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Neuroscience

Méthodes pour la découverte de nouveaux composés modulant un récepteur de l’acide Gamma - aminobutyrique tapez une Neurotransmission

Published: August 16, 2018
doi:
10.3791/57842
, ,
1Discovery Neuroscience, Pharma Research and Early Development,Roche Innovation Center Basel, 2HiQScreen Sàrl 6

Summary

Nous présentons ici les protocoles visant à découvrir des composés actifs au niveau des récepteurs GABAA , de la liaison à la physiologie et de pharmacologie.

Abstract

Cette présente manuscrit un protocole étape par étape pour le dépistage des composés à gamma-aminobutyrique acide type un récepteurs (GABA-A) et son utilisation vers l’identification de nouvelles molécules actives dans les essais précliniques d’une recombinaison in vitro récepteur à leurs effets pharmacologiques au niveau des récepteurs indigènes dans des tranches de cerveau de rongeurs. Pour les composés obligatoire sur le site de benzodiazépine du récepteur, la première étape consiste à mettre en place un écran primaire qui consiste à développer des radioligands essais de liaison sur les membranes cellulaires exprimant les principaux sous-types de GABAA . Puis, profitant de l’expression hétérologue des récepteurs de GABAA rongeurs et humains dans les ovocytes de Xenopus laevis ou cellules HEK 293, il est possible d’explorer, dans des tests électrophysiologiques, les propriétés physiologiques des différents récepteurs sous-types et les propriétés pharmacologiques des composés identifiés. Le système d’ovocytes Xenopus est présenté ici, commencer par isoler les ovocytes et leur microinjection avec différents ARNm, jusqu’à la caractérisation pharmacologique à l’aide de pinces de tension de deux électrodes. Enfin, enregistrements effectués dans des tranches de cerveau rongeurs seront décrites qui sont utilisés comme un test physiologique secondaire pour évaluer l’activité de molécules à leurs récepteurs natifs dans un circuit neuronal bien défini. Enregistrements extracellulaires en utilisant les réactions des populations de neurones multiples sont démontrés avec la demande de drogues.

Introduction

Nous présentons ici les protocoles pour la découverte de composés actifs au niveau des récepteurs GABAA , de la liaison à la physiologie et de pharmacologie. Dans la recherche de nouvelles molécules spécifiques des récepteurs GABAA , il est crucial de définir, aussi précisément que possible, le sous-type d’intérêt et de l’évaluation de la spécificité des composés nouvellement identifiés (par exemple, pour un compte-rendu, voir Rudolph et Knoflach1ou Sieghart2). Chemin d’accès standard dans la découverte et les mesures qui doivent être atteints sont illustrées à la Figure 1.

Essais de liaison ont été et sont encore largement utilisés comme la première étape dans la découverte de médicaments. Dans le cas des récepteurs GABAA , ils sont optimisés afin d’identifier les composés qui se lient à l’accepteur benzodiazépine du récepteur où lient thérapeutiquement utiles et sécuritaire des médicaments. Autres techniques, utilisant fluorimétrique imagerie plaque lecteur (FLIPR) membrane potentiels des essais teintée rouge3, détectent des composés comme les barbituriques qui se lient à des sites supplémentaires qui sont moins souhaitables en raison de leur profil d’effets secondaires indésirable. En outre, les colorants utilisés peuvent activer directement les récepteurs GABAA , questionnant ainsi l’utilité de ces essais pour la drogue découverte4. Tests de liaison ne peut fournir la preuve qu’une substance donnée peut se lier à une classe de récepteurs spécifiques. In vitro essais avec les membranes cellulaires sont utilisés pour identifier les sélectifs humaines ligands des récepteurs GABAA α5β3γ2. Les cellules HEK293 transitoirement transfectées exprimant l’humain GABAA α5β3γ2, α1β3γ2, α2β3γ2 et α3β3γ2 récepteurs servent à préparer des membranes de ces tests. L’effet des ligands est détectée en mesurant la scintillation de flumazénil [3H] lié aux récepteurs membranaires (une inhibition de la liaison de flumazénil [3H]). Le principal avantage de cette technique est qu’une décision rapide et efficace de l’affinité de liaison composé au récepteur d’intérêt est fournie au récepteur d’intérêt.

Des études fonctionnelles sont essentiels pour évaluer l’activité fonctionnelle des composés et de proposer une explication physiologique et pharmacologique des mécanismes causée par la liaison des composés aux récepteurs. Aujourd’hui, c’est bien connu que les récepteurs GABAA fonctionnels résultent de l’assemblage de cinq sous-unités autour d’un axe de pseudosymmetry formé par le pore ionique et le résultat de l’assemblage de cinq sous-unités identiques. La plupart des récepteurs GABAA est composée de deux ou plusieurs sous-unités différentes. Le récepteur GABAA majeur du cerveau, par exemple, se compose des sous-unités α1, β2 et γ2 dans une stoechiométrie de 2, 2 et 1 respectivement5,6. Une reconstitution dans un système hôte tels que les ovocytes de Xenopus laevis ou cellules HEK293 offre la possibilité de découvrir rapidement les propriétés pharmacologiques des récepteurs.

Les propriétés pharmacologiques des composés sont ensuite explorées avec des enregistrements extracellulaires de tranches de cerveau7. Cette méthode permet une exploration de l’effet des composés sur la neurotransmission et fournit un moyen efficace pour confirmer les effets fonctionnels des composés déterminés dans des systèmes d’expression hétérologue au niveau des récepteurs natifs dans l’ensemble environnement neuronal. Neurotransmission GABAergique peut aussi être évaluée au niveau moléculaire en mesurant les effets des composés courants postsynaptiques inhibitrice (CISP)8. Mais le protocole utilisé ici et basées sur des enregistrements de serrage patch germes entiers dans des tranches de cerveau est plus élaboré et conduit à un débit inférieur.

Enfin, les forces et les faiblesses de l’ in vitro screening cascade utilisé pour l’identification de ligands sélectifs α5β3γ2 sont examinées dans la perspective des différentes techniques et leurs limites intrinsèques. Ce travail devrait fournir des experts et non experts dans le domaine des récepteurs GABAA un examen utile de l’ensemble des différentes in vitro des approches permettant de s’attaquer à la découverte de nouveaux modulateurs de ces canaux ligand-gated ion.

