Γ-アミノ酪酸受容体をモジュレート新規化合物の探索の方法を入力、神経伝達

バインディング:細胞膜との in vitroアッセイを使用して、選択的人間 GABAA α5β3γ2 受容体リガンド、γ2 の BZD アロステリック サイト受容体を含むバインドを識別します。一時的に transfected HEK293 細胞人間の GABA、 α5β3γ2、α1β3γ2、α2β3γ2、α3β3γ2 受容体は、この試金のための膜を準備する使用されます。潜在的な配位子の影響は、膜受容体 ([3H] フルマゼニル結合阻害) するバインド [3H] フルマゼニルのシンチレーションを測定することによって検出されます。RO4938581 の例のように特定の GABAAの受容体の化合物の選択性を評価するために変位結合曲線が生成されます (図 8)。図 9は、いくつかの参照化合物の α 5 選択的 GABAA受容体陰性アロステリック変調器、RO49385819のそれを含む結合の試金を使用して生成されたプロファイルをまとめたものです。 録音アフリカツメガエル卵母細胞:Α5β3γ2 heteromer など GABAAの受容体の発現には GABA 露出に対して堅牢な電流が得られます。簡単な GABA パルスに対して人間の α5β3γ2 を表現する卵母細胞で得られた典型的な電圧クランプ録音 (30 秒)図 6に示すように、最大 300 μ M に至るまで。この実験では、96 ウェル プレートで処分された GABA 濃度の異なる、特定の井戸にセルを移動することによって、応答を誘発しました。GABA は、中央の灌流チェンバにセルを返すと対応する蠕動性ポンプを活性化して血流制御ソリューションを適用することによって徹底的に洗われました。濃度活性化曲線の測定に使用されるプログラムのシーケンスを図 6に示します。完全に自動的に行われて、これらのデータを示してアフリカツメガエル卵母細胞で得られる録音の両方の品質と受容体の発現の高レベル取得 mRNA 注射後数日。異なる受容器の組み合わせで実験は、GABA 受容体の半分をアクティブに必要な濃度である EC50s のシリーズを生成します。スパイダー グラフ上の EC50値のプロット図 10で示すようサブユニット組成の影響と受容体プロパティの迅速な比較を提供します。 (ナムまたは PAM) 正または負アロステリック変調の効果を検討するためアゴニスト (GABA) テスト パルス最初コントロールし、変調器の存在により誘発される応答を比較する必要は。このような実験を実施する効率的な実験的プロトコルを図 11に示します。参照濃度の GABA への細胞の応答は最初に決定され、同じ GABA 濃度を適用し、GABA プラス変調器の共同アプリケーションによってシーケンスが繰り返されます。2 つの重畳応答のプロットは、この例では変調器の存在によって引き起こされる著しい阻害を明かします。変調効果の定量化を用いて容易に計算コントロールと変調器の存在下で誘発される応答の比と熱プロットの形で結果をプロットできます。図 12に示すデータは、96 化合物を取得した 3 つのデータ セットの録音に対応する熱プロットを示しています。 次の十分にアクティブな化合物の同定、しばしばこれらの分子は他の受容体の組み合わせでアクティブである場合を評価するために不可欠であるないです。ギャバA受容体の場合異なるサブユニットの 19 遺伝子が同定されているし、機能的受容体可能性がある (の Knoflach ・ ヘルナンデス、バートランドの10を参照してください異なるサブユニットのポリコームタンパク アセンブリから知られています。レビュー)。複数のサブユニットとの組み合わせの収量受容体の膨大なレパートリーは、サブタイプが実行されるカウンター スクリーニングの多数を必要とする可能性があります、それはしばしばピント合わせする最初の最も豊富なサブタイプでの GABAA の場合受容体、α1β2γ2 の組成物であります。式を頭に頭を行った実験、たとえば、α5β3γ2 卵母細胞の同じバッチの α1β2γ2 生成任意の分子のそれぞれの効果の良い比較です。Α5β3γ2 と α1β2γ2 の 3 つのセルの典型的な結果は、図 13α5β3γ2 で 1 つの分子の優遇の正の調節を示すに表示されます。 図 11に示す実験的プロトコルは、PAM 活動の評価に適しています。このプロトコルでテストされる化合物は徐々 に濃度の増加でアゴニストを共同適用です。