α2β3γ2 и α3β3γ2 рецепторов используются для мембран для этот assay. Влияние потенциальных лигандов обнаруживается путем измерения сцинтилляционные [3H] флумазенил привязан к мембранных рецепторов (торможение [3H] флумазенил привязки). Кривые перемещения привязки создаются затем оценить избирательность соединения для конкретных рецепторов ГАМКA как в примере с RO4938581 (рис. 8). Рисунок 9 кратко профиль нескольких соединений ссылки включая α5 селективный ГАМКA негативные аллостерический модулятор рецепторов, RO49385819, которые были созданы с помощью привязки assay. Записи в Xenopus яйцеклеток:Экспрессию рецепторов ГАМКA такие α5β3γ2 heteromer дает надежные течений в ответ на воздействие ГАМК. Типичный напряжение зажим записи получены яйцеклетки, выражая человека α5β3γ2 в ответ на краткий ГАМК импульсов (30 s) диапазоне до 300 мкм показанный на рисунке 6. В этом эксперименте были реализованы различные концентрации ГАМК в пластину 96-луночных и ответы были вызывали путем перемещения ячейку в конкретной хорошо. ГАМК тщательно промывают, возвращения ячейку в зале Центральной перфузии и применяя перфузии решение управления, активировав соответствующий Перистальтический насос. Программы последовательность, используемая для определения кривой концентрации активации проиллюстрирован на рисунке 6A. Проведено полностью автоматически, эти данные показывают, как качество записи, которые могут быть получены в Xenopus ооцитов и высокий уровень экспрессии рецепторов получены через несколько дней после инъекции мРНК. Эксперименты на различных рецепторов комбинаций, принести серию EC50s, который является концентрация необходимо активировать половина рецепторов ГАМК. Участок в ЕС50значений на графике паука, такие, как показано на рисунке 10, обеспечивает быстрое сравнение свойств рецепторов и влияние состава субъединицы. Изучить влияние положительное или отрицательное аллостерический модулятор (NAM или PAM), необходимо сравнить реакции, вызываемые агонистов (ГАМК) тестовый импульс, сначала в элементе управления и затем в присутствии модулятора. Эффективный экспериментальный протокол провести такой эксперимент иллюстрируется на рисунке 11. Сначала определяется ответ клетки на ссылку концентрации ГАМК и последовательность повторяется, применяя такой же концентрации ГАМК, а затем Сопредседатель приложением ГАМК плюс модулятора. Участок накладывается двух ответов показывает в этом примере Помечено Ингибирование, вызванной наличием модулятора. Количественное определение объема модулятор эффект легко получается путем вычисления отношение ответ вызвал в присутствии модулятор против управления и результаты, можно изобразить в виде тепла сюжет. Данные, показанные на рисунке 12 иллюстрируют тепла участок, соответствующий записи трех наборов данных, полученных для 96 соединений. После идентификации соединений, которые достаточно активны часто бывает необходимо оценить, если эти молекулы являются активными в другие комбинации рецепторов. В случае рецептором ГАМКA было выявлено 19 генов, кодирующих для различных подразделений, и известно, что функциональные рецептор может быть результатом multimeric Ассамблеи различных подразделений (см. Knoflach, Эрнандес и Бертран10 Обзор). Хотя несколько подразделений и комбинации доходность огромный репертуар рецептора подтипы, которые может потребоваться большое количество счетчиков проверки выполняться, часто можно сосредоточить внимание сначала на наиболее распространенных подтип, который, в случае ГАМКA рецепторов, α1β2γ2 состав. Эксперименты, голова к голове с выражением, например, α5β3γ2 и α1β2γ2 в том же пакете яйцеклетки дают хорошее сравнение соответствующих последствий данной молекулы. Типичные результаты, полученные в три ячейки для α5β3γ2 и α1β2γ2 приведены на рис. 13, который иллюстрирует преференциальных положительные модуляции одной молекулы на α5β3γ2. Экспериментальный протокол, показано на рисунке 11 хорошо подходит для характеристики PAM активности. В этом протоколе соединение, которое испытывается совместно прикладной с агониста на постепенное увеличение концентрации. Чтобы избежать возможные кумулятивные последствия, вызванные несколькими приложениями на той же ячейке, новые и наивно клеток измеряется для каждой точки данных. Измерение амплитуды ответ записанный с агонистом только и затем в ходе составного приложения дает коэффициент, который количественно эффект PAM или дн. Типичные результаты, полученные на α1β2γ2 и α5β3γ2 для диазепама показаны на рисунке 14, раскрывая очевидной чувствительность α5β3γ2, приблизительно в 10 раз выше на этот рецептор