Protocol

Xenopus laevis sont logés et manipulés conformément aux lignes directrices Animal Canton de Genève. 1. radioligands Préparation de la plaque d’essai Préparer le 1,5 L de tampon avec 5 mM de KCl, 1,25 mM CaCl2, 1,25 mM MgCl2, 120 mM NaCl et 15 mM Tris ; ajuster le pH avec du HCl à 7,4. Préparer les composés à tester à 50,76 µM (par exemple, un composé à 10 mM dans un 980 µL de tampon de dosage dans un tube de microcentrifuge de 5 µL). Mélangez-les bien en utilisant une machine de vortex à grande vitesse pour 2 à 5 s. Préparer une dilution préalable de la flumazénil composé de référence en pipettant : 1 l de ce composé (10 mM) à 1 970 µL de tampon. Mélangez-les bien en utilisant une machine de vortex à grande vitesse pour 2 à 5 s. Diluer une solution mère de flumazénil [3H] avec le tampon à 4 ° C à 4 nM dans un tube en polypropylène 50 mL. Pipetter 50 µL/puits de tampon dans les colonnes 1 et 3-11 d’une microplaque 96 puits comme illustré dans le schéma représenté à la Figure 2. Pipetter 73,2 µL des composés dilués à 50,76 µM (voir étape 1.1.2) dans la colonne 12 de la plaque. Diluer chaque composé, à l’aide d’une progression géométrique sur 9 étapes (1E-10 – 1E–06 M), avec un volume de transfert µL 23,12 et le remplissage colonnes 3 – 11. Bien mélanger la dilution. Changer l’embout après chaque dilution. Diluer les membranes cellulaires Décongeler les membranes des cellules déjà isolés d’un récepteur de GABAA humain sur-exprimant HEK293 (0,025 – 0,15 mg/mL) pour obtenir 80 mL à température ambiante (RT) et transférer la suspension dans le tampon à 4 ° C. Resuspendre la solution membrane encore à 4 ° C avec un homogénéisateur de tissu pour 30 – 40 s à 10 000 – 12 000 tr/min. Diluer le diazépam pour le contrôle de la liaison non spécifique (NSB) Diluer une solution mère de diazépam de 4 mM avec le tampon à une concentration de 40 µM dans 5 mL. Commencer la réaction Distribuer 50 µL de 4 nM [3H] flumazénil dans chaque puits de la plaque à 96 puits et conservez-le dans un récipient d’eau glacée. Ajouter 100 µL de la préparation de membranes de sous-type de récepteur GABAA pour avoir une teneur en protéine de 0,5 mg/mL. Pipetter 50 µL de 40 diazépam µM dans la colonne 2. Incuber la plaque pendant 1 h sur la glace. Ajouter 50 µL de tampon dans chaque puits d’une plaque 96 puits filtre de séparation par membrane ultérieures et de mesure de la radioactivité et arrêter la réaction par la suite. Arrêter la réaction Préparer un tampon de lavage avec 50 mM Tris-HCl, pH 7,4. Filtrer la solution avec une abatteuse de cellule de 96 puits. Laver la plaque 3 x avec 300 µL de tampon de lavage glacee / puits. Sceller la partie inférieure de la plaque avec un film plastique et ajouter 40 µL de cocktail pour liquide de scintillation scintillation comptant chacune bien et essuyez-le avec de l’éthanol 70 %. Secouez légèrement la plaque pendant au moins 1 h à température ambiante. Laissez reposer pendant au moins une heure à température ambiante. Mesurer la radioactivité (en CPM) en plaçant la plaque sur un compteur à scintillation. Permettre une mesure pendant 3 min / puits. Analyse des données Déterminer que la moyenne pour les 8 réplique de liaison non spécifique (NSB) et de la fixation totale (CT) aussi bien en ce qui concerne les doublons ou réanalysés des échantillons. Calculer la % de fixation spécifique (SB) pour la moyenne de l’échantillon selon l’équation suivante :Ici,total SB = la moyenne to moins le moyen les ONN. Terrain en abscisse le SB % versus en ordonnée les concentrations de l’inhibiteur. Ajuster les données à l’aide de l’équation d’analyse de concurrence site unique :Ici,y = le % de SB,A = le minimum y,B = la valeur maximale y,C = la ci50,X = le journal10 de la concentration du composé concurrente,D = pente de la courbe (un coefficient de Hill). Calculer l’affinité (Ki) en utilisant la moitié de la concentration inhibitrice maximale (IC50), la constante de dissociation (Kd) de flumazénil [3H] sur les membranes respectives9et la concentration de la [3H] flumazénil dans le dosage selon l’équation suivante à l’aide de données : 2. enregistrements dans des ovocytes de Xenopus et Expression du récepteur Ovaires récolte et préparation des ovocytes Préparer la solution stérile de Barth avec 88 mM NaCl, KCl 1 mM, 2,4 mM NaHCO3, 10 mM HEPES, 0,82 mM MgSO4.7H2O, 0,33 mM Ca (NO3)2.4H2O et 0,41 mM CaCl2.6H2O, à pH 7,4 , additionné de 100 unités/mL de pénicilline, 100 µg/mL de streptomycine et 0,25 µg/mL d’amphotéricine b. Préparer le milieu de x OR2 1 (aucun CaCl2) avec 88,5 mM NaCl, KCl 2,5 mM, 5 mM HEPES, 1 mM MgCl2.6H2O, à un pH de 7,4. Sacrifice une Xenopus Laevis femelle par une anesthésie profonde pendant 20 min en refroidi méthanesulfonate de tricaïne (à une concentration de 150 mg/L, ajusté à pH 7,4) et bicarbonate de sodium (300 mg/L) suivie par décapitation. Récolter les ovaires rapidement avec des ciseaux propres et forceps et placez-les dans 2 plats de Pétri (10 cm) contenant 40 mL de 1 x solution de Barth et antibiotiques/antimycosiques. Stocker les ovaires non dissociées jusqu’à 2 semaines dans une solution Barth à 4 ° C. Pour la dissociation, couper les ovaires avec une lame de rasoir propre en petites fractions (1 – 2 cm3) et incuber eux dans 50 mL d’OR2 moyen sans CaCl2 (OR2-noCaCl2) contenant 0,2 % collagénase (Type I) à 17 et 19 ° C dans un cône de 100 mL fiole avec une agitation lente pendant 4 à 5 h. vérifier que le barreau magnétique est placée environ 3 à 5 cm au-dessus du fond de la fiole de spinner pour ne pas écraser les ovocytes. Après 4-5 h, vérifier que la plupart des ovocytes est libérée de leur follicule (c.-à-d., ils nagent individuellement). Laver 5 x 200 ml d’OR2 additionné de 1,8 mM CaCl2. Transférer la defolliculated ovocytes à boîtes de Pétri (10 cm) rempli de solution de Barth et antibiotiques/antimycotiques et garder au moins une nuit à 17 ° C avant l’injection d’ADNc ou ADN messagère. Le jour suivant, sélectionnez cette option, au titre de jumelles, un ovocyte en bonne santé présentant une claire et distincte animaux contre un poteau de vegetal (brun foncé pour le pôle animal contre jaune clair pour le pôle végétal). Utiliser des pipettes Pasteur propres et jeter les ovocytes un par un dans une plaque de puits 96-injection conique stérile.NOTE : Aucun soin particulier n’est nécessaire dans le placement des ovocytes pour les injections de l’ARNm ; considérant que, pour les injections de l’ARNC, il est indispensable d’orienter les ovocytes avec le pôle animal vers le haut. ARNm ou cDNA injection automatique Synthétiser les ARNm à l’aide d’un kit disponible dans le commerce en suivant les instructions recommandées. Nettoyer les instruments et la table avec de la RNase et porter des gants de protection appropriés.NOTE : La qualité de l’ARNm est déterminant pour obtenir une bonne expression, et il est indispensable de prévenir la dégradation de l’ARNm lors de la procédure d’injection. Préparer à l’aide d’un kit disponible dans le commerce des ADNc et dissoudre la quantité désirée dans l’eau Watercooling à une concentration de 0,2 µg/µL. Injecter 10 à 50 nL de solution d’ARNm à une concentration de 0,2 nL µg/µL ou 10 de cDNA de solution à une concentration allant de 0,02 à 0,2 µg/µL, de préférence en lots de 95 ovocytes. Pour membrane protéines nécessitant plusieurs sous-unités (c.