同じセルで複数のアプリケーションによる累積的な影響を避けるためには、各データ ポイントの新しい、素朴なセルを測定します。応答の振幅の測定はアゴニスト単独で記録し、アプリケーションの化合物中に PAM または南の効果を定量化する比率が生成されます。Α1β2γ2 とジアゼパムの α5β3γ2 で得られた典型的な結果は、明らかにこの受容体結合の約 10 倍高い α5β3γ2 の明白な感度図 14のとおりです。これらの値は、パブリッシュされたデータ11と良い相関。ベンゾジアゼピン系サイト、γ2 とその隣接する α サブユニット12-14間のインターフェイスによって構成されていると考えられて、α5β3γ2 の感度 γ2 α 1 に γ2 α 5 優遇ジアゼパムの親和性を示唆しています。効率的な機能解析と組み合わせる異なる受容体の組み合わせを表現する可能性は、PAM プロパティとその生理学的および薬理学的効果の決定要因を探検する複数の方法を開きます。 海馬脳スライス:ラット脳海馬スライスの実験はネイティブ受容体モデルの生体外の試金で同定された化合物の薬理学的プロファイルを検証します。海馬の錐体細胞で発現優勢な GABAAの受容体サブタイプがベンゾジアゼピン (代表)15変調 α1β2/3γ2、α2β2/3γ2、α5β2/3γ2。ペアパルス抑制は、20 ms 間隔を配信 2 対電気刺激の 2 番目の反応の変更をテストすることによって海馬神経回路の興奮性を明らかにすることができますパラダイムです。2 番目の反応の変化は、錐体細胞層16-18を支配する介在ニューロンによって gaba 作動性のフィードバックによるものです。制御では、図 7に示すように、2 つの対になった刺激の 2 番目の応答、gaba 作動性抑制抑制されます。Β CCM でスライスを灌によりこの抑制が減少、非選択的南、2 つの対になった刺激の 2 番目の応答は、はるかに低い程度に抑制されます。この実験パラダイムは α 5 サブユニットを含む GABAAの受容体の選択的な化合物に敏感です。 図 1: スクリーニング戦略。典型的な薬剤のスクリーニングの経路は化合物の大規模なライブラリが特定のターゲットの選別、高スループット スクリーニングを開始します。次のリード候補の同定、薬効がある化学の仕事を開始します。このフェーズでは、化学者が研究や分子を絞り込むターゲット選択性、脳浸透度、安定性、この重要な段階で、劣化などなど、必要な条件を満たすために構造変更を実行することによってそれが欠かせません化学修飾した分子プロパティを変更していないかどうかを評価し、最高の候補者を絞り込みます。次のステップは、識別するためにカルシウム蛍光を含む他の方法が機能試金、化合物および安全、許容範囲は、次のステップにそれらをもたらすいくつかの有望な等メモその電気生理学が示されます試金または電圧敏感な染料は、代替手段として使用できます。これら後者のメソッドは、結合の試金のための代用として高スループット試金を使用します。この図の拡大版を表示するのにはここをクリックしてください。 図 2: 96 ウェルのレイアウト メッキ実験をバインドするために利用します。1 列は、合計結合測定と非特異的結合測定のため 2 列に使用されます。行 A-H は重複の各化合物の濃度 (3-12 の列) の増加で 4 さまざまな化合物で満ちている (すなわち、化合物 1 行 A と E、化合物 2 B および F の行など) 異なる色とレイアウトで表されます。この図の拡大版を表示するのにはここをクリックしてください。 図 3: 自動システムを用いたマイクロインジェクション。(A) A 高精度 XYZ システム、卵母細胞に、関心のプラスミッドを含んでいる液体で満たされたガラス注射針でつついては自動的に。(B) このパネルは、卵母細胞 (C) で自動的に注入される 96 ウェル円錐形の底板を示しています。(D) このパネルは、インジェクションの原理を示しています。原子力の注入の針は、パネルBに示すように、卵母細胞、核よりも少し深くを浸透します。核から針を撤回する、(パネルCを参照)、注入前に (パネルDを参照)。(E) 注入針の品質を評価するために満たすことができる染料と「調理」の卵は半分にカットすることができます。この図の拡大版を表示するのにはここをクリックしてください。 図 4: 自動の 2 つの電圧クランプ電極原理。原則は、灌流液を適用するのではなく、井戸の間準備を移動に基づいています。