комбинации. Эти значения находятся в хорошей корреляции с11опубликованных данных. Как считается, что сайт бензодиазепинов является интерфейсом между γ2 и ее смежных α-Субблок12-14, чувствительность α5β3γ2 предполагает льготные диазепама сродство для γ2-α5 над γ2-α1. Возможность выразить комбинации различных рецепторов, в сочетании с эффективной функциональных характеристик открывает несколько способов изучения детерминант PAM свойств и их последствий для физиологических и фармакологические эффекты. Гиппокампа мозга фрагментов:Для подтверждения фармакологических профиль соединений, выявленных в в vitro анализов в родной рецепторные модели проводятся эксперименты с кусочками гиппокампа мозга крысы. Преобладающим подтипы рецепторов ГАМКA , выражена в пирамидальных клеток гиппокампа, α1β2/3γ2, α2β2/3γ2 и α5β2/3γ2, которые модулируются бензодиазепина (BDZs)15. В паре пульс ингибирование представляет собой парадигму, можно выявить гиппокампа цепи возбудимости тестирования изменений в ответ второй из двух спаренных электрические раздражителей, доставлены 20 мс друг от друга. Второй ответ меняется благодаря ГАМК Отзывы интернейронов иннервирующих слой пирамидальной клетке16-18. Как показано на рисунке 7, положения в области управления, второй ответ двух спаренных раздражителей тормозится вследствие ингибирования ГАМК. Когда это торможение уменьшается perfusing срез с β-СКК, неселективной ДН, второй ответ двух спаренных раздражителей тормозится в гораздо меньшей степени. Эта экспериментальная парадигма чувствителен к выборочной рецептор ГАМКA , содержащий субъединица α5 соединений. Рисунок 1 : Скрининг стратегия. Типичная наркотиков скрининг путь начинается с высокопроизводительного скрининга, в котором большие библиотеки соединений проверяются для конкретной цели. После определения ведущего кандидата начинается работа фармацевтическая химия. Во время этой фазы, химиков будет изучать и совершенствовать молекулы, выполняя структурной модификации для удовлетворения желаемого критерии, такие как целевой избирательности, мозга пенетрантностью, стабильность, деградации и т.д. при этом решающую фазу, важно для оценки ли химические модификации не изменены свойства молекулы и уточнения для лучшего кандидата. Следующий шаг заключается в выявлении несколько перспективных соединений и привести их к выполнению следующих шагов, которые включают безопасность, терпимость, и т.д. Примечание что электрофизиологии указывается как функционального анализа но другие методы, включая кальция флуоресценции анализов или напряжения чувствительных красители, может использоваться как альтернативы. Эти последние методы также используются в высокопроизводительных анализы как замена для привязки анализов. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы посмотреть большую версию этой фигуры. Рисунок 2 : Макет 96-луночных покрытием используются для привязки экспериментов. Колонка 1 используется для измерения всего привязки и столбец 2 для неспецифической привязки измерений. Строки A – H заполнены с 4 различных соединений в повышении концентрации (колонки 3 – 12), каждое соединение в дубликаты (т.е., составные 1 строки A и E, составные 2 рядами B и F, и т.д.) представлена в макете с разными цветами. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы посмотреть большую версию этой фигуры. Рисунок 3 : С помощью автоматизированной системы микроинъекции. (A) A точный XYZ системы, в которой Стеклянный иглу, заполненных жидкостью, содержащей плазмиду интереса, автоматически ткнул в яйцеклеток. (B) Эта группа показывает 96-луночных конические нижнюю пластину, в которой (C) автоматически вводятся яйцеклеток. (D) Эта группа иллюстрирует принцип инъекции. Для ядерной инъекций игла проникает ооцитов, немного глубже, чем ядро, как показано на панели B. Затем, игла изымается из ядра (см. панель C) до инъекции (см. Группа D). (E), чтобы оценить качество инъекции, игла может быть заполнена с красителем и «приготовленные» яйцеклеток может разрезать пополам. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы посмотреть большую версию этой фигуры. Рисунок 4 : Автоматизированных принцип двух мембраной электрода. Принцип основан на перемещении подготовки между скважинами, вместо того, чтобы применение жидкости в перфузии. (A) в левой части панели представляет собой механизм, позволяющий запись в Xenopus ооцитов с двумя электродами и малой корзины, которая будет поддерживать жидкие капли вокруг подготовки во время движения от одного образца в другой. Картину ооцитов, помещены в корзину с двумя электродами показано на правой стороне. (B) Эта группа показывает схематическое представление электрофизиологии «вверх ногами», принцип регистрации. (C) Эта группа показывает ооцитов, составные пластины и стирки станции на записи таблицы. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы посмотреть большую версию этой фигуры. Рисунок 5 : Два электрод мембраной записи против фиксации. Типичный двухэлектродное мембраной запись для ооцитов (левая панель) сравнивается с патч зажим конфигурации используется для строки ячейки (правая панель). Обратите внимание на разницу в размерах между ооциты, находящиеся около 1 мм в диаметре по сравнению с клетки, которые находятся около 20 мкм. В двух электрод мембраной потенциал мембраны ооцита сравнивается с желаемой Холдинг напряжения и сигнал разница впрыскивается в токовый электрод. В записи зажим патч, предполагается, что сопротивление патч зажим электрода является незначительным по сравнению с сопротивление мембраны и, таким образом, что напряжение введенной усилитель добросовестно подается к клеточной мембраны19. Изображение иллюстрирует жидкого накаливания перфузии, в котором два канала — трубка тета заполнены с, с одной стороны, решения управления и, с другой стороны, с раствор, содержащий наркотиков20,21. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы посмотреть большую версию этой фигуры. Рисунок 6 : Концентрация активации отношения на человека α5β3γ2 рецепторов. (A) последовательности управление автоматизированная система состоит из серии иконок и устанавливает экспериментальный протокол для определения концентрации активации отношения. В шагах 1 – 3 как показано в этой панели, система загружает ооцитов от пластины в измеряя корзину. Ток утечки измеряется в шаге 2, и, если это значение превышает нужные критерии, ячейка изменяется автоматически (шаг 3). После периода стабилизации (шаг 4) ооцитов ответ на ссылку концентрации ГАМК является измеренных (шаги 5-8). Ооциты отображения токов больше чем 1 µA хранятся для последующих измерений. Шаги 11-13 ячейка оспаривается разные концентрации ГАМКA и процесс повторяется для требуемого числа концентрации (шаг 14) и клеток (шаг 15). (B) Эта группа показывает типичный течений, вызвала ряд краткий ГАМК приложений (30 s) применяется в разрастающейся. Сроки составного приложения указывается в барах. Участок (C) A пиковый ток притока как функция логарифма концентрации ГАМК дает концентрация активации кривой, которая легко устанавливается уравнением эмпирических Хилл, с непрерывной кривой, ЕС50 на около 11 мкм и холм коэффициент 1,3. Токи, записанная в 8 клеток были нормализованы единства для максимальной вызвал ответ. Бары указывают Среднеквадратичная ошибка среднего значения. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы посмотреть большую версию этой фигуры. Рисунок 7 : Β-СКК, ГАМКA NAM уменьшает паре пульс ингибирование в срезах гиппокампа. (A) Эта группа показывает схематическое представление ломтиком гиппокампа крысы. Коллатералей Шаффер (Sch C) возникая от проекта аксоны CA3 пирамидальной клетке на дендритных арборизация СА1 пирамидных нейронов. Micropipettes были помещены в пласт pyramidale (улица pyramidale) для записи населения шипы (PS) и в radiatum слой (str radiatum) для дендритных записей полевых возбуждающих постсинаптических потенциалов (ВПСП). Электрод стимуляции был помещен в пределах Шаффер коллатералей. (B) Эта группа показывает PSs, вызываемые парных стимулы, применяемые через же стимулирующий электрод с интервалом 20 мс. Ответ на второй раздражитель (PS2) населения является амплитуды меньше, чем в ответ на первый раздражитель (PS1). (C) PSs были записаны в отсутствие (черная полоса) и наличие β-СКК, неселективной NAM рецептор ГАМКA (зеленая полоска). Β-СКК повышение амплитуды второй PS2, частично блокируя любые ингибирования ГАМК корма вперед. Бары указывают Среднеквадратичная ошибка среднего значения и *** что данные являются весьма значительными с p < 0.01. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы посмотреть большую версию этой фигуры. Рисунок 8: Типичные привязки результаты, полученные в конкурентных (торможение или перемещения) assay. Перемещения привязки кривые формируются из которых IC50 и Ki может определяться. IC50 концентрация конкурирующего лиганд, которая вытесняет 50% конкретные привязки лиганд, и Ки (константы ингибирования для наркотиков) является концентрация конкурирующего лиганд, которая будет занимать 50% рецепторов, если не лиганд присутствовали. Ки рассчитывается от IC50 с помощью уравнения Чэн-Прусофф:Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы посмотреть большую версию этой фигуры. Рисунок 9 : Конкурентные Перемещение привязки была выполнена с лигандами, привязки на основные подтипы рецепторов ГАМКA . Сходство (Нм) были измерены с помощью пробирного флумазенил привязки [3H] и мембраны из HEK293 клеток временно transfected с человека ГАМКA рецепторов Субблок комбинаций. Представление гистограммы наглядно иллюстрирует дифференциального чувствительность, наблюдается для соединения RO493851 с низким ГИ на α5β3γ2 рецепторов. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы посмотреть большую версию этой фигуры. Рисунок 10 : Дифференциальные ГАМК чувствительность рецепторов. Участок рецептор ГАМК EC50 на участке паука и представительство состава предполагаемого Субблок обеспечивают эффективные способы сравнения роли различных подразделений. Обратите внимание, что введение субблоков γ2 связано со снижением чувствительности рецепторов. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы посмотреть большую версию этой фигуры. Рисунок 11 : Зондирование эффект модулятор. (A) Эта группа иллюстрирует последовательность значок, используемый для контроля автоматизированной системы. Обратите внимание, что две иконы (A/D) соответствует записи в элементе управления (зеленый) и во время экспозиции модулятор (красный). (B) Эта группа показывает типичный течений, записанная в ячейке, выражая ГАМК-А рецепторов в такой последовательности. Оценить эффекты модулятор, последовательность сначала измерения реакции, вызываемые воздействием фиксированной концентрации ГАМК (зеленый след), последующим воздействием сначала ГАМК и затем ГАМК плюс модулятор (красный след), был проведен. Позиционирование курсоров перекрестия (голубой и синий) отделяет измерения, и синий крест указывает максимальную разницу между двумя записи условий. Соотношение между управления и модулятор условие вычисляется автоматически в программное обеспечение для анализа. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы посмотреть большую версию этой фигуры. Рисунок 12 : Сюжет тепла с тремя реплицирует. Эта панель показывает тепла участок, соответствующий трем реплицирует Модулятор эффектов получено 96 соединений на рецепторы ГАМКA человека α5β3γ2. Соотношения ответа теста над элементом управления, начиная от 0,5 до 1,2 рассматривались как не значительно отличается от элемента управления и представлены Зеленая точка. Коэффициенты ниже 0.5 были рассмотрены как представляющие тормозящее действие и обозначаются синими точками. Коэффициенты выше 1.2 были рассмотрены как расширение ответ и обозначаются красными точками. Обратите внимание на сходство в шаблон между тремя независимыми записей. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы посмотреть большую версию этой фигуры. Рисунок 13 : Счетчик скрининг на α1β2γ2. (A) Эта панель показывает представление предполагаемого подразделения Организации. Следующие панели показывают (B-D) оценку последствий положительных аллостерический модулятор на человека α5β3γ2 и (F-H) в α1β2γ2, использование сопоставимых концентрации ГАМК и аналогичные концентрации (100 мкм) модулятор, который подчеркнуть специфику соединение испытания в этих экспериментах. (E) Эта группа также показывает представление предполагаемого подразделения Организации. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы посмотреть большую версию этой фигуры. Рисунок 14 : PAM чувствительность и рецептор композиция. Определение последствий серии концентраций эффекты диазепам (A-D) α1β2γ2 и (E-H) рецепторы α5β3γ2 показывает почти десятикратного разница в явное сходство. Обратите внимание также влияние состава Субблок на ход времени отклика с быстрее десенсибилизация в α1β2γ2 рецепторы (см., например, панелей, D и H). Обратите внимание, что как α1β2γ2 и α5β3γ2 рецепторы отображения различных сходство для ГАМК (см. также рис. 10), концентрация агонист была скорректирована между двумя рецепторов в ряду сопоставимых активации. (I) Группа представляет участок раз увеличение амплитуда тока нормированы единство с против состояние элемента управления. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы посмотреть большую версию этой фигуры. Рисунок 15 : Выражение плазмида, включая T7 и ЦМВ promotor. Эти панели показывают плазмиду для выражения в Xenopus ооцитов (верхней правой панели) и линии клетки. В нижней правой панели иллюстрирует типичный ГЭС-293 ячейки transfected с плазмида, также содержащие ген Зеленый флуоресцентный белок (ГПУП) с записи патч зажим электрода. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы посмотреть большую версию этой фигуры.