-à-d., les récepteurs de GABAA α1β2γ2 hétéromérique), mélangez l’ADNc du ratio désiré ARNm correspondants (p. ex., 1:1:1 ou 1 / 10:1). Maintenir l’ovocyte à 17 ° C pour empêcher l’expression des protéines de choc thermique par les ovocytes ; stocker la microplaque dans un espace de rangement thermo-contrôlée. Dissoudre les composés d’essai qui ont été testés positifs dans le test de liaison chez OR2 à 0,1 – 1 000 µM pour les enregistrements électrophysiologiques et les éliminer dans une plaque en polypropylène à fond plat de 96 puits. Plasmides pour l’expression Suivre les notices des kits disponibles dans le commerce pour la synthèse de l’ARNm avec des promoteurs T7 ou T6 bactériennes et faire 20 µL d’une solution à 0,2 µg/µL en eau exempte de RNase. Préparer au moins 20 µL d’une solution contenant un vecteur d’expression eucaryote pour l’expression de la cDNA, généralement à 0,2 µg/µL, dissous dans l’eau Watercooling. Microinjection dans l’ovocyte et la visualisation de sa qualité Injecter 10 à 50 nL de la solution contenant le plasmide (voir étape 2.3.1 ou 2.3.2) à l’aide d’une aiguille de la micro-injection de verre avec un diamètre allant jusqu’à 100 µm monté sur un micromanipulateur équipé d’un système d’éjection de pression ou avec un système à injection automatisée.Remarque : Dans l’exemple abordé ici, les ovocytes sont injectées par lots de 95 avec un système automatisé conçu pour fonctionner avec les ADNc ou ADN messagère. Remplir l’aiguille d’injection de 1 µL d’un colorant comme le bleu de méthylène à 1 % et injecter les ovocytes à l’aide de la procédure standard (que ce soit dans le noyau de cDNA ou dans le cytoplasme de l’ARNm). Disposer les ovocytes injectés pendant environ 1 min dans l’eau bouillante. Couper les ovocytes en deux avec une lame de rasoir sous les jumelles.Remarque : Le colorant soit localisé, comme illustré à la Figure 3E, ce qui permet une observation précise de l’injection. Enregistrements de deux électrodes de voltage clamp Placer la plaque bien contenant les ovocytes sur l’automatisme, qui utilise le principe illustré à la Figure 4.Remarque : À la différence du système à pince patch illustré à la Figure 5, le potentiel vrai de membrane de la cellule est lu par l’électrode tension. Programmer le système d’enregistrement automatisé à l’aide de l’interface à base d’icônes avec, par exemple, le schéma illustré à la Figure 6 pour la détermination de la relation de l’activité de concentration. Ajustement de courbe Analyser les résultats en utilisant le logiciel approprié, à l’aide de la courbe d’activation concentration illustré, tracer l’amplitude du courant en fonction du logarithme de la concentration d’agoniste. Vous pouvez observer la courbe sigmoïde qui peut être équipée ultérieurement l’équation empirique de la colline sous la forme :Ici,Y= la fraction du courant évoqué,EC 50 = la concentration pour une activation de 50 %,x = la concentration du composé,nH = le coefficient de Hill ou la coopérativité apparente. Normaliser les courants à une unité en divisant l’amplitude de chaque réponse par rapport à la valeur enregistrée la plus forte concentration d’analyser les données obtenues à partir d’une série de cellules. Déterminer la moyenne et les écarts-types et se rendre compte de l’ajustement de la courbe à l’aide de logiciels disponibles de façon standard. 3. électrophysiologiques enregistrements dans des tranches de cerveau NOTE : Les tranches d’hippocampe de rat sont préparés conformément aux directives nationales et institutionnelles. Préparation de tranches de l’hippocampe Préparer la dissection artificiel céphalo-rachidien (dACSF) avec 124 mM 124 de NaCl, KCl 2,5 mM, 1,25 mM KH2PO4, 2 mM MgSO4.7H2O, 2,5 mM CaCl2 2 H2O, 26 mM NaHCO3, 10 mM de glucose et 4 mM saccharose, gazé dans la bouteille avec un mélange de 95 % O2 et de 5 % de CO2. Préparer l’enregistrement artificiel céphalo-rachidien (rACSF) avec 124 mM NaCl, KCl 5 mM, 1.25 mM KH2PO4, 2 mM MgSO4.7H2O, 2,5 mM CaCl2 2 H2O, 25 mM NaHCO3et 10 mM de glucose gazés dans la bouteille avec un mélange de 95 % O2 et de 5 % de CO2. Anesthésier les rats à l’aide d’un mélange de 2,5 % isoflurane et de l’oxygène pur et les décapiter. Couper le cuir chevelu, suit la ligne médiane avec une belle paire de ciseaux. Couper le crâne le long de la ligne médiane sans endommager les tissus sous-jacents. Retirez le crâne avec des pincettes et utilisez une spatule fine pour évider le cerveau. Placer le cerveau dans la solution de dACSF gazés à RT et disséquer la formation hippocampique gauche avec une spatule fine. Couper en tranches transversales (400 µm d’épaisseur) de la partie moyenne de l’hippocampe avec un hachoir de tissus et de les transférer à la chambre d’enregistrement à l’aide d’une brosse de peinture. Maintenir les tranches à ta pendant 45 min. Perfuse les tranches avec le rACSF gazé à 35 ° C et à un taux de 1,5 mL/min. de la bulle la solution avec un mélange de 95 % O2 et de 5 % de CO2.NOTE : Après cette étape, les tranches sont prêtes pour les expériences électrophysiologiques. Enregistrement de spike seule population Déposer une tranche de cerveau dans la chambre de microscope-monté. Perfuse la tranche à raison de 3 mL/min avec rACSF. Tirez une micropipette de verre borosilicaté avec l’extracteur de pipette ayant une résistance de ~ 2 MΩ.Remarque : Cette micropipette est utilisée comme une électrode d’enregistrement et est électriquement raccordée à l’amplificateur. Remplissez la micropipette avec une solution contenant 2 M NaCl et placez-le dans le porte-pipette de l’amplificateur. Position la micropipette d’enregistrement dans la strate pyramidale dans la région CA1 de l’hippocampe tranche en utilisant le micromanipulateur droit.Remarque : L’emplacement est schématiquement représenté à la Figure 7. Placez une électrode bipolaire isolé de platine/iridium dans la porte sur la gauche micromanipulateur.Remarque : Cette électrode est utilisée comme l’électrode de stimulation et est reliée électriquement au générateur de stimulus. Positionner l’électrode de stimulation dans les collatérales de Schaffer dans la région CA1 de l’hippocampe tranche en utilisant le micromanipulateur droit.Remarque : L’emplacement est schématiquement représenté à la Figure 7. Fournir une impulsion de courant à l’électrode de stimulation à l’aide du générateur d’impulsion toutes les 30 s (durées de 100 µs, à partir de 10 µA) et d’augmenter progressivement l’intensité de stimulation jusqu’à ce qu’apparaisse un pic de population (PS). Régler la puissance de stimulation pour évoquer un PS correspondant à 45 % de l’amplitude maximale qui peut être obtenue. PSs sont filtrés à 2,4 KHz et numérisés à 20 KHz à l’aide de l’amplificateur de signal. Inhibition d’impulsions pairées Préparer les tranches de cerveau (étape 3.1) et procédez comme décrit précédemment (pas 3.2.1–3.2.7). Fournir deux impulsions de courant (100 µs durées à un intervalle de 20 ms) à l’électrode de stimulation, toutes les 30 s en utilisant le générateur d’impulsion. Régler l’intensité de stimulation pour évoquer un PS correspondant à 45 % de l’amplitude maximale. Composé de tests Préparer des dilutions des composés qui seront essayés dans le FSCA gazé afin que la concentration finale de DMSO non supérieure à 0,1 %. Ajouter DMSO à la solution de contrôle à la même concentration que dans le composé en solution. Enregistrer un single (étape 3.2) ou un jumelé-pulse (étape 3.3) ch évoquée par les stimulations collatérales de Schaffer toutes les 30 s pendant au moins 30 min. La forme du PS doit être stable pendant cette période de référence. Préparer un bécher avec gazés rACSF contenant une concentration fixe de la substance à tester. Perfuse l’hippocampe tranche avec cette solution alors qu’il enregistrait encore le PS seul ou impulsions pairées. Évaluer la récupération de l’effet composé en perfusant la tranche de pain avec rACSF gazé sans le composé.Remarque : Pour les effets réversibles, le PS revient à sa forme initiale observée au cours de la période de base avant l’application de composés. Analyse des données Moyenne les traces du PS enregistrement au cours de l’expérience dans des blocs de 4 en utilisant le logiciel d’analyse de données. Mesurer les amplitudes PS des traces en moyenne. Normaliser les amplitudes en pourcentage des valeurs de base enregistrées 10 min avant la perfusion d’un composé. Exprimer les données en moyenne ± SEM

