اكتب أساليب لاكتشاف مركبات الرواية تحوير مستقبلات حمض غاما أمينوبوتيريك – كبيرة
Summary
نقدم هنا، بروتوكولات لاكتشاف المركبات النشطة في مستقبلات GABAA ، من الربط لعلم وظائف الأعضاء وعلم الصيدلة.
Abstract
يعرض مخطوطة هذا بروتوكول خطوة بخطوة لفحص المركبات في غاما-أمينوبوتيريك حمض اكتب مستقبلات (GABAA) واستخدامها على نحو تحديد رواية الجزيئات النشطة في الاختبارات الإكلينيكية من المؤتلف في المختبر مستقبلات لتأثيراتها الدوائية في مستقبلات الأصلية في شرائح الدماغ القوارض. للمركبات الملزمة في موقع المستقبلات البنزوديازيبين، هو الخطوة الأولى إعداد شاشة الأولية التي تتكون من تطوير فحوصات ملزمة راديوليجاند في أغشية الخلية معربا عن الأنواع الفرعية GABAA الرئيسية. ثم، مع الاستفادة من تعبير مغايرة للقوارض والإنسان مستقبلات GABAA في النمو بويضات أو خلايا HEK 293، فمن الممكن لاستكشاف الخصائص الفسيولوجية لمستقبلات مختلفة، في فحوصات الكهربية، أنواع فرعية والخصائص الدوائية للمركبات التي تم تحديدها. وسوف تعرض النظام البويضيه النمو هنا، بدءاً بالعزلة في بويضات وبهم microinjection مع مرناس مختلفة، تصل إلى توصيف الدوائية باستخدام المشابك الجهد الكهربائي اثنين. أخيرا، سيتم وصف التسجيلات التي تجري في الدماغ القوارض الشرائح التي يتم استخدامها كاختبار ثانوي فسيولوجية لتقييم نشاط الجزيئات في على مستقبلات الأصلية في دائرة العصبية محددة تحديداً جيدا. وأظهرت التسجيلات خارج الخلية باستخدام استجابات السكان من الخلايا العصبية متعددة جنبا إلى جنب مع تطبيق المخدرات.
Introduction
هنا، نقدم البروتوكولات لاكتشاف المركبات النشطة في مستقبلات GABAA ، من الربط لعلم وظائف الأعضاء وعلم الصيدلة. في البحث عن رواية جزيئات معينة لمستقبلات GABAA ، أنها حاسمة لتحديد، على أدق وجه ممكن، النوع الفرعي للفائدة، وتقييم الطابع الخاص لهذه المركبات التي تم تحديدها مؤخرا (انظرمثلاً، لإجراء استعراض، رودولف و كنوفلاتش1أو سيغارت2). مسار نموذجي في اكتشاف الأدوية والخطوات التي يلزم تحقيقها موضحة في الشكل 1.
فحوصات ملزمة كانت ولا تزال إلى حد كبير وتستخدم كخطوة أولى في اكتشاف الأدوية. وفي حالة مستقبلات GABAA ، أنها هي الأمثل للتعرف على المركبات التي تربط إلى موقع الربط البنزوديازيبين من مستقبلات حيث ربط عقاقير علاجية مفيدة وآمنة. التقنيات الأخرى، باستخدام فلوروميتريك التصوير لوحة قارئ (فليبر) غشاء المحتملة فحوصات صبغية حمراء3، الكشف عن المركبات مثل الباربيتورات ربط المواقع الإضافية التي أقل من المرغوب فيه بسبب صورتها من الآثار الجانبية غير المرغوب فيها. وبالإضافة إلى ذلك، يمكن مباشرة الأصباغ المستخدمة لتنشيط مستقبلات GABAA ، وبالتالي التشكيك في جدوى هذه الاختبارات ل اكتشاف المخدرات4. ملزمة فحوصات يمكن فقط تقديم الأدلة التي يمكن ربط مركب معين لفئة معينة من مستقبلات. في المختبر فحوصات مع أغشية الخلايا المستخدمة لتحديد α5β3γ2 GABAA البشرية انتقائية مستقبلات يغاندس. عابر transfected الخلايا HEK293 التعبير عن البشرية GABAA α5β3γ2، α1β3γ2، α2β3γ2، ومستقبلات α3β3γ2 تستخدم لإعداد الأغشية لهذه الاختبارات. يتم الكشف عن تأثير يغاندس طريق قياس التﻷلؤ من [ح]3[فلومازينيل منضمة إلى مستقبلات الغشاء (تثبيط [ح]3[فلومازينيل ملزمة). والميزة الرئيسية لهذا الأسلوب تقديم تحديد سرعة وكفاءة تقارب ملزم المجمع في المستقبلات للفائدة في المستقبلات للفائدة.