Discussion

Разработка новых соединений в закрытом лигандом ионного канала как рецепторы ГАМКA требует использования нескольких подходов. Как правило первый шаг часто проводится с помощью привязки анализов; Однако такие измерения являются недостаточными для характеризовать физиологической активности соединения или его точного фармакологии. В частности, соединение, которое связывается с рецептором могут повысить или препятствовать его функции или даже производить без функциональных эффект (молчать) (т.е., связывания с рецептором без изменения его функции). Таким образом функциональный тест не требуется для полного комплекса характеристики.

Обязательные анализы:
Основным преимуществом assay привязки является что она может эффективно проводиться большое количество образцов, вплоть до нескольких тысяч и что она обеспечивает сходство привязки для активных молекул. Как описано здесь, первый шаг состоит из создания метода для оценки желаемого рецептор подтипы. А именно Хотя привязка может проводиться на родной рецепторов от фракций или весь мозг, такой метод позволит предотвратить определение сходства на подтипы специфическим рецептором. Это, таким образом, необходимо использовать Рекомбинатные системы для экрана молекул в желаемой цели. В настоящее время преходящий или стабильной трансфекции cDNAs Субблок желаемого рецепторов в клеточных линиях предлагает эффективный и надежный способ выразить подтипы рецепторов интерес (например, ГАМКA α5β3γ2). Традиционной привязки, сделать анализы использования radioligands, но в настоящее время методы доступны, избежать неудобств обработки радиоактивности (например, количественные лигандом привязку на основе флуоресценции).

Функциональные выражения в хост-системе:
Чтобы выразить генов в хост-системе, кодирующая последовательность интереса должен быть вставлен в плазмиду, содержащий достаточное промоторов. Как правило в пробирке синтеза мРНК, используются бактериальные T7 или T6 промоторов. Для выражения cDNA транскрипции гена интереса должны регулироваться эукариоты promotor ЦМВ (цитомегаловирус) или эквивалент. В настоящее время несколько плазмидов, включая два промоторов (то есть, pUNIV, pCMV-6AC, psf ЦМВ/T7, pCI-neo, pcDNA), являются доступны позволяя в vitro синтез mRNA или cDNA выражение, как показано на рисунке 15. Рецепторов ГАМКA добросовестно получить выражение в клеточных линиях или в Xenopus ооцитов. Основными преимуществами последних являются отсутствие экспрессии эндогенных рецепторов, простоты манипуляций и наличия автоматизированной системы для микро инъекции и записей. Процедуры, описанные в настоящем Протоколе проиллюстрировать эффективность автоматизированной системы, которая позволяет инъекции 96 ооциты около 7 минут и не требует микроманипуляции навыков. Вспомнив, что один яичник от Xenopus содержит между 10000-30000 ооцитов, становится ясно, что большое количество клеток измерения могут проводиться на одном подготовки. Кроме того как выражение может проводиться с помощью инъекции cDNA, же плазмид, содержащие гены интереса, которые разрабатываются для экспериментов привязки может использоваться для функциональных характеристик без необходимости дальнейшего молекулярной биологии манипуляции.

Учитывая ее большого размера и высокой поверхности выражение, одной яйцеклетки дает количество рецепторов, что примерно эквивалентно вырожденная клетки в 35 мм Петри. Однако подготовка ооцитов и инъекций представляет часть стоимости клеточной линии, как эксперименты не требуют конкретных питательной среды и стерильные манипуляции. Активация одного канала ГАМКA дает несколько picoamperes (10-12) и течений, начиная до десятков МКА (10-6) легко записываются в одной яйцеклетки, которая подтверждает сопутствующей деятельности нескольких миллионов рецепторы во время ни одного ответа.

Первым шагом в характеристике лиганд закрытый ионных каналов часто является определение явно сродства рецепторов. Эксперименты, которые должны быть проведены состоят из применения ряда краткий агонист испытательных импульсов и заговоре амплитуда вызвал текущий или, в некоторых случаях, площадь под кривой (AUC)) как функция логарифма агонист концентрации. Как это легко осуществимо для microinject различных плазмида концентрации и соотношение в том же пакете яйцеклеток, эта система выражения особенно подходит для такой квалификации. Кроме того партии партии сравнения показали высокую степень стабильности для различных ЕС50s. Влияние состава Субблок на рецептор явное сходство легко визуализируется с помощью паука сюжет, как например, на рисунке 10.

Результаты двух электрод мембраной, полученные в Xenopus ооциты часто сравнивают с записей, сделанных с помощью электродов зажим патч. В то время как он будет выходить за рамки этой работы вдаваться в детальное сравнение между этими двумя системами, можно рассмотреть несколько моментов. В то время как патч зажим в клетках предлагает преимущества для биофизические характеристики с применением быстрых наркотиков, ее требования более сложны, чем те из двух электрод записей в Xenopus ооцитов. Первый и не ничтожно малый трудность это выражение данного белка с необходимость культуры клеток, переходный или Трансфекция стабильная и идентификации клеток, которые выражают нужную конструкцию. Кроме того он незаменим для изучения возможного вклада эндогенного выражения в рассматриваемой клетки. Кроме того запись зажим патч требует квалифицированного лица для проведения микроманипуляции под микроскопом высокого увеличения, в то время как это лицо также необходимо выполнить адекватного анализа в ходе эксперимента оценить, например, качество печати, доступ сопротивления и т.д. В отличие от двух электрод мембраной, записи, особенно один с использованием автоматизированной системы электрофизиологических, не требуют каких-либо конкретных навыков и может проводиться лаборантов.