Representative Results

Liaison :L’essai in vitro avec les membranes cellulaires est utilisé pour identifier les humains GABAA α5β3γ2 receptor ligands sélectifs obligatoire sur le site allostérique de la γ2 BZD contenant des récepteurs. Les cellules HEK293 transitoirement transfectées exprimant l’humain GABAA α5β3γ2, α1β3γ2, α2β3γ2 et α3β3γ2 récepteurs servent à préparer les membranes pour ce dosage. L’effet des ligands potentiels est détectée en mesurant la scintillation de flumazénil [3H] lié aux récepteurs membranaires (une inhibition de la liaison de flumazénil [3H]). Courbes de liaison sont alors générées afin d’évaluer la sélectivité des composés pour un récepteur GABAA spécifique comme dans l’exemple avec RO4938581 (Figure 8). Figure 9 résume le profil de plusieurs composés de référence y compris celui de la α5 sélective GABAA négatif allostérique modulateur spécifique des récepteurs, RO49385819, qui ont été générés à l’aide de la méthode de liaison. Enregistrements dans Xenopus ovocytes :L’expression des récepteurs GABAA par exemple le complexe α5β3γ2 rendements courants robustes en réponse à l’exposition de GABA. Enregistrements de serrage de tension typique obtient dans un ovocyte exprimant la α5β3γ2 humain en réponse à brèves impulsions de GABA (30 s) allant jusqu’à 300 µM sont indiquées à la Figure 6. Dans cette expérience, les différentes concentrations de GABA ont été éliminées dans la plaque à 96 puits et les réponses ont été évoqués par le déplacement de la cellule dans un endroit bien spécifique. Le GABA a été lavé par la cellule de retour à la chambre de perfusion central et en appliquant une perfusion de solution de contrôle en activant la pompe péristaltique correspondante. Le déroulement du programme utilisé pour la détermination de la courbe d’activation de concentration est illustré dans la Figure 6A. Réalisé entièrement automatiquement, ces données illustrent la qualité des enregistrements qui peuvent être obtenues dans des ovocytes de Xenopus et le haut niveau de l’expression des récepteurs a obtenu quelques jours après l’injection de l’ARNm. Les expériences, menées à des combinaisons de récepteurs différents, donnent une série de EC50s, qui est la concentration nécessaire pour activer la moitié des récepteurs GABA. Une parcelle de l’EC50de valeurs sur un graphique de l’araignée, comme illustré à la Figure 10, fournit une comparaison rapide des propriétés du récepteur et l’influence de la composition de la sous-unité. Pour examiner l’effet d’un modulateur allostérique négatif ou positif (NAM ou PAM), il est nécessaire de comparer la réponse évoquée par une impulsion d’essai agoniste (GABA), dans le contrôle, puis en présence du modulateur. Un protocole expérimental efficace pour mener une telle expérience est illustré à la Figure 11. La réponse de la cellule à une concentration de référence de GABA est préalablement déterminée et la séquence est répétée en appliquant la même concentration de GABA, puis par une application conjointe de la GABA plus le modulateur. Un complot des deux réponses superposées révèle, dans cet exemple, une inhibition marquée due à la présence du modulateur. Une quantification de l’effet modulateur est facilement obtenue en calculant le rapport entre la réponse évoquée en présence du modulateur versus le contrôle et les résultats peuvent être tracées sous la forme d’un complot de la chaleur. Les données présentées à la Figure 12 illustrent l’intrigue de chaleur correspondant aux enregistrements de trois ensembles de données obtenus pour 96 composés. Après l’identification de composés qui sont suffisamment actifs, il est souvent indispensable d’évaluer si ces molécules sont actifs à d’autres combinaisons de récepteur. Dans le cas du récepteur GABAA , 19 gènes codant pour les sous-unités différentes ont été identifiées, et on sait qu’un récepteur fonctionnel peut résulter d’une Assemblée de multimères de sous-unités différentes (voir Knoflach, Hernandez et Bertrand10 pour un examen). Bien que le rendement de sous-unités et combinaisons multiples un vaste répertoire de récepteurs des sous-types qui peut nécessiter un grand nombre de dépistage compteur à exécuter, il est souvent possible de se concentrer d’abord sur le plus abondant sous-type qui, dans le cas de la GABAA récepteurs, est la composition de α1β2γ2. Expériences réalisées tête à tête avec l’expression de, par exemple, α5β3γ2 et α1β2γ2 dans le même lot d’ovocyte donnent une bonne comparaison des effets respectifs d’une molécule donnée. Les résultats typiques obtenus dans trois cellules pour α5β3γ2 et α1β2γ2 sont indiqués dans la Figure 13, qui illustre la modulation positive préférentielle d’une molécule à α5β3γ2. Le protocole expérimental, illustré à la Figure 11 est bien adapté pour la caractérisation d’une activité de PAM. Dans ce protocole, le composé qui est testé est appliqué conjointement avec l’agoniste à augmenter progressivement les concentrations. Pour éviter les effets cumulatifs possibles causées par plusieurs applications sur la même cellule, une cellule nouvelle et naïve est mesurée pour chaque point de données. Une mesure de l’amplitude de la réponse enregistrée avec l’agoniste seul et ensuite lors de l’application composée donne un ratio qui quantifie l’effet PAM ou NAM. Résultats typiques obtenus à α1β2γ2 et α5β3γ2 du diazépam sont indiquées dans la Figure 14, révélant une sensibilité apparente de la α5β3γ2 c’est environ 10 fois supérieur à cette combinaison de récepteur. Ces valeurs sont en bonne corrélation avec les données publiées11. Comme on pense que le site de benzodiazépine est constitué par l’interface entre le γ2 et sa sous-unité α adjacentes-12 /14, la sensibilité de la α5β3γ2 suggère une affinité préférentielle diazépam pour γ2-α5 sur γ2-α1. La possibilité d’exprimer des combinaisons de différents récepteurs combinés avec une caractérisation fonctionnelle efficace ouvre de multiples façons de découvrir les déterminants des propriétés PAM et leur implication pour les effets physiologiques et pharmacologiques. Tranches de cerveau hippocampe :Les expériences avec des tranches de cerveau hippocampe de rat sont effectuées afin de valider le profil pharmacologique des composés identifiés dans des essais in vitro dans un modèle de récepteur native. Les sous-types de récepteurs GABAA prédominantes exprimées dans les cellules pyramidales de l’hippocampe sont α1β2/3γ2, α2β2/3γ2 et α5β2/3γ2, qui sont tous modulé par des benzodiazépines (BDZs)15. Impulsions pairées inhibition est un paradigme qui peut révéler l’excitabilité circuit hippocampe en testant le changement dans la réponse du second des deux stimuli électriques jumelés livré apart 20 ms. Le changement de la deuxième réponse est en raison de la rétroaction GABAergique par les interneurones qui innervent les cellules pyramidales couche16-18. Comme illustré à la Figure 7, dans la situation