בגישה מוטגנזה מכוונת רוויה הרומן: אפיון צעד בודד של חלבון תקינה מחייב אתרים ב- RNA באמצעות Phosphorothioates
Summary
חלבונים שקושרים רצפי RNA ספציפיים ממלאים תפקידים חיוניים בביטוי הגנים. אפיון מפורט של אתרים אלה מחייב חיוני להבנת הכונה. . הנה, מתואר בגישה צעד אחר צעד עבור מוטגנזה מכוונת רוויה מהאתרים מחייב חלבון ב RNA. גישה זו היא רלוונטית עבור כל האתרים מחייב חלבון ה-RNA.
Abstract
הכונה ממלא תפקיד חשוב בהתפתחות. רבים DNA ו RNA-מחייב חלבונים לאגד והרצפים שלהם מטרה עם ירידה לפרטים גבוה כדי לשלוט ביטוי גנים. אלה חלבוני בקרת ביטוי גנים ברמה של DNA (תמלול) או ברמה של RNA (pre-mRNA שחבור פוליאדנילציה, תחבורה mRNA, ריקבון, תרגום). זיהוי של רצפי הרגולציה מסייעת להבין לא רק איך הגן הוא החליף או ביטול, אלא גם אילו גנים במורד הזרם מוסדרים על ידי חלבון רגולטורי מסוים. כאן, אנו מתארים גישה חד-שלבית המאפשר רווית מוטגנזה מכוונת של אתר איגוד חלבון ב- RNA. זה כרוך סימום תבנית ה-DNA עם הלא-פראי-סוג נוקלאוטידים בתוך האתר מחייב, סינתזה של RNAs נפרד עם כל נוקלאוטיד phosphorothioate, ובידוד של השבר מאוגד בעקבות הדגירה עם חלבונים. ההפרעות נוקלאוטידים שאינם-פראי-סוג התוצאה שלהם תצדיק השבר חלבון מכורך מועדף. זה נמצא בפיקוח בג’ל בעקבות סלקטיבי כימי המחשוף בעזרת יוד של איגרות חוב phosphodiester המכילים phosphorothioates (phosphorothioate מוטגנזה מכוונת או PTM). גישה מוטגנזה מכוונת זו צעד אחר צעד רוויה ישימה על האפיון בכל אתר איגוד חלבון ב- RNA.
Introduction
הכונה ממלא תפקיד חשוב בביולוגיה. יכול להיות מוסדר גנים ברמה של שעתוק החדרת ה-pre-mRNA, היווצרות קצה 3′, RNA ייצוא, תרגום, לוקליזציה mRNA, ריקבון, שינוי post-translational/יציבות, וכו שני חלבונים DNA ו RNA-מחייב ממלאים תפקידי מפתח בגן תקנה. בזמן ניתוח גנטי מולקולרי זיהו חלבוני רבים, רק תת קבוצה קטנה של אותם כבר שאפיינו מלא תאיים או איגוד אתרים בתוך vivo. ניתוח פילוגנטי רצף מוטגנזה מכוונת מציעים גישות משלימות לאפיין DNA או RNA-חלבונים.
RNA-מחייב חלבונים חשובים בתהליכים התפתחותיים, כולל בידול המיניות. החלבון דרוזופילה סקס קטלני (SXL) או החלבון סקס מאסטר-switch נעדר זכרים, אבל המתנה אצל נקבות. הוא מזהה רצפי uridine-עשיר או פירימידין-ספינלי סמוכים לאתרי splice ספציפי במטרות במורד הזרם pre-mRNA (שנאי, סקס קטלני, ו lethal2 זכר ספציפי) תאים סומטיים1,2 3, ,4. בנוסף, זה מסדיר האתר פוליאדנילציה מיתוג באמצעות קשירה uridine-עשיר פוליאדנילציה רצפים משפר ב-5,התעתיק6 משפר של בסיסי (e(r)). SXL סביר מווסת את מטרות נוספות ב germline הנשי שנותרו להיות מזוהה1,7,8,9,10,11, 12 , 13.
בדרך כלל, אפיון אתר איגוד כרוך מוטגנזה מכוונת, לדוגמה, על-ידי מחיקה או החלפה של יחיד או נוקלאוטידים מרובים. כל אתר איגוד מוטציה, יחסית רצף ה-RNA פראי-סוג, ואז ניתוח באמצעות סדרה של ריכוז חלבון כדי לקבוע זיקה מחייבת שלה (דיסוציאציהKd או שיווי משקל קבוע) עבור החלבון עניין; Kd הוא ריכוז חלבון הנדרשים על מנת לקבל 50% RNA מחייב. תהליך זה מהגידולים של נתונים היסטוריים מוטגנזה מכוונת כרוך דור וניתוח של מוטציות רבות – שלושה נוקלאוטידים מסוג שאינו בר לכל תפקיד באתר האיגוד. לפיכך, יש צורך בגישה אלטרנטיבית עבור מוטגנזה מכוונת רוויה מהירה, פשוטה וזולה מהאתרים מחייב חלבון ב RNA.
כאן, אנו מתארים גישה חד-שלבית המאפשר רווית מוטגנזה מכוונת של אתר איגוד חלבון ב- RNA. זה כרוך סימום תבנית ה-DNA עם הלא-פראי-סוג נוקלאוטידים בתוך האתר מחייב, סינתזה של RNAs נפרד עם כל נוקלאוטיד phosphorothioate, ובידוד של השבר מאוגד בעקבות הדגירה עם חלבונים. ההפרעות נוקלאוטידים שאינם-פראי-סוג התוצאה שלהם תצדיק השבר חלבון מכורך מועדף. זה נמצא בפיקוח בג’ל בעקבות סלקטיבי כימי המחשוף בעזרת יוד של איגרות חוב phosphodiester המכילים phosphorothioates (phosphorothioate מוטגנזה מכוונת או PTM). גישה מוטגנזה מכוונת זו צעד אחר צעד רוויה ישימה על האפיון בכל אתר איגוד חלבון ב- RNA.