При приобретении электрофизиологических set-up, стоимость рассмотрения, безусловно, важным фактором, который необходимо тщательно проанализировать. Например в то время как стоимость автоматизированной системы является относительно высокой, ближе сравнение показывает, что установка полного электрофизиологических Рог включает Покупка оборудования, таких как хороший микроманипуляторы, объектив бинокля, усилитель, перфузии системы и таблицу анти-вибрации, а также получения данных и проведения анализа. Сравнение стоимости между двух электродом напряжения зажим set-up против set-up зажим патч показывает даже дальнейшие расхождения. Кроме того автоматизированная система предлагает преимущество полностью автоматизированное оборудование и работает без присмотра днем и ночью.

Фармакологические свойства соединения определяется его режим действий на рецептор. К примеру конкурентные ингибиторы являются молекулы, которые можно ввести же привязки кармане или orthosteric сайта, как агониста, сам вызывает конкуренцию. Non конкурентные ингибиторы являются соединениями, которые подавляют рецепторов, взаимодействуя в другом месте и, в случае закрытого лигандом ионного канала, которые можно ввести и блокировать ионных поры, например. Это будет выходить за рамки этой работы для изучения различных механизмов взаимодействия, но дополнительную информацию можно получить из фармакологических учебника и/или от других работ, таких как Бертран и Бертран22.

В случае аллостерический модуляторы соединение связывает на сайте, отличном от сайта orthosteric, но присутствие молекулы изменяет энергетического барьера между активной и другими государствами. Позитивные аллостерический модуляторы (ПАМС) являются соединениями, которые снижают энергетического барьера от отдыха в активное состояние и, таким образом, усилить эффект агониста. Охарактеризовать возможные эффекты PAM, он, таким образом, необходимо определить воздействия комплекса повышает ответ агонист и, если да, в которых концентрация. Эксперименты, представлены на рисунке 11 и рис свидетельствуют протоколы, которые могут успешно использоваться для характеристики ПАМС на рецепторы ГАМКA .

В некоторых случаях подверженности PAM только может быть достаточно для того активировать приемные устройства. Такая деятельность может определяться небольшая модификация экспериментальный протокол, представленные здесь. А именно вместо совместного применения модулятора во время экспозиции к ГАМК, протокол может быть изменен для применения первого соединения один и затем в присутствии ГАМК. Характеристика деятельности прямой агонист будут сделаны определения амплитуда ответа вызываемые сам объект и по сравнению с ГАМК вызвала тока.

Эксперименты, проведенные в срезы мозга, такие, как показано на рисунке 7, используются для подтверждения соединения деятельности на родной рецепторов в определенный тормозной цепи прежде чем идти дальше, в животных моделях и вдоль пути к клинических испытаний. Протокол записи и анализа данных относительно простой позволяет рейтинге несколько соединений, оценивая их дифференциального модулирующее влияние на PS амплитуды. Неспецифические эффекты соединений, которые не связаны с ГАМК системы также могут быть обнаружены (например, когда наблюдаются изменения в форме Л.С.). Прямые, ГАМК синапсах может оцениваться в этих случаях измерения воздействия соединений на тормозной постсинаптический токов (IPSCs) с помощью поклеточного патч зажим техника8.

Disclosures

The authors have nothing to disclose.

Acknowledgements

Авторы поблагодарить Джудит Lengyel, Мария Карг, Grégoire Friz, Рэйчел Haab и Мари Клер Pflimlin от Рош и Tifany Schaer и Дебора Паолуччи от HiQScreen за их прекрасную техническую помощь.