de contrôle, la deuxième réponse de deux stimuli pairés est inhibée en raison d’une inhibition GABAergique. Quand cette inhibition est réduite en perfusant la tranche avec la β-CCM, un NAM non sélectif, la deuxième réponse des deux stimuli appariés est inhibée à un degré beaucoup moindre. Ce paradigme expérimental est sensible aux composés sélectifs pour un récepteur GABAA contenant la sous-unité α5. Figure 1 : Stratégie de dépistage. Un médicament typique projection voie commence par le criblage à haut débit dans lequel les grandes bibliothèques de composés sont testées pour un objectif précis. Après l’identification du candidat principal, commence le travail de chimie médicinale. Pendant cette phase, chimistes étudiera et affiner les molécules en effectuant une modification structurale pour répondre aux critères souhaités, tels que la sélectivité de la cible, la pénétrance de cerveau, stabilité, dégradation etc. au cours de cette phase cruciale, il est essentiel pour déterminer si les modifications chimiques n’ont pas modifié les propriétés de la molécule et d’affiner pour le candidat le mieux placé. L’étape suivante consiste à identifier promettant quelques composés et leur donner les prochaines étapes incluent la sécurité, tolérance, etc. Note qu’électrophysiologie est indiqué comme dosage fonctionnel mais qu’autres méthodes, y compris la fluorescence de calcium des essais ou des colorants sensibles de tension, peut servir comme solution de rechange. Ces méthodes de ce dernier sont également utilisés pour des tests de haut-débit comme une substitution pour les essais de liaison. S’il vous plaît cliquez ici pour visionner une version agrandie de cette figure. Figure 2 : Mise en page d’un 96 puits plaqué utilisés pour des expériences de liaison. Colonne 1 est utilisé pour la mesure de la fixation totale et colonne 2 pour les mesures non-spécifiques. Lignes A à H sont remplis de 4 différents composés dans l’augmentation des concentrations (colonnes 3 à 12), chacun des composés des doublons (c’est-à-dire composé 1 en lignes A et E, composé de 2 lignes B et F, etc.) représentés dans la mise en page avec des couleurs différentes. S’il vous plaît cliquez ici pour visionner une version agrandie de cette figure. Figure 3 : À l’aide d’un système automatisé de microinjection. (A) A système XYZ précis, dans lequel une aiguille d’injection de verre remplie de liquide contenant le plasmide d’intérêt, est automatiquement fourré dans les ovocytes. (B) ce panneau montre la plaque 96 puits conique-fond dans lesquelles (C), les ovocytes sont automatiquement injectées. (D), ce tableau illustre le principe de l’injection. Pour la nucléaire injection, l’aiguille pénètre l’ovocyte légèrement plus profond que le noyau, comme indiqué dans le groupe B. Ensuite, l’aiguille est retirée du noyau (voir tableau C) avant l’injection (voir panneau D). (E) d’évaluer la qualité de l’injection, l’aiguille peut être rempli avec un colorant et « cuit » les ovocytes peuvent être coupés en deux. S’il vous plaît cliquez ici pour visionner une version agrandie de cette figure. Figure 4 : Le principe d’électrode deux voltage clamp automatisé. Le principe est basé sur la préparation oscillant de puits plutôt que d’appliquer le liquide dans la perfusion. (A), le côté gauche du panneau représente l’arrangement permettant l’enregistrement dans un ovocyte de Xenopus avec les deux électrodes et le petit panier qui maintiendra une gouttelette de liquide autour de la préparation pendant le mouvement d’un échantillon à l’autre. Une photo de l’ovocyte placé dans le panier avec les deux électrodes est indiquée sur le côté droit. (B), ce tableau montre une représentation schématique de l’électrophysiologie « upside down », principe d’enregistrement. (C), ce panneau montre la disposition de l’ovocyte, plat composé et station de lavage sur la table d’enregistrement. S’il vous plaît cliquez ici pour visionner une version agrandie de cette figure. Figure 5 : Bride de tension deux électrodes d’enregistrement versus patch clamp de. Une pince de tension typique de deux électrodes d’enregistrement pour les ovocytes (panneau de gauche) est comparée à la configuration de serrage patch utilisée sur une lignée cellulaire (panneau de droite). Notez la différence de taille entre les ovocytes qui sont environ 1 mm de diamètre contre les cellules qui sont environ 20 µm. Dans l’étau de la tension de deux électrodes, le potentiel de membrane de l’ovocyte est comparé à la tension de tenue souhaitée et la différence de signal est injectée dans l’électrode de courant. Dans un enregistrement par patch clamp, il est supposé que la résistance de l’électrode de patch clamp est négligeable par rapport à la résistance de la membrane et, par conséquent, que la tension imposée par l’amplificateur est alimentée fidèlement à la membrane cellulaire19. L’image montre une perfusion à incandescence liquide dans lequel les deux canaux d’un tube (thêta) sont remplis avec, d’une part, une solution de contrôle et, d’autre part, avec la solution contenant le médicament20,21. S’il vous plaît cliquez ici pour visionner une version agrandie de cette figure. Figure 6 : Relation activation concentration les récepteurs humains α5β3γ2. (A) la séquence contrôlant le système automatisé se compose d’une série d’icônes et définit le protocole expérimental pour la détermination de la relation d’activation de concentration. Dans les étapes 1 à 3, comme le montre ce panneau, le système charge l’ovocyte de la plaque dans le panier de la mesure. Le courant de fuite est mesuré à l’étape 2 et, si cette valeur dépasse les critères désirés, la cellule est automatiquement modifiée (étape 3). Après une période de stabilisation (étape 4), la réponse de l’ovocyte à une concentration de GABA de référence est mesurées (étapes 5 à 8). Ovocytes affichant plus grands que 1 µA courants sont conservés pendant la mesure. Dans les étapes 11 à 13, la cellule est contestée par différentes concentrations de GABAA et le processus répète elle-même la quantité désirée de concentrations (étape 14) et cellules (étape 15). (B) ce panneau montre les courants typiques induites par une série d’applications de GABA brefs (30 s) appliquées dans l’ordre de plus en plus. Le moment de l’application composé est indiqué par les barres. (C), un terrain du courant entrant de pic en fonction du logarithme de la concentration de GABA donne la courbe d’activation de concentration qui est facilement installée par l’équation empirique de la colline, avec une courbe continue, un EC50 à environ 11 µM et une colline coefficient de 1,3. Courants enregistrés dans 8 cellules ont été normalisées à une unité de la réponse maximale évoquée. Les barres indiquent l’erreur-type de la moyenne. S’il vous plaît cliquez ici pour visionner une version agrandie de cette figure. Figure 7 : Β-CCM, un NAM GABAA réduit les impulsions pairées