الدراسات الفنية ضرورية لتقييم النشاط الوظيفي من المركبات وأن يقترح تفسيراً الفسيولوجية والدوائية للآليات الناجمة عن ربط المركبات المستقبلات. اليوم، فمن المعترف به جيدا أن مستقبلات GABAA الوظيفية نتيجة للجمعية من خمس وحدات فرعية حول محور بسيودوسيميتري التي شكلتها المسام الأيونية والنتيجة من الجمعية من خمس وحدات متماثلة. معظم مستقبلات GABAA تتكون من اثنين أو أكثر من وحدات فرعية مختلفة. مستقبلات الدماغ الرئيسية GABAA ، على سبيل المثال، تتألف من الوحدات الفرعية α1 و β2 γ2 في ستويتشيوميتري من 2، 2 و 1 على التوالي5،6. إعادة تشكيل نظام مضيف مثل النمو بويضات أو خلايا HEK293 يوفر إمكانية استكشاف الخصائص الدوائية مستقبلات سريعاً.
ثم يتم استكشاف الخصائص الدوائية للمركبات مع تسجيلات خارج الخلية في الدماغ شرائح7. هذا الأسلوب يتيح استكشاف تأثير المركبات على كبيرة ويوفر طريقة فعالة لتأكيد الآثار الوظيفية من المركبات مصممة في أنظمة تعبير مغايرة على مستوى مستقبلات الأم في الكلي البيئة العصبية. ويمكن أيضا تقييم جابايرجيك كبيرة على المستوى الجزيئي بقياس آثار المركبات على التيارات بوستسينابتيك المثبطة (إيبسكس)8. ولكن البروتوكول المستخدمة هنا وتستند إلى تسجيلات المشبك تصحيح كامل الخلية في شرائح الدماغ هو أكثر تفصيلاً وتؤدي إنتاجية أقل.
وأخيراً، تناقش نقاط القوة والضعف في المختبر فحص تتالي المستخدمة للتعرف على يغاندس α5β3γ2 انتقائية في منظور مختلف التقنيات وأوجه القصور الجوهرية. وينبغي تقديم هذا العمل الخبراء وغير الخبراء في مجال مستقبلات GABAA استعراض مفيدة للجمع بين نهج مختلفة في المختبر يستخدم للتصدي لاكتشاف جديد المغيرون من هذه القنوات عن طريق بوابة يجند أيون.
Protocol
Representative Results
Discussion
ويتطلب وضع رواية المركبات النشطة في قناة عن طريق بوابة يجند أيون مثل مستقبلات GABAA استخدام نهج متعددة. عادة، الخطوة الأولى هي كثيرا ما تجري باستخدام فحوصات ملزمة؛ ومع ذلك، هذه القياسات ليست كافية لتميز النشاط الفسيولوجية للمجمع أو الصيدلة دقة. على وجه الخصوص، مجمعا يربط مستقبل قد تعزز أو تعوق وظيفتها أو حتى تنتج أي أثر الوظيفية (السكوت) (أيربط لمستقبلات دون تعديل مهمتها). وهكذا، مطلوب اختبار وظيفية لتوصيف كامل مجمع.