(A) パネルの左側にある 2 つの電極と 1 つのサンプルからの移動中に準備のまわりの液滴を維持する小さなバスケットアフリカツメガエル卵母細胞における記録をできるように配置を表します別のです。2 つの電極をバスケットに入れた卵の画像が右側に表示されます。(B) このパネルは、原理を記録「逆さま」生理学の概略図を示しています。(C) このパネルは、記録テーブルの卵、複合板、手洗い所の処分を示しています。この図の拡大版を表示するのにはここをクリックしてください。 図 5: 2 電極電圧クランプ対パッチク ランプ記録します。典型的な 2 電極電圧クランプ卵母細胞 (左側のパネル) の記録は、細胞株 (右側のパネル) 用パッチ クランプ構成と比較されます。対直径で約 1 mm 約 20 μ m の細胞である卵のサイズの違いに注意してください。2 電極電圧クランプで卵母細胞の膜電位が必要な保持電圧と比較し、信号差が注入される電流の電極。パッチ ・ クランプ記録のパッチ クランプ電極の抵抗は無視できると膜抵抗と、したがって、電圧がアンプによって課されたことは忠実に供給細胞膜19に見做されます。画像は、シータ チューブ () の 2 つのチャンネルが、一方で、制御ソリューションと、その一方で、薬20,21を含むソリューションに満ちている液体フィラメント灌流を示しています。この図の拡大版を表示するのにはここをクリックしてください。 図 6: 人間 α5β3γ2 受容体濃度活性化関係。(A) シーケンス制御自動化されたシステム アイコンのシリーズで構成され、濃度活性化関係の定量実験のプロトコルを設定します。1-3 の手順では、システムはこのパネルで示すように、測定のバスケットにプレートから卵母細胞を読み込みます。手順 2 で漏れ電流を測定し、この値が目的の基準を超えた場合、セルが自動的に変更 (ステップ 3)。安定化期間 (ステップ 4)、参照 GABA 濃度に卵母細胞応答は測定 (手順 5 ~ 8)。1 μ A を超える電流を表示する卵子はそれに続く測定のため保持されます。手順 11-13 で GABAAの異なる濃度でセルに挑戦し、希望の数濃度 (手順 14) のためのそれ自身と (手順 15) の細胞プロセスが繰り返されます。(B) このパネルは一連の簡単な GABA アプリケーションにより誘発される典型的な流れを示しています (30 s) 成長の順序で適用されます。複合アプリケーションのタイミングは、バーで示されます。(C) A プロット GABA 濃度の対数の関数としてピークの内向きの流れの生成濃度活性化曲線が連続した曲線、約 11 μ M で EC50と丘の経験的なヒルの式によって容易に装備されて1.3 の係数。8 セルに記録された電流は、最大の誘発反応の団結を正規化されました。バーは、平均値の標準誤差を示します。この図の拡大版を表示するのにはここをクリックしてください。 図 7: Β-CCM、GABAAナム削減海馬スライスにおけるペアパルス抑制します。(A) このパネルはラット海馬スライスの概略を示しています。CA1 錐体細胞の樹状突起の楔形の CA3 錐体細胞の軸索プロジェクトから発信されたシャファーの担保 (Sch C)。マイクロ ピペットは、地層属三角骨 (str 属三角骨) 人口スパイク (PS) を記録するため、興奮性シナプス後電位 (epsp) の樹状の録音の層結腸寄生虫 (str 結腸寄生虫) に置かれました。刺激電極は、シャファー側枝内に置かれました。(B) このパネルは 20 ms 間隔で同じ刺激電極を使用して適用対音刺激に対する誘発 PSs を示しています。2 番目の刺激 (PS2) に人口応答 (PS1) の最初の刺激への応答よりも小さな振幅のです。(C) PSs は不在 (黒いバー) と β-CCM、非選択的ギャバA受容体ナム (緑色のバー) の存在で記録されました。Β CCM は、任意のフィード フォワードの gaba を部分的にブロックすることによって 2 番目の PS2 の振幅を強化しました。バーは、平均値の標準誤差を示すと * * * データがpで非常に重要である < 0.01。この図の拡大版を表示するのにはここをクリックしてください。 図 8:競争 (抑制または変位) 試金の典型的なバインディング結果します。変位結合曲線は、IC50と氣決定できるから生成されます。競合するリガンド、リガンドの特定のバインディングの 50% の濃度であり、Ki (薬物の阻害定数) は場合ない放射性リガンド受容体の 50% を占める競合リガンドの濃度 IC50存在していた。