inhibition en tranches hippocampal. (A), ce tableau montre une représentation schématique d’une tranche de hippocampe de rat. Les collatérales de Schaffer (Sch C) originaires du projet CA3 d’axones des cellules pyramidales sur l’arborisation dendritique des neurones pyramides CA1. Micropipettes ont été placés dans la strate pyramidale (str pyramidale) pour enregistrer les pointes (PS) de la population et stratum radiatum (str radiatum) pour des enregistrements dendritiques des potentiels postsynaptiques excitateurs (PPSE) de champ. L’électrode de stimulation a été placé dans les collatérales de Schaffer. (B) ce panneau montre PSs évoquées par des stimuli pairés appliqués par le biais de la même électrode stimulante à un intervalle de 20 ms. La réponse de la population au second stimulus (PS2) est d’amplitude plus faible que celle de la réponse à la première stimulation (PS1). (C) PSs ont été enregistrées en l’absence (barre noire) et la présence de β-CCM, un NAM non sélectif du récepteur GABAA (barre verte). Β-CCM a augmenté l’amplitude de la PS2 deuxième en bloquant partiellement toute inhibition GABAergique de feed-forward. Les barres indiquent l’erreur-type de la moyenne et *** que les données sont hautement significatives avec un p < 0,01. S’il vous plaît cliquez ici pour visionner une version agrandie de cette figure. Figure 8: liaison typique résultats obtenus lors d’un essai (inhibition ou déplacement) concurrentiel. Courbes de liaison sont générés à partir de qui la ci50 et le Ki peuvent être déterminé. IC50 est la concentration de ligand concurrent qui déplace de 50 % de la liaison spécifique du radioligand, et Ki (la constante d’inhibition d’un médicament) est la concentration de ligand concurrent qui occuperait 50 % des récepteurs si aucun radioligand étaient présents. Le Ki est calculé à partir de la ci50 à l’aide de l’équation de Cheng-Prusoff :S’il vous plaît cliquez ici pour visionner une version agrandie de cette figure. Figure 9 : Liaison compétitive de déplacement a été réalisée avec des ligands contraignant aux principaux sous-types de récepteurs GABAA . Affinités (nM) ont été mesurées par dosage [3H] liant le flumazénil et membranes de cellules HEK293 transfectées de manière transitoire avec différentes combinaisons humains de la sous-unité du récepteur GABAA . La représentation de l’histogramme illustre clairement la différence de sensibilité observée pour le RO493851 composé avec le plus bas Ki les récepteurs α5β3γ2. S’il vous plaît cliquez ici pour visionner une version agrandie de cette figure. Figure 10 : Sensibilité différentielle GABA des récepteurs. Une parcelle du récepteur GABA EC50 sur une parcelle de l’araignée et une représentation de la composition de la sous-unité putatif fournissent des moyens efficaces pour comparer le rôle des sous-unités différentes. Notez que l’introduction des sous-unités γ2 est associée à une réduction de la sensibilité des récepteurs. S’il vous plaît cliquez ici pour visionner une version agrandie de cette figure. Figure 11 : L’effet d’un modulateur de palpage. (A), ce panneau illustre la séquence de l’icône utilisée pour le contrôle de l’automatisme. Notez que les deux icônes (A/D) correspondant à l’enregistrement dans le contrôle (vert) et Pendant l’exposition de modulateur (rouge). (B), ce panneau affiche typiques courants enregistrés dans une cellule exprimant le récepteur de GABAA lors d’une telle séquence. Pour évaluer les effets d’un modulateur, une séquence de mesure tout d’abord la réponse induite par l’exposition à une concentration fixe de GABA (trace verte), suivie de l’exposition tout d’abord au GABA et ensuite au GABA plus le modulateur (trace rouge), a été réalisée. Positionner les curseurs en forme de croix (cyan et bleu) délimite les mesures, et la Croix Bleue indique la différence maximale entre les deux conditions d’enregistrement. Le rapport entre la condition contrôle et modulateur est calculé automatiquement dans le logiciel d’analyse. S’il vous plaît cliquez ici pour visionner une version agrandie de cette figure. Figure 12 : Terrain de chaleur avec trois répétitions. Ce panneau montre une parcelle de chaleur correspondant à trois répétitions du modulateur effets obtenus pour 96 composés dans les récepteurs de GABAA α5β3γ2 humaine. Les ratios de la réponse de test sur le contrôle comprise entre 0,5 et 1,2 étaient considérés comme non significativement différente de la commande et sont représentés par un point vert. Taux inférieur à 0,5 est considérés comme représentant un effet inhibiteur et est représentés par des points bleus. Les rapports ci-dessus 1.2 sont considérés comme améliorer l’intervention et sont représentés par des points rouges. Notez la similitude de configuration entre les trois enregistrements indépendants. S’il vous plaît cliquez ici pour visionner une version agrandie de cette figure. Figure 13 : Contrer la projection à α1β2γ2. (A), ce panneau affiche une représentation d’une organisation de sous-unité putatif. Les panneaux suivants montrent (B-D) une évaluation des effets d’un modulateur allostérique positif à l’humain α5β3γ2 etF-Hà α1β2γ2, en utilisant des concentrations comparables de GABA et similaires (100 µM) de la modulateur, qui mettent en lumière la spécificité du composé testé dans ces expériences. (E), ce tableau montre également une représentation d’une organisation de sous-unité putatif. S’il vous plaît cliquez ici pour visionner une version agrandie de cette figure. Figure 14 : Composition de sensibilité et de récepteurs de PAM. La détermination des effets d’une série de concentrations d’effets de diazépam (A-D) à α1β2γ2 etE-Hα5β3γ2 récepteurs révèle presque une différence de 10 fois en affinité apparente. Notez également l’influence de la composition de la sous-unité sur le cours de temps de réponse avec une désensibilisation plus rapide au niveau des récepteurs α1β2γ2 (voir, par exemple, les panneaux D et H). Notez que comme les α1β2γ2 et récepteurs α5β3γ2 affichage des affinités différentes pour GABA (Voirégalement aussi Figure 10), la concentration d’agoniste a été réglée entre les deux récepteurs dans un intervalle d’activation comparables. (I) ce panneau représente une parcelle du pli augmentation une amplitude du courant normalisé à l’unité par rapport à la condition de contrôle. S’il vous plaît cliquez ici pour visionner une version agrandie de cette figure. Figure 15 : Plasmide d’expression y compris promotor T7 et CMV. Ces panneaux montrent le plasmide pour l’expression dans un ovocyte de Xenopus (panneau supérieur droit) et dans une lignée cellulaire. Le panneau de droite bas illustre une cellule HEK-293 typique transfectée avec un plasmide contenant également le gène codant pour une protéine fluorescente verte (GFP) avec l’électrode d’enregistrement patch-clamp. S’il vous plaît cliquez ici pour visionner une version agrandie de cette figure.