Binding assays:
والميزة الرئيسية مقايسة الربط هو أن فإنه يمكن أن يجري كفاءة في عدد كبير من العينات تتراوح ما يصل إلى عدة آلاف، وأنه يقدم الانتماءات الملزمة للجزيئات النشطة. كما هو موضح هنا، يتكون الخطوة الأولى لإنشاء أسلوب لتقييم المخططات مستقبلات المرجوة. إلا وهي بينما يمكن إجراء ملزم في مستقبلات أصلي من الكسور أو العقول كامل، سيمنع هذه طريقة تحديد الصلات في أنواع فرعية من مستقبلات محددة. ولذلك، من الضروري استخدام نظم المؤتلف إلى جزيئات الشاشة في الهدف المنشود. في الوقت الحاضر، تعداء عابرة أو مستقرة من كدناس وحدة فرعية مستقبلات المرجوة في خطوط الخلايا يوفر طريقة فعالة وموثوق بها للتعبير عن الأنواع الفرعية مستقبلات للفائدة (مثلاً، α5β3γ2 GABAA ). استخدام الربط التقليدية إجراء فحوصات راديوليجاندس، ولكن في الوقت الحاضر التقنيات المتاحة التي تجنب الإزعاج للتعامل مع النشاط الإشعاعي (مثلاً، الكمية على أساس fluorescence يجند الملزمة).
التعبير الوظيفية في نظام مضيف:
للتعبير عن الجينات في نظام مضيف، يجب إدراج تسلسل الترميز للفائدة في بلازميد يحتوي على بروموتورس كافية. عادة، تستخدم في المختبر التوليف مرناً، promotors T7 أو T6 البكتيريا. لتعبير كدنا، يجب أن تنظمها نسخ الجينات للفائدة مروج eukaryote مثل CMV (الفيروس المضخم للخلايا) أو ما يعادلها. في الوقت الحاضر، والبلازميدات عدة، بما في ذلك بروموتورس اثنين (أي، بونيف، بكمف-6AC، psf-CMV/T7, pCI-الأجسام القريبة من الأرض، بكدنا)، يتم السماح المتوفرة في المختبر توليف مرناً أو تعبير كدنا كما هو مبين في الشكل 15. تعبير عن مستقبلات GABAA يمكن الحصول على إخلاص في خطوط الخلايا أو في بويضات النمو . المزايا الرئيسية لهذه الأخيرة هي عدم وجود تعبير مستقبلات ذاتية والبساطة من التلاعب، وتوافر نظام مؤتمت الصغرى-الحقن والتسجيلات. وتوضح الإجراءات المبينة في هذا البروتوكول كفاءة النظام الآلي الذي يسمح بحقن بويضات 96 في حوالي 7 دقيقة وتتطلب أي مهارات ميكرومانيبوليشن. تذكر يحتوي مبيض واحد من النمو بين 10,000 – 30,000 بويضات، فمن الواضح أن عددا كبيرا من قياسات خلية يمكن أن يجري على إعداد واحد. وعلاوة على ذلك، كتعبير يمكن أن تجري باستخدام الحقن كدنا، يمكن استخدام والبلازميدات نفس تحتوي على جينات الفائدة التي يتم تطويرها للتجارب ملزمة لتوصيف وظيفي دون الحاجة إلى مزيد من البيولوجيا الجزيئية التلاعب.
نظراً لحجمه الكبير والتعبير السطحية العالية، غلة البويضيه واحدة عدد من مستقبلات معادلة تقريبا للخلايا المتلاقية في 35 مم طبق بيتري. ومع ذلك، يمثل إعداد بويضات وحقن جزء صغير من تكلفة خط الخلية، كما لا تتطلب التجارب وسيلة ثقافة معينة والتلاعب العقيمة. تفعيل قناة GABAA واحدة غلة بيكوامبيريس قليلة (10-12) والتيارات التي تتراوح مدة تصل إلى عشرات ميكروامبيري (10-6) تسجل بسهولة في البويضات واحدة، مما يؤكد النشاط المتزامن لعدة ملايين من مستقبلات أثناء رد واحد.
