ホスホロチオエートを使用して RNA の結合蛋白質の新規飽和突然変異誘発方法: シングル ステップの特性
Summary
特定の RNA シーケンスを結合するタンパク質は、遺伝子発現の重要な役割を果たします。これらの結合部位の詳細な特性解析は遺伝子の規則の私達の理解にとって重要です。ここでは、RNA タンパク質結合部位の飽和突然変異導入のシングル ステップ アプローチを説明しています。このアプローチは、RNA のすべての蛋白質の結合サイトに関するものです。
Abstract
遺伝子の規則は開発の重要な役割を果たしています。多数の DNA と RNA 結合タンパク質は、遺伝子の発現を制御する高い特異性とそのターゲット シーケンスをバインドします。これらの調節タンパク質 (転写) DNA のレベルでまたは RNA (mRNA スプライシング、起こる、mRNA の輸送、腐食および翻訳) のレベルでの遺伝子発現を制御します。制御配列の同定は、オンまたはオフの遺伝子への切り替えだけでなく、また下流遺伝子の特定規制蛋白質によって規制されているを理解するのに役立ちます。ここでは、RNA でタンパク質結合部位の飽和突然変異導入を可能にするワンステップ アプローチについて述べる。次の潜伏蛋白連結分数の各ホスホロチオエート ヌクレオチドと独立した Rna の合成と分離結合サイト内で非野生型ヌクレオチドと DNA テンプレートをドーピングが含まれます。非野生型ヌクレオチドからの干渉は、蛋白結合率の特恵除外の結果します。これはホスホロチオエート (ホスホロチオエート変異または PTM) を含むリン酸ジエステル結合のヨウ素の化学選択的な胸の谷間、次ゲル電気泳動によって監視されます。このシングル ステップ飽和突然変異誘発方法は、RNA、タンパク質結合部位の評価に適用されます。
Introduction
遺伝子は、生物学で重要な役割を果たしています。遺伝子の転写、mRNA のスプライシング、3′ 端形成、RNA 輸出、翻訳、mRNA の局在、崩壊、翻訳後修飾/安定性など両方の DNA と RNA 結合タンパク質は、遺伝子の重要な役割を再生レベルに調整できます。規制。一方、分子遺伝学的解析では、規制を多くの蛋白質を識別した、それらのごく一部のみが細胞機能の結合サイトの生体内完全に特徴づけられています。系統解析と突然変異は、DNA または RNA 蛋白質の相互作用を特徴付けるに補足のアプローチを提供しています。
RNA 結合蛋白質性分を含む発達のプロセスで重要です。セックス致死 (SXL)ショウジョウバエ蛋白質またはマスター セックス スイッチ蛋白質が存在しない、男性が女性にプレゼント。ウリジン豊富なシーケンスまたは体細胞1,2 の下流 mRNA ターゲット (トランス、セックス致死、男性固有の lethal2) で特定のスプライス部位に隣接するピリミジンの広大を認識します。 ,3,4。さらに、それは起こるサイトの初歩的な増強物(e(r)) 謄本5,6にウリジン リッチ起こるエンハンサー シーケンスに結合して切り替えを調整します。SXL 可能性が調節することを残る女性の生殖で追加のターゲット識別1,7,8,9,10、11,12,13。
通常、結合部位の特性変異原性, たとえば、削除や単一または複数のヌクレオチドの置換します。野生型 RNA 配列を基準にして各変異体の結合サイトが分析され、その結合親和性を決定するタンパク質濃度の一連を使用して (Kdまたは平衡解離定数); 興味の蛋白質のKdは 50 %rna 結合を取得するために必要な蛋白です。詳細な突然変異のこの労働集約的なプロセスを含む多数の突然変異体の生成・解析-3 つの野生型ヌクレオチド結合部位の各位置のため。従って、RNA に蛋白質の結合サイトの高速、簡単、安価な飽和突然変異導入の代替アプローチの必要性があります。
ここでは、RNA でタンパク質結合部位の飽和突然変異導入を可能にするワンステップ アプローチについて述べる。次の潜伏蛋白連結分数の各ホスホロチオエート ヌクレオチドと独立した Rna の合成と分離結合サイト内で非野生型ヌクレオチドと DNA テンプレートをドーピングが含まれます。非野生型ヌクレオチドからの干渉は、蛋白結合率の特恵除外の結果します。これはホスホロチオエート (ホスホロチオエート変異または PTM) を含むリン酸ジエステル結合のヨウ素の化学選択的な胸の谷間、次ゲル電気泳動によって監視されます。このシングル ステップ飽和突然変異誘発方法は、RNA、タンパク質結合部位の評価に適用されます。
Protocol
Representative Results
Discussion
変異は蛋白質の結合サイトを特徴付けるため長い間使用されています。まず、一連の変異型を構築し、結合の結合親和性に及ぼす影響を分析するアッセイで個別にテストできます。複数のステップ変異体を構築する一連の各変異体の反応をバインディングの実行など、標準的なアプローチに関連するかどうかは面倒で時間がかかるかどうか、およびことができない標準的な突然変異手法では?…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
著者は過去の資金調達のための健康の国民の協会のおかげで、マイケル ・ r. グリーンのオリゴヌクレオチドを合成をありがちましょう。
Materials
| Uridine 5’ a-thio triphosphate | NEN (Boston, Massachusetts) | NLP-017 | |
| Adenosine 5’ a-thio triphosphate | NEN (Boston, Massachusetts) | NLP-016 | |
| Vacuum manifold | Fisher Scientific | XX1002500 | Millipore 25 mm Glass Microanalysis Vacuum Filter |
| Vacuum manifold | Millipore | XX2702552 | 1225 Sampling Vacuum Manifold |
| Nitrocellulose | Millipore | HAWP | |
| Nitrocellulose | Schleicher & Schuell | PROTRAN | |
| Dephosphorlyation Kit | NEB | M0508 | |
| T4 Polynucleotide Kinase | NEB | M0201S | |
| Proteinase K | NEB | P8107S | |
| T7 RNA polymerase | NEB | M0251S | |
| RNasin | Promega | RNase inhibitor | |
| Glass Plates | Standard | Standard | |
| Gel Electrophoresis equipment | Standard | Standard | |
| X-ray films | Standard | Standard | |
| Polyacrylamide gel solutions | Standard | Standard |
References
- Schutt, C., Nothiger, R. Structure, function and evolution of sex-determining systems in Dipteran insects. Development. 127 (4), 667-677 (2000).