Protocol
Representative Results
Discussion
מוטגנזה מכוונת זמן שימש לאפיין אתרי קישור חלבון. ראשית, סדרה של מוטציות יכול להיות נבנה ונבדק באופן אינדיבידואלי מחייבים מבחני לניתוח והשפעותיהם על איגוד הזיקה. בעוד בגישה מוטגנזה מכוונת סטנדרטי מציע דרך לנתח מספר רצפים, מרובי שלבים מעורב הגישה סטנדרטיים, כגון בניית מוטציות וביצוע סדרה ש…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
המחבר תודה מכוני הבריאות הלאומיים לצורך מימון בעבר, תודה מיכאל ר גרין סינתזה oligonucleotides.
Materials
| Uridine 5’ a-thio triphosphate | NEN (Boston, Massachusetts) | NLP-017 | |
| Adenosine 5’ a-thio triphosphate | NEN (Boston, Massachusetts) | NLP-016 | |
| Vacuum manifold | Fisher Scientific | XX1002500 | Millipore 25 mm Glass Microanalysis Vacuum Filter |
| Vacuum manifold | Millipore | XX2702552 | 1225 Sampling Vacuum Manifold |
| Nitrocellulose | Millipore | HAWP | |
| Nitrocellulose | Schleicher & Schuell | PROTRAN | |
| Dephosphorlyation Kit | NEB | M0508 | |
| T4 Polynucleotide Kinase | NEB | M0201S | |
| Proteinase K | NEB | P8107S | |
| T7 RNA polymerase | NEB | M0251S | |
| RNasin | Promega | RNase inhibitor | |
| Glass Plates | Standard | Standard | |
| Gel Electrophoresis equipment | Standard | Standard | |
| X-ray films | Standard | Standard | |
| Polyacrylamide gel solutions | Standard | Standard |
References
- Schutt, C., Nothiger, R. Structure, function and evolution of sex-determining systems in Dipteran insects. Development. 127 (4), 667-677 (2000).
- Mahowald, A. P., Wei, G. Sex determination of germ cells in Drosophila. Ciba Found. Symp. 182, 193-202 (1994).
- Steinmann-Zwicky, M. How do germ cells choose their sex? Drosophila as a paradigm. Bioessays. 14 (8), 513-518 (1992).
- Salz, H. K. Sex, stem cells and tumors in the Drosophila ovary. Fly (Austin). 7 (1), 3-7 (2013).
- Gawande, B., Robida, M. D., Rahn, A., Singh, R. Drosophila Sex-lethal protein mediates polyadenylation switching in the female germline. Embo J. 25 (6), 1263-1272 (2006).
- Robida, M. D., Rahn, A., Singh, R. Genome-wide identification of alternatively spliced mRNA targets of specific RNA-binding proteins. PLoS One. 2 (6), e520 (2007).
- Samuels, M. E., et al. RNA binding by Sxl proteins in vitro and in vivo. Mol. Cell. Biol. 14 (7), 4975-4990 (1994).
- Fujii, S., Amrein, H. Genes expressed in the Drosophila head reveal a role for fat cells in sex-specific physiology. EMBO J. 21 (20), 5353-5363 (2002).
- Kelley, R. L., et al. Expression of msl-2 causes assembly of dosage compensation regulators on the X chromosomes and female lethality in Drosophila. Cell. 81 (6), 867-877 (1995).
- Hager, J., Cline, T. Induction of female Sex-lethal RNA splicing in male germ cells: implications for Drosophila germline sex determination. Development. 124 (24), 5033-5048 (1997).
- Vied, C., Halachmi, N., Salzberg, A., Horabin, J. I. Antizyme is a target of sex-lethal in the Drosophila germline and appears to act downstream of hedgehog to regulate sex-lethal and cyclin B. Dev Biol. 253 (2), 214-229 (2003).
- Chau, J., Kulnane, L. S., Salz, H. K. Sex-lethal facilitates the transition from germline stem cell to committed daughter cell in the Drosophila ovary. Genetics. 182 (1), 121-132 (2009).
- Chau, J., Kulnane, L. S., Salz, H. K. Sex-lethal enables germline stem cell differentiation by down-regulating Nanos protein levels during Drosophila oogenesis. Proc Natl Acad Sci U S A. 109 (24), 9465-9470 (2012).
- Singh, R., Valcarcel, J., Green, M. R. Distinct binding specificities and functions of higher eukaryotic polypyrimidine tract-binding proteins. Science. 268 (5214), 1173-1176 (1995).
- Singh, R., Banerjee, H., Green, M. R. Differential recognition of the polypyrimidine-tract by the general splicing factor U2AF65 and the splicing repressor sex-lethal. RNA. 6 (6), 901-911 (2000).
- Sakashita, E., Sakamoto, H. Characterization of RNA binding specificity of the Drosophila sex- lethal protein by in vitro ligand selection. Nucleic Acids Res. 22 (20), 4082-4086 (1994).
- Kanaar, R., Lee, A. L., Rudner, D. Z., Wemmer, D. E., Rio, D. C. Interaction of the sex-lethal RNA binding domains with RNA. EMBO J. 14 (18), 4530-4539 (1995).
- Milligan, J. F., Uhlenbeck, O. C. Synthesis of small RNAs using T7 RNA polymerase. Methods Enzymol. 180, 51-62 (1989).
- Gish, G., Eckstein, F. DNA and RNA sequence determination based on phosphorothioate chemistry. Science. 240 (4858), 1520-1522 (1988).