خطوة أولى في توصيف القنوات عن طريق بوابة يجند أيون هي غالباً تحديد تقارب واضح مستقبلات. تتألف التجارب التي تحتاج إلى إجراء لتطبيق سلسلة من النبضات اختبار قصير مؤثر والتآمر السعة لمقولة الحالية، أو في بعض الحالات، المنطقة الواقعة تحت المنحنى (AUC) كدالة لوغاريتم تركيز مؤثر. كما أنه من الممكن بسهولة ميكروينجيكت تركيزات مختلفة بلازميد ونسبة في نفس الدفعة من بويضات، نظام هذا التعبير مناسبة خاصة لهذا وصف. وعلاوة على ذلك، كشفت مقارنة دفعة إلى دفعة بدرجة عالية من الاستقرار للمفوضية الأوروبية مختلفة50s. هو تصور تأثير تشكيل وحدة فرعية في تقارب واضح المستقبلات سهولة استخدام قطعة أرض عنكبوت، كما يتضح في الشكل 10.
غالباً ما تتم مقارنة نتائج المشبك الجهد الكهربائي اثنين التي تم الحصول عليها في بويضات النمو مع التسجيلات باستخدام أقطاب المشبك التصحيح. في حين أنها تتجاوز نطاق هذا العمل للذهاب إلى مقارنة تفصيلية بين هذين النظامين، يمكن فحص عدد قليل من النقاط. بينما المشبك تصحيح في الخلايا يوفر مزايا لتوصيف الفيزيائية الحيوية مع تطبيق المخدرات بسرعة، أكثر تعقيداً من تلك التسجيلات اثنين-القطب في بويضات النمو متطلباتها. صعوبة الأولى ولا يستهان به هو التعبير عن بروتين معين مع ضرورة ثقافة خلية، وعابرة أو تعداء مستقرة، وتحديد الخلايا التي هي التعبير عن بناء المطلوب. وباﻹضافة إلى ذلك، فإنه أمر لا غنى عنه لدراسة المساهمة الممكنة للتعبير الذاتية في الخلية تعتبر. وعلاوة على ذلك، يتطلب تسجيل تصحيح المشبك شخص مهرة للقيام ميكرومانيبوليشن تحت مجهر عالية التكبير، في حين أن الشخص يحتاج أيضا إجراء تحليل كاف خلال التجربة لتقييم نوعية الختم،، على سبيل المثال، المقاومة الوصول إلخ في المقابل، المشبك جهد الكهربائي اثنين التسجيل، وخصوصا واحد باستخدام نظام الكهربية، لا تتطلب أي مهارات محددة، ويمكن أن تضطلع بها فنيو المختبرات.
عند الحصول إعداد الكهربية، النظر في التكلفة هو بالتأكيد عاملاً هاما يحتاج إلى أن تحلل بعناية. على سبيل المثال، في حين أن تكلفة نظام مؤتمت مرتفع نسبيا، مقارنة أوثق يكشف أن تركيب منصة الكهربية كاملة تشمل شراء معدات مثل ميكرومانيبولاتورس جيدة، عدسة مجهر، مكبر للصوت، ومن نضح النظام، وجدول المضادة اهتزاز، بينما أيضا الحصول على البيانات، وإجراء تحليل. مقارنة تكاليف بين جهد الكهربائي اثنين المشبك الهيكل مقابل مجموعة المشبك تصحيح يكشف عن تناقضات أبعد. وعلاوة على ذلك، النظام الآلي يوفر ميزة معدات مؤتمتة بالكامل وتشغيل غير مراقب ليلا ونهارا.
الخصائص الدوائية لمجمع تتحدد بأسلوب العمل على المستقبلات. على سبيل المثال، هي مثبطات تنافسية الجزيئات التي يمكن إدخال نفس الملزمة الجيب، أو موقع أورثوستيريك، كمؤثر حد ذاته أسباب منافسة. مثبطات عدم تنافسية هي المركبات التي تمنع المستقبلات من خلال التفاعل في موقع آخر، وفي حالة قناة بوابات يجند أيون، التي يمكن أن تدخل ومنع المسام الأيونية، على سبيل المثال. أنها تتجاوز نطاق هذا العمل لدراسة آليات مختلفة للتفاعل، ولكن كذلك يمكن الحصول على المعلومات من كتاب مدرسي الدوائي و/أو من الأعمال الأخرى مثل برتران وبرتراند في22.