Materials

General equipment
96 well cell harvester -(Filtermate 196)  Packard To filter membranes with bound radioligand
Microtiter plate liquid scintillation counter (Top Count NXT) Packard Microplate Scintillation and Luminescence counter
Vial liquid scintillation counter (Beta-Couter 2500 TR) Packard Vial Scintillation and Luminescence counter
Liquid  handler (Biomek 2000) Beckman coulter To prepare compound dilutions
Vortex (Vortex Genie 2) Scientific industries Inc. To mix compound stock solutions
Tissue homogenizer (Polytron PT1200E) Kinematica AG To resuspend the membrane preparations
XLfit5 software Microsoft Excel
 add-on by IDBS		 Curve fitting software
Smart Pull UniPix – Electrode Puller
RoboInject MultiChannel Systems – Automated Injection (Xenopus Oocytes)
HiClamp MultiChannel Systems – Automated Voltage Clamp (Xenopus Ooocytes)
DataMining MultiChannel Systems – Data Analysis Software
DataMerger MultiChannel Systems – Data Processing Software
Digidata 1550 Molecular Devices Low noise data acquisition system
CyberAmp 380 or equivalent Axon Instruments Programmable Signal Conditioner
pClamp program suite Molecular Devices Software for data acquisition and analysis software
Antivibraton table  TMC To avoid microelectrode vibrations 
Patchstar Micromanipulators Scientifica To accurately position microelectrodes in brain slices
Faraday Cage  Sutter Instruments To isolate recordings from noise
McIlwain Tissue Chopper Campden Instruments LTD  To prepare brain slices
Borosilicate glass micropipette  Warner Instruments GC150TF-10 To record extracellular potentials in brain slices
Twisted pair, platinum iridium wires stimulation electrode World Precision Instruments To stimulate the brain slices with current
Stimulus generator for current and voltage driven stimulation MultiChannel Systems STG4000 Delivers the current to the stimulation electrode
Plasticware
Microtiter plate round bottom Corning #3365 Used for the binding assay
GF/C glassfibre filter-bottom 96-well microplate with 1.2µm poresize, for cell harvesting assays using a vacuum manifoldwell filter  Packard  #6005174 used for the binding assay
50 mL Tubes Falcon  #352070 used for the binding assay
Safe-lock tubes 1.5 mL Eppendorf #0030 120086 used for the binding assay
Safe-lock tubes 2 mL Eppendorf #0030 120094 used for the binding assay
Shipping tubes 180ml  Semadeni Europe AG  #3722 used for the binding assay
Pony vial Polyethylene 6ml  Perkin Elmer  #6013329 used for the binding assay
Top Seal  Perkin Elmer  #60051859 used for the binding assay
Spinner Flask Bellco BELLCO # 1965-00100 Spinner Flask
96  Well Plate (Conical) Thermo Scientific Milian 56368 Injection plate for the oocytes
96  Well Plate (Flat bottom) Corning (Vitaris Switzerland) 3364-cor Compound Plate for the HiClamp
Glass capillary  Hilgenberg (Germany) – borosilicate glass 1.2 O.D. 0.76 I.D. with filament
RNA preparation
Ambion mMessage mMachine Thermo Fisher Scientific for the in vitro synthesis
Chemicals
Assay buffer: KCl 5 mM; CaCl2 1.25 mM; MgCl2 1.25 mM; NaCl 120 mM; Tris 15 mM pH adjust with HCl to 7.4; store up to 3 months at 4°C. Used for binding assay
Washing buffer: Tris 50mM -HCl pH 7.4; store at 4°C. Used for binding assay
Stock solution of test compounds 10mM in DMSO Used for binding assay
Flumazenil (RO0151788) 10mM in DMSO Used for binding assay
Diazepam 4mM in DMSO Used for binding assay
[3H]-Flumazenil 60-85 Ci/mmol in Ethanol; store at -20°C Used for binding assay
Microscint 40  Packard  #6013641 Used for binding assay
Ultima Gold  Perkin Elmer  #6013329 Used for binding assay
MS-222 Sigma Sigma # A5040 MS-222
AB/AM Sigma Sigma # A5955 antibiotics / antimycotics
Collagenase Sigma Sigma # C1030 Collagenase Type I
Rnase Sigma Sigma # R2020-250 mL RNaseZAP
EndoFree Plasmid maxi Kit Qiagen Qiagen # 12362
Salts for artificial cerebrospinal fluid (NaCl, KCl, etc.) Sigma
Membranes
Frozen membrane preparations from transient or stably transfected HEK293 overexpressing different human GABAA receptor subtypes: α1β3γ2, α2β3γ2, α3β3γ2, α5β3γ2. See Ballard et al 2009 for detailed methods. Used for binding assay
DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Rudolph, U., Knoflach, F. Beyond classical benzodiazepines: novel therapeutic potential of GABAA receptor subtypes. Nature Reviews Drug Discovery. 10, 685-697 (2011).