氣は、チェン プルソフ式を用いた IC50から計算されます。この図の拡大版を表示するのには、ここをクリックしてください。 図 9: 競合製品の排除バインディングは配位子の主要な GABAAの受容体サブタイプのバインディングを実行します。[3H] フルマゼニル結合の試金を使用してアフィニティ (nM) を測定し、HEK293 細胞から膜は異なる人間 GABAA受容体のサブユニットの組み合わせで一過性トランスフェクションします。ヒストグラム表示は、明らかに差動感度 α5β3γ2 受容器の最も低い Ki と化合物 RO493851 の観察を示しています。この図の拡大版を表示するのにはここをクリックしてください。 図 10: 差分 GABA 受容体の感度。レセプター GABA EC50クモ プロットのプロットと推定サブユニット組成の表現は、異なるサブユニットの役割を比較する効率的な方法を提供します。Γ2 サブユニットの導入は受容体の感受性の減少に関連付けられている注意してください。この図の拡大版を表示するのにはここをクリックしてください。 図 11: 変調器の効果を調査します。(A) このパネルは、自動化されたシステムの制御用アイコン シーケンスを示しています。2 つの (A/D) アイコンがコントロール (緑) と変調器露出 (赤) の間に記録に対応しているに注意してください。(B) このパネルは、このようなシーケンス中に GABAAの受容器を表現するセルに記録されている一般的な流れを示しています。変調器の効果を評価するには、GABA プラス (赤のトレース)、変調器にし、GABA に最初の暴露に続いて固定 (緑トレース)、GABA 濃度への露出によって誘発される応答を計測のシーケンスを行った。測定を区切ります (水色と青) 十字型のカーソルを位置決め、青い十字が 2 つの録音条件の最大の違いを示します。調節器、変調器の条件間の比率は、解析ソフトウェアで自動的に計算されます。この図の拡大版を表示するのにはここをクリックしてください。 図 12: 3 つの複製と熱プロットします。このパネルは、人間 α5β3γ2 GABAAの受容器の 96 化合物の得られる変調効果の 3 つの複製に対応する熱プロットを示しています。0.5 と 1.2 の間で及ぶ統制テスト応答の比率は、コントロールから有意差はないと考えられていた、緑色のドットで表されます。比 0.5 以下は抑制効果を表すと考えられていた、青いドットで表されます。1.2 上の比率は、応答の向上として考慮された、赤いドットで表されます。3 つの独立した録音の間のパターンの相似性に注意してください。この図の拡大版を表示するのにはここをクリックしてください。 図 13: Α1β2γ2 で上映をカウンターします。(A) このパネル推定サブユニット構造の表現を示しています。次のパネル表示 (B・D) 人間 α5β3γ2 (F・H) で正のアロステリック変調器の効果の評価の GABA の濃度と同様の濃度 (100 μ M) を使用して、α1β2γ2 で、変調器は、化合物の特異性を強調は、これらの実験でテスト。(E) このパネルは、推定のサブユニット構造の表現を示しています。この図の拡大版を表示するのにはここをクリックしてください。 図 14: PAM 感度と受容体組成します。ジアゼパムの効果 (A~D) α1β2γ2、(E・H) での濃度のシリーズの効果の定量 α5β3γ2 受容体は、見かけの親和性のほぼ 10 倍の違いを明らかにします。なお高速 α1β2γ2 受容器の減感と応答時間コース サブユニット組成の影響 (たとえば、 DとHのパネルを参照)。Α1β2γ2 として注意してください、 GABA の α5β3γ2 受容体表示異なる親和性 (また図 10を参照)、アゴニストの濃度は匹敵する活発化の範囲にある 2 つの受容体の間で調整します。プロットを表します (I) このパネル倍の電流振幅の増加は対統一に正規化条件を制御します。この図の拡大版を表示するのにはここをクリックしてください。 図 15: T7 と CMV プロモーターを含む発現プラスミド。これらのパネルは、アフリカツメガエルの卵母細胞 (右上のパネル) および細胞ライン式のプラスミドを表示します。下の右側のパネルは、パッチク ランプ記録電極とも緑色蛍光蛋白質 (GFP) 遺伝子を含むプラスミドをトランスフェクトした典型的な HEK 293 細胞を示しています。この図の拡大版を表示するのにはここをクリックしてください。