في حالة اللوستيريك المغيرون، يعدل يربط المركب في موقع يختلف عن الموقع أورثوستيريك، ولكن وجود جزيء حاجز الطاقة بين الدول النشطة وغيرها. المغيرون allosteric الإيجابية (PAMs) هي المركبات التي تقلل من حاجز الطاقة من الراحة إلى الحالة النشطة، وتعزز تأثير مؤثر ولذلك. وصف الآثار المحتملة في بام، من الضروري، لذلك، لتحديد إذا كان تعرض للمجمع ويعزز استجابة مؤثر، وإذا كان الأمر كذلك، أي تركيز. وتوضح التجارب التي عرضت في الرقم 11 و الرقم 14 البروتوكولات التي يمكن استخدامها بنجاح لوصف PAMs في مستقبلات GABAA .
وفي بعض الحالات، قد يكون التعرض إلى بام وحدها كافية لتنشيط المستقبلات. يمكن تحديد هذا النشاط بواسطة تعديل طفيف للبروتوكول التجريبي المقدمة هنا. هي بدلاً من استخدام تطبيق المشاركين المغير خلال التعرض إلى غابا، البروتوكول يمكن تعديله لتطبيق أول مجمع وحدها ومن ثم حضور GABA. وصف نشاط مؤثر مباشر سيدلي تحديد السعة للاستجابة أثارت من قبل المجمع نفسه، ومقارنة بالحالي أثارت GABA.
وتستخدم تجارب أجريت في شرائح المخ، مثل كما هو موضح في الشكل 7، تأكيد نشاط المجمع في مستقبلات الأصلية في دارة مثبطة محددة قبل المضي قدما في نماذج حيوانية، وعلى طول الطريق نحو التجارب السريرية. يسمح بروتوكول تسجيل وتحليل البيانات بسيطة نسبيا تصنيف مركبات متعددة عن طريق تقييم أثرها مودولاتوري التفاضلية على السعة PS. الآثار الخاصة بعدم للمركبات التي لا تتصل بنظام GABA يمكن أيضا الكشف عن (مثلاً، عند ملاحظة التغييرات في الشكل PS). المباشر، جابايرجيك كبيرة يمكن تقييم في هذه الحالات بقياس آثار المركبات على التيارات بوستسينابتيك المثبطة (إيبسكس) باستخدام تقنية المشبك تصحيح كامل الخلية8.
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
يشكر المؤلفون جوديث لينجيل كارج ماريا و Friz غريغوار، هاب راشيل، وماري كلير بفليملين من روش وشير تيفاني ومتفائلا ديبورا من هيقسكرين لمساعداتها التقنية الممتازة.
Materials
| General equipment | |||
| 96 well cell harvester -(Filtermate 196) | Packard | To filter membranes with bound radioligand | |
| Microtiter plate liquid scintillation counter (Top Count NXT) | Packard | Microplate Scintillation and Luminescence counter | |
| Vial liquid scintillation counter (Beta-Couter 2500 TR) | Packard | Vial Scintillation and Luminescence counter | |
| Liquid handler (Biomek 2000) | Beckman coulter | To prepare compound dilutions | |
| Vortex (Vortex Genie 2) | Scientific industries Inc. | To mix compound stock solutions | |
| Tissue homogenizer (Polytron PT1200E) | Kinematica AG | To resuspend the membrane preparations | |
| XLfit5 software | Microsoft Excel add-on by IDBS |
Curve fitting software | |
| Smart Pull | UniPix | – | Electrode Puller |
| RoboInject | MultiChannel Systems | – | Automated Injection (Xenopus Oocytes) |
| HiClamp | MultiChannel Systems | – | Automated Voltage Clamp (Xenopus Ooocytes) |
| DataMining | MultiChannel Systems | – | Data Analysis Software |
| DataMerger | MultiChannel Systems | – | Data Processing Software |
| Digidata 1550 | Molecular Devices | Low noise data acquisition system | |
| CyberAmp 380 or equivalent | Axon Instruments | Programmable Signal Conditioner | |
| pClamp program suite | Molecular Devices | Software for data acquisition and analysis software | |
| Antivibraton table | TMC | To avoid microelectrode vibrations | |
| Patchstar Micromanipulators | Scientifica | To accurately position microelectrodes in brain slices | |
| Faraday Cage | Sutter Instruments | To isolate recordings from noise | |