Discussion

Le développement de nouveaux composés actifs à un canal d’ion de ligand-dépendants tels que les récepteurs GABAA nécessite l’utilisation d’approches multiples. En règle générale, la première étape est souvent réalisée à l’aide d’essais de liaison ; Toutefois, ces mesures ne suffisent pas à caractériser l’activité physiologique de l’enceinte ou sa pharmacologie précis. En particulier, un composé qui se lie à un récepteur peut améliorer ou inhiber sa fonction ou même ne produire aucun effet fonctionnel (se taire) (c.-à-d., liaison au récepteur sans modifier sa fonction). Ainsi, un test fonctionnel est nécessaire pour une caractérisation complète composée.

Tests de liaison:
Le principal avantage de l’essai de liaison est qu’il peut être mené efficacement sur un grand nombre d’échantillons allant jusqu’à plusieurs milliers, et qu’elle fournit les affinités de liaison pour les molécules actives. Tel que décrit ci-dessus, la première étape consiste à établir une méthode pour l’évaluation des sous-types de récepteurs désirée. Nommément, tandis que la liaison peut être effectuée sur des récepteurs natifs de fractions ou de cerveau entier, une telle méthode permettra d’éviter la détermination des affinités aux sous-types de récepteurs spécifiques. Par conséquent, il est nécessaire d’utiliser des systèmes recombinantes à des molécules de l’écran à la cible souhaitée. De nos jours, une transfection transitoire ou stable des ADNc sous-unité récepteur désiré dans les lignées cellulaires propose une méthode efficace et fiable pour exprimer les sous-types de récepteurs d’intérêt (p. ex., GABAA α5β3γ2). Liaison traditionnelle faire des essais sur l’utilisation de radioligands, mais de nos jours, les techniques sont disponibles qui éviter l’inconvénient de manipulation radioactivité (p. ex., quantitatifs basés sur la fluorescence ligands).

Expression fonctionnelle dans un système hôte :
Pour exprimer les gènes dans un système hôte, la séquence codante d’intérêt doit être insérée dans un plasmide contenant les promoteurs adéquates. En général, pour in vitro le synthèse des ARNm, les promoteurs T7 ou T6 bactériennes sont utilisés. Pour une expression de cDNA, la transcription du gène d’intérêt doit être réglementée par un promoteur eucaryote comme CMV (cytomégalovirus) ou l’équivalent. De nos jours, plusieurs plasmides, y compris les deux promoteurs(p. ex., pUNIV, CMVp-6AC, psf-CMV/T7, pCI-neo, pcDNA), sont disponibles permettant une synthèse in vitro des ARNm ou une expression de cDNA, comme illustré à la Figure 15. Obtient une expression des récepteurs GABAA peut être fidèlement dans des lignées cellulaires ou dans des ovocytes de Xenopus . Les principaux avantages de ce dernier sont l’absence d’une expression de récepteurs endogènes, la simplicité des manipulations et la disponibilité d’un système automatisé pour micro-les injections et les enregistrements. Les procédures décrites dans le présent protocole illustrent l’efficacité de l’automatisme, qui permet l’injection de 96 ovocytes en 7 min et ne nécessite aucune connaissance en micromanipulation. Se souvenant qu’un seul ovaire d’une Xenopus contienne entre 10 000-30 000 ovocytes, il est clair qu’un grand nombre de mesures de la cellule peut être effectué sur une seule préparation. En outre, comme une expression peut être effectuée en utilisant des injections de l’ARNC, les mêmes plasmides contenant les gènes d’intérêt qui sont développés pour les expériences de liaison peuvent être utilisés pour une caractérisation fonctionnelle sans devoir encore la biologie moléculaire manipulations.

Compte tenu de sa grande taille et haute expression superficielle, un seul ovocyte donne un nombre de récepteurs qui correspond approximativement aux cellules confluentes dans une boîte de Pétri de 35 mm. Cependant, une préparation des ovocytes et injection représente une fraction du coût d’une lignée de cellules, comme les expériences ne nécessitent pas un milieu de culture spécifique et manipulations stériles. L’activation d’un seul canal de GABAA donne quelques picoamperes (10-12) et des courants allant jusqu’à des dizaines de microampère (10-6) sont facilement enregistrées dans un seul ovocyte, qui confirme l’activité concomitante de plusieurs millions de récepteurs au cours d’une seule réponse.

Une première étape dans la caractérisation des canaux ioniques ligand-dépendants est souvent la détermination de l’affinité apparente des récepteurs. Les expériences qui doivent être réalisée consistant en appliquant une série d’impulsions d’essai bref agoniste et l’amplitude de l’évoqués actuel ou, dans certains cas, l’aire sous la courbe (AUC) en fonction du logarithme de la concentration d’agoniste de traçage. Comme il est facilement possible de microinject des concentrations différentes de plasmide et ratio dans le même lot d’ovocytes, ce système d’expression est particulièrement approprié pour une telle qualification. En outre, une comparaison de lot a révélé un degré élevé de stabilité des différents EC50s. L’influence de la composition de la sous-unité sur l’affinité apparente du récepteur est facilement visualisé à l’aide d’un complot de l’araignée, comme illustré à la Figure 10.

Les résultats de la pince de tension deux électrodes obtenus dans des ovocytes de Xenopus sont souvent comparés avec les enregistrements réalisés à l’aide d’électrodes de patch clamp. Considérant qu’il irait au-delà de la portée de ce travail d’entrer dans une comparaison détaillée entre ces deux systèmes, quelques points peuvent être examiné. Même si un patch clamp de cellules offre des avantages pour une caractérisation biophysique avec une demande de drogue rapide, ses exigences sont plus complexes que celles des enregistrements deux électrodes dans des ovocytes de Xenopus . Une difficulté première et non négligeable est l’expression d’une protéine donnée avec la nécessité d’une culture de cellules, une transitoire ou transfection stable et l’identification des cellules qui expriment la construction désirée. En outre, il est indispensable d’examiner la contribution possible de l’expression endogène dans la cellule considérée. En outre, un enregistrement de patch clamp exige qu’une personne qualifiée mener la micromanipulation sous un microscope à fort grossissement, alors que cette personne doit aussi effectuer une analyse adéquate pendant l’expérience pour évaluer, par exemple, la qualité du joint, la résistance d’accès etc. , en revanche, une pince de tension deux électrodes d’enregistrement, en particulier un à l’aide d’un système automatisé électrophysiologique, ne nécessite aucune compétence spécifique et peut être effectuée par des techniciens de laboratoire.

Lors de l’acquisition d’un set-up électrophysiologique, considération de coût est certainement un facteur important qui doit être soigneusement analysée. Par exemple, alors que le coût d’un système automatisé est relativement élevé, une comparaison plus étroite révèle que l’installation d’une plate-forme complète d’électrophysiologique comprend l’achat d’équipement tels que des micromanipulateurs bonnes, une lentille binoculaire, un amplificateur, une perfusion système et une table antivibratoire, tout en acquisition de données et en effectuant une analyse. Une comparaison des coûts entre un deux électrodes de voltage clamp Set-up contre un set-up de la pince patch révèle des écarts encore plus loin. En outre, le système automatisé offre l’avantage d’un équipement entièrement automatisé et fonctionne sans surveillance jour et nuit.

Les propriétés pharmacologiques d’un composé sont déterminées par son mode d’action au niveau du récepteur. Par exemple, des inhibiteurs compétitifs sont des molécules qui peuvent entrer dans la même poche de liaison, ou le site orthosteric, que l’agoniste elle-même provoque une compétition. Inhibiteurs non compétitifs sont des composés qui inhibent les récepteurs en interagissant sur un autre site et, dans le cas d’un canal de ligand-gated ion, qui peuvent entrer et bloquer le pore ionique, par exemple. Il irait au-delà de la portée de ce travail afin d’examiner les différents mécanismes d’interaction, mais des informations complémentaires peuvent être obtenues d’un manuel pharmacologique et/ou d’autres travaux tels que Bertrand et Bertrand22.