- Mahowald, A. P., Wei, G. Sex determination of germ cells in Drosophila. Ciba Found. Symp. 182, 193-202 (1994).
- Steinmann-Zwicky, M. How do germ cells choose their sex? Drosophila as a paradigm. Bioessays. 14 (8), 513-518 (1992).
- Salz, H. K. Sex, stem cells and tumors in the Drosophila ovary. Fly (Austin). 7 (1), 3-7 (2013).
- Gawande, B., Robida, M. D., Rahn, A., Singh, R. Drosophila Sex-lethal protein mediates polyadenylation switching in the female germline. Embo J. 25 (6), 1263-1272 (2006).
- Robida, M. D., Rahn, A., Singh, R. Genome-wide identification of alternatively spliced mRNA targets of specific RNA-binding proteins. PLoS One. 2 (6), e520 (2007).
- Samuels, M. E., et al. RNA binding by Sxl proteins in vitro and in vivo. Mol. Cell. Biol. 14 (7), 4975-4990 (1994).
- Fujii, S., Amrein, H. Genes expressed in the Drosophila head reveal a role for fat cells in sex-specific physiology. EMBO J. 21 (20), 5353-5363 (2002).
- Kelley, R. L., et al. Expression of msl-2 causes assembly of dosage compensation regulators on the X chromosomes and female lethality in Drosophila. Cell. 81 (6), 867-877 (1995).
- Hager, J., Cline, T. Induction of female Sex-lethal RNA splicing in male germ cells: implications for Drosophila germline sex determination. Development. 124 (24), 5033-5048 (1997).
- Vied, C., Halachmi, N., Salzberg, A., Horabin, J. I. Antizyme is a target of sex-lethal in the Drosophila germline and appears to act downstream of hedgehog to regulate sex-lethal and cyclin B. Dev Biol. 253 (2), 214-229 (2003).
- Chau, J., Kulnane, L. S., Salz, H. K. Sex-lethal facilitates the transition from germline stem cell to committed daughter cell in the Drosophila ovary. Genetics. 182 (1), 121-132 (2009).
- Chau, J., Kulnane, L. S., Salz, H. K. Sex-lethal enables germline stem cell differentiation by down-regulating Nanos protein levels during Drosophila oogenesis. Proc Natl Acad Sci U S A. 109 (24), 9465-9470 (2012).
- Singh, R., Valcarcel, J., Green, M. R. Distinct binding specificities and functions of higher eukaryotic polypyrimidine tract-binding proteins. Science. 268 (5214), 1173-1176 (1995).
- Singh, R., Banerjee, H., Green, M. R. Differential recognition of the polypyrimidine-tract by the general splicing factor U2AF65 and the splicing repressor sex-lethal. RNA. 6 (6), 901-911 (2000).
- Sakashita, E., Sakamoto, H. Characterization of RNA binding specificity of the Drosophila sex- lethal protein by in vitro ligand selection. Nucleic Acids Res. 22 (20), 4082-4086 (1994).
- Kanaar, R., Lee, A. L., Rudner, D. Z., Wemmer, D. E., Rio, D. C. Interaction of the sex-lethal RNA binding domains with RNA. EMBO J. 14 (18), 4530-4539 (1995).
- Milligan, J. F., Uhlenbeck, O. C. Synthesis of small RNAs using T7 RNA polymerase. Methods Enzymol. 180, 51-62 (1989).
- Gish, G., Eckstein, F. DNA and RNA sequence determination based on phosphorothioate chemistry. Science. 240 (4858), 1520-1522 (1988).