| McIlwain Tissue Chopper | Campden Instruments LTD | To prepare brain slices | |
| Borosilicate glass micropipette | Warner Instruments | GC150TF-10 | To record extracellular potentials in brain slices |
| Twisted pair, platinum iridium wires stimulation electrode | World Precision Instruments | To stimulate the brain slices with current | |
| Stimulus generator for current and voltage driven stimulation | MultiChannel Systems | STG4000 | Delivers the current to the stimulation electrode |
| Plasticware | |||
| Microtiter plate round bottom | Corning | #3365 | Used for the binding assay |
| GF/C glassfibre filter-bottom 96-well microplate with 1.2µm poresize, for cell harvesting assays using a vacuum manifoldwell filter | Packard | #6005174 | used for the binding assay |
| 50 mL Tubes | Falcon | #352070 | used for the binding assay |
| Safe-lock tubes 1.5 mL | Eppendorf | #0030 120086 | used for the binding assay |
| Safe-lock tubes 2 mL | Eppendorf | #0030 120094 | used for the binding assay |
| Shipping tubes 180ml | Semadeni Europe AG | #3722 | used for the binding assay |
| Pony vial Polyethylene 6ml | Perkin Elmer | #6013329 | used for the binding assay |
| Top Seal | Perkin Elmer | #60051859 | used for the binding assay |
| Spinner Flask | Bellco | BELLCO # 1965-00100 | Spinner Flask |
| 96 Well Plate (Conical) | Thermo Scientific Milian | 56368 | Injection plate for the oocytes |
| 96 Well Plate (Flat bottom) | Corning (Vitaris Switzerland) | 3364-cor | Compound Plate for the HiClamp |
| Glass capillary | Hilgenberg (Germany) | – | borosilicate glass 1.2 O.D. 0.76 I.D. with filament |
| RNA preparation | |||
| Ambion mMessage mMachine | Thermo Fisher Scientific | for the in vitro synthesis | |
| Chemicals | |||
| Assay buffer: KCl 5 mM; CaCl2 1.25 mM; MgCl2 1.25 mM; NaCl 120 mM; Tris 15 mM pH adjust with HCl to 7.4; store up to 3 months at 4°C. | Used for binding assay | ||
| Washing buffer: Tris 50mM -HCl pH 7.4; store at 4°C. | Used for binding assay | ||
| Stock solution of test compounds 10mM in DMSO | Used for binding assay | ||
| Flumazenil (RO0151788) 10mM in DMSO | Used for binding assay | ||
| Diazepam 4mM in DMSO | Used for binding assay | ||
| [3H]-Flumazenil 60-85 Ci/mmol in Ethanol; store at -20°C | Used for binding assay | ||
| Microscint 40 | Packard | #6013641 | Used for binding assay |
| Ultima Gold | Perkin Elmer | #6013329 | Used for binding assay |
| MS-222 | Sigma | Sigma # A5040 | MS-222 |
| AB/AM | Sigma | Sigma # A5955 | antibiotics / antimycotics |
| Collagenase | Sigma | Sigma # C1030 | Collagenase Type I |
| Rnase | Sigma | Sigma # R2020-250 mL | RNaseZAP |
| EndoFree Plasmid maxi Kit | Qiagen | Qiagen # 12362 | |
| Salts for artificial cerebrospinal fluid (NaCl, KCl, etc.) | Sigma | ||
| Membranes | |||
| Frozen membrane preparations from transient or stably transfected HEK293 overexpressing different human GABAA receptor subtypes: α1β3γ2, α2β3γ2, α3β3γ2, α5β3γ2. See Ballard et al 2009 for detailed methods. | Used for binding assay |
References
- Rudolph, U., Knoflach, F. Beyond classical benzodiazepines: novel therapeutic potential of GABAA receptor subtypes. Nature Reviews Drug Discovery. 10, 685-697 (2011).
- Sieghart, W. Structure and pharmacology of g-aminobutyric acidA receptor subtypes. Pharmacological Reviews. 47, 181-234 (1995).