Dans le cas de MODULATEURS ALLOSTÉRIQUES, le composé lie à un site qui se distingue de la site d’orthosteric, mais la présence de la molécule modifie la barrière d’énergie entre les États de l’actifs et d’autres. MODULATEURS ALLOSTÉRIQUES positifs (PAMs) sont des composés qui réduisent la barrière d’énergie de la mise au repos à l’état actif et, par conséquent, augmentent l’effet de l’agoniste. Afin de caractériser les effets possibles de PAM, il faut, par conséquent déterminer si une exposition à la substance améliore la réponse à l’agoniste et, si oui, à quelle concentration. Les expériences présentées dans la Figure 11 et Figure 14 illustrent les protocoles qui peuvent être utilisés avec succès pour la caractérisation des PAMs les récepteurs GABAA .

Dans certains cas, l’exposition à la PAM seule pourrait suffire à activer les récepteurs. Cette activité peut être déterminée par une légère modification du protocole expérimental présenté ici. À savoir, au lieu d’utiliser une application conjointe du modulateur lors de l’exposition à la GABA, le protocole peut être modifié pour l’application du premier composé seul, puis en présence de la GABA. Une caractérisation de l’activité agoniste direct se fera par la détermination de l’amplitude de la réponse évoquée par le camp lui-même et par rapport au courant induite par le GABA.

Des expériences réalisées dans des tranches de cerveau, comme illustré à la Figure 7, sont utilisés pour confirmer l’activité composée au niveau des récepteurs natifs dans un circuit inhibiteur définitif avant d’aller plus loin dans des modèles animaux et le long de la voie vers des essais cliniques. Le protocole d’enregistrement et d’analyse de données relativement simple permet le classement des composés multiples en évaluant leur effet modulatrice différentiel sur l’amplitude du PS. Effets non spécifiques des composés qui ne sont pas liées au système GABA peuvent également être détecté (par exemple, lorsqu’on observe des changements dans la forme de PS). Direct, neurotransmission GABAergique peut être évaluée dans ces cas en mesurant les effets des composés sur des courants postsynaptiques inhibitrices (CISP) à l’aide de la cellule entière patch clamp technique8.

Disclosures

The authors have nothing to disclose.

Acknowledgements

Les auteurs remercient Judith Lengyel, Maria Karg, Grégoire Friz, Rachel Haab et Marie Claire Pflimlin de la Roche et Tifany Schaer et Deborah Paolucci de HiQScreen pour leur assistance technique excellente.

Materials

General equipment
96 well cell harvester -(Filtermate 196)  Packard To filter membranes with bound radioligand
Microtiter plate liquid scintillation counter (Top Count NXT) Packard Microplate Scintillation and Luminescence counter
Vial liquid scintillation counter (Beta-Couter 2500 TR) Packard Vial Scintillation and Luminescence counter
Liquid  handler (Biomek 2000) Beckman coulter To prepare compound dilutions
Vortex (Vortex Genie 2) Scientific industries Inc. To mix compound stock solutions
Tissue homogenizer (Polytron PT1200E) Kinematica AG To resuspend the membrane preparations
XLfit5 software Microsoft Excel
 add-on by IDBS		 Curve fitting software
Smart Pull UniPix – Electrode Puller
RoboInject MultiChannel Systems – Automated Injection (Xenopus Oocytes)
HiClamp MultiChannel Systems – Automated Voltage Clamp (Xenopus Ooocytes)
DataMining MultiChannel Systems – Data Analysis Software
DataMerger MultiChannel Systems – Data Processing Software
Digidata 1550 Molecular Devices Low noise data acquisition system
CyberAmp 380 or equivalent Axon Instruments Programmable Signal Conditioner
pClamp program suite Molecular Devices Software for data acquisition and analysis software
Antivibraton table  TMC To avoid microelectrode vibrations 
Patchstar Micromanipulators Scientifica To accurately position microelectrodes in brain slices
Faraday Cage  Sutter Instruments To isolate recordings from noise
McIlwain Tissue Chopper Campden Instruments LTD  To prepare brain slices
Borosilicate glass micropipette  Warner Instruments GC150TF-10 To record extracellular potentials in brain slices
Twisted pair, platinum iridium wires stimulation electrode World Precision Instruments To stimulate the brain slices with current
Stimulus generator for current and voltage driven stimulation MultiChannel Systems STG4000 Delivers the current to the stimulation electrode
Plasticware
Microtiter plate round bottom Corning #3365 Used for the binding assay
GF/C glassfibre filter-bottom 96-well microplate with 1.2µm poresize, for cell harvesting assays using a vacuum manifoldwell filter  Packard  #6005174 used for the binding assay
50 mL Tubes Falcon  #352070 used for the binding assay
Safe-lock tubes 1.5 mL Eppendorf #0030 120086 used for the binding assay
Safe-lock tubes 2 mL Eppendorf #0030 120094 used for the binding assay
Shipping tubes 180ml  Semadeni Europe AG  #3722 used for the binding assay
Pony vial Polyethylene 6ml  Perkin Elmer  #6013329 used for the binding assay
Top Seal  Perkin Elmer  #60051859 used for the binding assay
Spinner Flask Bellco BELLCO # 1965-00100 Spinner Flask
96  Well Plate (Conical) Thermo Scientific Milian 56368 Injection plate for the oocytes
96  Well Plate (Flat bottom) Corning (Vitaris Switzerland) 3364-cor Compound Plate for the HiClamp
Glass capillary  Hilgenberg (Germany) – borosilicate glass 1.2 O.D. 0.76 I.D. with filament
RNA preparation
Ambion mMessage mMachine Thermo Fisher Scientific for the in vitro synthesis
Chemicals
Assay buffer: KCl 5 mM; CaCl2 1.25 mM; MgCl2 1.25 mM; NaCl 120 mM; Tris 15 mM pH adjust with HCl to 7.4; store up to 3 months at 4°C. Used for binding assay
Washing buffer: Tris 50mM -HCl pH 7.4; store at 4°C. Used for binding assay
Stock solution of test compounds 10mM in DMSO Used for binding assay
Flumazenil (RO0151788) 10mM in DMSO Used for binding assay
Diazepam 4mM in DMSO Used for binding assay
[3H]-Flumazenil 60-85 Ci/mmol in Ethanol; store at -20°C Used for binding assay
Microscint 40  Packard  #6013641 Used for binding assay
Ultima Gold  Perkin Elmer  #6013329 Used for binding assay
MS-222 Sigma Sigma # A5040 MS-222
AB/AM Sigma Sigma # A5955 antibiotics / antimycotics
Collagenase Sigma Sigma # C1030 Collagenase Type I
Rnase Sigma Sigma # R2020-250 mL RNaseZAP
EndoFree Plasmid maxi Kit Qiagen Qiagen # 12362
Salts for artificial cerebrospinal fluid (NaCl, KCl, etc.) Sigma
Membranes
Frozen membrane preparations from transient or stably transfected HEK293 overexpressing different human GABAA receptor subtypes: α1β3γ2, α2β3γ2, α3β3γ2, α5β3γ2. See Ballard et al 2009 for detailed methods. Used for binding assay
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GABA-A ReceptorRadioligand BindingElectrophysiologyXenopus OocytesRodent Brain SlicesCompound ScreeningSubtype SelectivityEfficacyMicroinjectionVoltage ClampPopulation Spike RecordingHippocampus

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Knoflach, F., Hernandez, M., Bertrand, D. Methods for the Discovery of Novel Compounds Modulating a Gamma-Aminobutyric Acid Receptor Type A Neurotransmission. J. Vis. Exp. (138), e57842, doi:10.3791/57842 (2018).
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