  2. Sieghart, W. Structure and pharmacology of g-aminobutyric acidA receptor subtypes. Pharmacological Reviews. 47, 181-234 (1995).
  3. Liu, J., et al. A high-throughput functional assay for characterization of g-aminobutyric acidA channel modulators using cryopreserved transiently transfected cells. ASSAY and Drug Development Technologies. 6, 781-786 (2008).
  4. Mennerick, S., et al. Diverse voltage-sensitive dyes modulate GABAA receptor function. Journal of Neuroscience. 30, 2871-2879 (2010).
  5. Hevers, W., Luddens, H. The diversity of GABAA receptors. Pharmacological and electrophysiological properties of GABAA channel subtypes. Molecular Neurobiology. 18, 35-86 (1998).
  6. Macdonald, R. L., Olsen, R. W. GABAA receptor channels. Annual Review of Neuroscience. 17, 569-602 (1994).
  7. Kemp, J. A., Marshall, G. R., Wong, E. H., Woodruff, G. N. The affinities, potencies and efficacies of some benzodiazepine-receptor agonists, antagonists and inverse-agonists at rat hippocampal GABAA-receptors. British Journal of Pharmacology. 91, 601-608 (1987).
  8. Prenosil, G. A., et al. Specific subtypes of GABAA receptors mediate phasic and tonic forms of inhibition in hippocampal pyramidal neurons. Journal of Neurophysiology. 96, 846-857 (2006).
  9. Ballard, T. M., et al. RO4938581, a novel cognitive enhancer acting at GABAA a5 subunit-containing receptors. Psychopharmacology. 202, 207-223 (2009).
  10. Knoflach, F., Hernandez, M. C., Bertrand, D. GABAA receptor-mediated neurotransmission: Not so simple after all. Biochemical Pharmacology. 115, 10-17 (2016).
  11. Gielen, M. C., Lumb, M. J., Smart, T. G. Benzodiazepines modulate GABAA receptors by regulating the preactivation step after GABA binding. Journal of Neuroscience. 32, 5707-5715 (2012).
  12. Bergmann, R., Kongsbak, K., Sorensen, P. L., Sander, T., Balle, T. A unified model of the GABAA receptor comprising agonist and benzodiazepine binding sites. PLoS One. 8, 52323 (2013).
  13. Richter, L., et al. Diazepam-bound GABAA receptor models identify new benzodiazepine binding-site ligands. Nature Chemical Biology. 8, 455-464 (2012).
  14. Rudolph, U., Crestani, F., Mohler, H. GABAA receptor subtypes: dissecting their pharmacological functions. Trends in Pharmacological Sciences. 22, 188-194 (2001).
  15. Wisden, W., Seeburg, P. H. GABAA receptor channels: from subunits to functional entities. Current Opinion in Neurobiology. 2, 263-269 (1992).
  16. Davies, C. H., Davies, S. N., Collingridge, G. L. Paired-pulse depression of monosynaptic GABA-mediated inhibitory postsynaptic responses in rat hippocampus. The Journal of Physiology. 424, 513-531 (1990).
  17. Karnup, S., Stelzer, A. Temporal overlap of excitatory and inhibitory afferent input in guinea-pig CA1 pyramidal cells. The Journal of Physiology. 516, 485-504 (1999).
  18. Turner, D. A. Feed-forward inhibitory potentials and excitatory interactions in guinea-pig hippocampal pyramidal cells. The Journal of Physiology. 422, 333-350 (1990).
  19. Hamill, O. P., Marty, A., Neher, E., Sakmann, B., Sigworth, F. J. Improved patch-clamp techniques for high-resolution current recording from cells and cell-free membrane patches. Pflügers Archiv. 391, 85-100 (1981).
  20. Adelsberger, H., Brunswieck, S., Dudel, J. Block by picrotoxin of a GABAergic chloride channel expressed on crayfish muscle after axotomy. European Journal of Neuroscience. 10, 179-187 (1998).
  21. Hapfelmeier, G., et al. Isoflurane slows inactivation kinetics of rat recombinant a1b2g2L GABAA receptors: enhancement of GABAergic transmission despite an open-channel block. Neuroscience Letters. 307, 97-100 (2001).
  22. Bertrand, S., Bertrand, D. Overview of electrophysiological characterization of neuronal nicotinic acetylcholine receptors. Current Protocols in Pharmacology. , 17 (2004).

Tags

GABA-A ReceptorRadioligand BindingElectrophysiologyXenopus OocytesRodent Brain SlicesCompound ScreeningSubtype SelectivityEfficacyMicroinjectionVoltage ClampPopulation Spike RecordingHippocampus

Play Video
PDF
DOI
DOWNLOAD MATERIALS LIST
Cite This Article
Knoflach, F., Hernandez, M., Bertrand, D. Methods for the Discovery of Novel Compounds Modulating a Gamma-Aminobutyric Acid Receptor Type A Neurotransmission. J. Vis. Exp. (138), e57842, doi:10.3791/57842 (2018).
Download Citation
Reprints and Permissions

View Video

✖

To prove you're not a robot, please enter the text in the image below

CAPTCHA Image
Play CAPTCHA Audio
Refresh Image