- Liu, J., et al. A high-throughput functional assay for characterization of g-aminobutyric acidA channel modulators using cryopreserved transiently transfected cells. ASSAY and Drug Development Technologies. 6, 781-786 (2008).
- Mennerick, S., et al. Diverse voltage-sensitive dyes modulate GABAA receptor function. Journal of Neuroscience. 30, 2871-2879 (2010).
- Hevers, W., Luddens, H. The diversity of GABAA receptors. Pharmacological and electrophysiological properties of GABAA channel subtypes. Molecular Neurobiology. 18, 35-86 (1998).
- Macdonald, R. L., Olsen, R. W. GABAA receptor channels. Annual Review of Neuroscience. 17, 569-602 (1994).
- Kemp, J. A., Marshall, G. R., Wong, E. H., Woodruff, G. N. The affinities, potencies and efficacies of some benzodiazepine-receptor agonists, antagonists and inverse-agonists at rat hippocampal GABAA-receptors. British Journal of Pharmacology. 91, 601-608 (1987).
- Prenosil, G. A., et al. Specific subtypes of GABAA receptors mediate phasic and tonic forms of inhibition in hippocampal pyramidal neurons. Journal of Neurophysiology. 96, 846-857 (2006).
- Ballard, T. M., et al. RO4938581, a novel cognitive enhancer acting at GABAA a5 subunit-containing receptors. Psychopharmacology. 202, 207-223 (2009).
- Knoflach, F., Hernandez, M. C., Bertrand, D. GABAA receptor-mediated neurotransmission: Not so simple after all. Biochemical Pharmacology. 115, 10-17 (2016).
- Gielen, M. C., Lumb, M. J., Smart, T. G. Benzodiazepines modulate GABAA receptors by regulating the preactivation step after GABA binding. Journal of Neuroscience. 32, 5707-5715 (2012).
- Bergmann, R., Kongsbak, K., Sorensen, P. L., Sander, T., Balle, T. A unified model of the GABAA receptor comprising agonist and benzodiazepine binding sites. PLoS One. 8, 52323 (2013).
- Richter, L., et al. Diazepam-bound GABAA receptor models identify new benzodiazepine binding-site ligands. Nature Chemical Biology. 8, 455-464 (2012).
- Rudolph, U., Crestani, F., Mohler, H. GABAA receptor subtypes: dissecting their pharmacological functions. Trends in Pharmacological Sciences. 22, 188-194 (2001).
- Wisden, W., Seeburg, P. H. GABAA receptor channels: from subunits to functional entities. Current Opinion in Neurobiology. 2, 263-269 (1992).
- Davies, C. H., Davies, S. N., Collingridge, G. L. Paired-pulse depression of monosynaptic GABA-mediated inhibitory postsynaptic responses in rat hippocampus. The Journal of Physiology. 424, 513-531 (1990).
- Karnup, S., Stelzer, A. Temporal overlap of excitatory and inhibitory afferent input in guinea-pig CA1 pyramidal cells. The Journal of Physiology. 516, 485-504 (1999).
- Turner, D. A. Feed-forward inhibitory potentials and excitatory interactions in guinea-pig hippocampal pyramidal cells. The Journal of Physiology. 422, 333-350 (1990).
- Hamill, O. P., Marty, A., Neher, E., Sakmann, B., Sigworth, F. J. Improved patch-clamp techniques for high-resolution current recording from cells and cell-free membrane patches. Pflügers Archiv. 391, 85-100 (1981).
- Adelsberger, H., Brunswieck, S., Dudel, J. Block by picrotoxin of a GABAergic chloride channel expressed on crayfish muscle after axotomy. European Journal of Neuroscience. 10, 179-187 (1998).
- Hapfelmeier, G., et al. Isoflurane slows inactivation kinetics of rat recombinant a1b2g2L GABAA receptors: enhancement of GABAergic transmission despite an open-channel block. Neuroscience Letters. 307, 97-100 (2001).
- Bertrand, S., Bertrand, D. Overview of electrophysiological characterization of neuronal nicotinic acetylcholine receptors. Current Protocols in Pharmacology. , 17 (2004).
