Ein neuartiger Sättigung Mutagenese Ansatz: Einzelschritt Charakterisierung der regulatorischen Protein Bindungsstellen im RNA mit Phosphorthioate
Summary
Proteine, die bestimmte RNA-Sequenzen binden spielen wichtige Rollen in der Genexpression. Ausführliche Charakterisierung von diese Bindungsstellen ist entscheidend für unser Verständnis der Genregulation. Hier wird ein Einzelschritt-Ansatz für Sättigung Mutagenese der Protein-Bindungsstellen in der RNS beschrieben. Dieser Ansatz ist relevant für alle Protein-Bindungsstellen in der RNS.
Abstract
Genregulation spielt eine wichtige Rolle in der Entwicklung. Zahlreiche DNA und RNA-bindende Proteine binden ihre Ziel-Sequenzen mit hoher Spezifität zur Genexpression kontrollieren. Diese regulatorischen Proteinen Steuern Genexpression auf der Ebene der DNA (Transkription) oder auf der Ebene der RNA (Pre-mRNA Spleißen, Polyadenylation mRNA Transport, Verfall und Übersetzung). Identifizierung von regulatorischen Sequenzen hilft zu verstehen, nicht nur wie ein Gen ein- oder ausgeschaltet ist, sondern auch welche nachgeschalteten Gene durch ein bestimmtes regulatorischen Protein reguliert werden. Hier beschreiben wir einen One-Step-Ansatz, der Sättigung Mutagenese von einem Protein-Bindungsstelle in RNA ermöglicht. Es geht um doping DNA Schablone mit Wildtyp-Nukleotide in die Bindungsstelle, Synthese von separaten RNAs mit jeder Phosphorothioat Nukleotid und Isolierung von der gebundenen Anteil nach Inkubation mit Protein. Störungen durch Wildtyp-Nukleotiden führt zu ihren bevorzugten Ausschluss aus der Fraktion proteingebundener. Dies wird durch Gelelektrophorese nach selektiven chemischen Spaltung mit Jod Phosphodiester-Anleihen mit phosphorthioate (Phosphorothioat Mutagenese oder PTM) überwacht. Dieser einstufigen Sättigung Mutagenese Ansatz ist anwendbar auf die Charakterisierung der Protein-Bindungsstelle in RNA.
Introduction
Genregulation spielt eine wichtige Rolle in der Biologie. Gene reguliert werden können, auf der Ebene der Transkription, Pre-mRNA Spleißen, 3′ Ende Bildung, RNA-Export, Übersetzung, mRNA Lokalisierung, Verfall, Post-translationale Modifikation/Stabilität, etc. , die beide DNA und RNA-bindende Proteine Schlüsselrollen in gen spielen Verordnung. Während Molekulare genetische Analysen zahlreiche regulatorische Proteine identifiziert haben, nur eine kleine Teilmenge davon wurden charakterisiert voll und ganz für ihre Zellfunktionen oder verbindliche Sites in Vivo. Phylogenetische Sequenzanalyse und Mutagenese bieten sich ergänzende Ansätze zur Charakterisierung von DNA oder RNA-Protein-Interaktionen.
RNA-bindende Proteine sind wichtig für Entwicklungsprozesse, einschließlich der sexuellen Differenzierung. Der Drosophila -Protein Sex-lethal (SXL) oder die Geschlecht-Hauptschalter Protein fehlt in Männchen, sondern Gegenwart bei Frauen. Es erkennt Uridin-reichen Sequenzen oder Pyrimidine-Traktate neben spezifischen Spleißstellen in nachgeschalteten Pre-mRNA-Ziele (Transformator, Sex-tödlicheund männlich-spezifische lethal2) in somatischen Zellen1,2 ,3,4. Darüber hinaus regelt es polyadenylierungsstelle Wechsel durch die Bindung an Uridin-reiche Polyadenylation Enhancer Sequenzen in die Verstärker der rudimentären (e(r)) Transkript5,6. SXL wahrscheinlich regelt zusätzliche Ziele in der weiblichen Keimbahn, die noch werden identifiziert,1,7,8,9,10,11, 12 , 13.
Charakterisierung von einer Bindungsstelle umfasst Mutagenese, in der Regel, z. B. durch Löschung oder Ersatz von einzelnen oder mehreren Nukleotiden. Jede mutierte Bindungsstelle gegenüber dem Wildtyp RNA-Sequenz wird dann analysiert, mit einer Reihe von proteinkonzentrationen seine Bindungsaffinität zu bestimmen (Kd oder Gleichgewicht Dissoziation Konstante) für das Protein des Interesses; K-d ist die Konzentration des Proteins erforderlich um 50 % RNA-bindende zu erhalten. Dieser arbeitsintensive Prozess detaillierte Mutagenese beinhaltet, Erzeugung und Analyse von zahlreichen Mutanten – drei Wild-Typ Nukleotiden für jede Position in die Bindungsstelle. So gibt es eine Notwendigkeit für einen alternativen Ansatz für schnellere, einfachere und preiswerte Sättigung Mutagenese der Protein-Bindungsstellen in der RNS.
Hier beschreiben wir einen One-Step-Ansatz, der Sättigung Mutagenese von einem Protein-Bindungsstelle in RNA ermöglicht. Es geht um doping DNA Schablone mit Wildtyp-Nukleotide in die Bindungsstelle, Synthese von separaten RNAs mit jeder Phosphorothioat Nukleotid und Isolierung von der gebundenen Anteil nach Inkubation mit Protein. Störungen durch Wildtyp-Nukleotiden führt zu ihren bevorzugten Ausschluss aus der Fraktion proteingebundener. Dies wird durch Gelelektrophorese nach selektiven chemischen Spaltung mit Jod Phosphodiester-Anleihen mit phosphorthioate (Phosphorothioat Mutagenese oder PTM) überwacht. Dieser einstufigen Sättigung Mutagenese Ansatz ist anwendbar auf die Charakterisierung der Protein-Bindungsstelle in RNA.
Protocol
Representative Results
Discussion
Mutagenese ist lang verwendet, um Protein-Bindungsstellen zu charakterisieren. Erstens kann eine Reihe von Mutanten konstruiert und einzeln getestet in verbindlichen Assays, ihre Auswirkungen auf verbindliche Affinität zu analysieren. Während ein standard Mutagenese-Ansatz bietet eine Möglichkeit, mehrere Sequenzen zu analysieren, mehrere Schritte der Standardansatz, wie Mutanten Bau und Durchführung einer Reihe verbindlicher Reaktionen für jeden Mutant beteiligt, ist mühsam und zeitaufwendig und kann nicht Sättig…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Der Autor dankt der National Institutes of Health für die letzten Finanzierung und Dank Michael R. Green für die Synthese von Oligonukleotiden.
Materials
| Uridine 5’ a-thio triphosphate | NEN (Boston, Massachusetts) | NLP-017 | |
| Adenosine 5’ a-thio triphosphate | NEN (Boston, Massachusetts) | NLP-016 | |
| Vacuum manifold | Fisher Scientific | XX1002500 | Millipore 25 mm Glass Microanalysis Vacuum Filter |
| Vacuum manifold | Millipore | XX2702552 | 1225 Sampling Vacuum Manifold |
| Nitrocellulose | Millipore | HAWP | |
| Nitrocellulose | Schleicher & Schuell | PROTRAN | |
| Dephosphorlyation Kit | NEB | M0508 | |
| T4 Polynucleotide Kinase | NEB | M0201S | |
| Proteinase K | NEB | P8107S | |
| T7 RNA polymerase | NEB | M0251S | |
| RNasin | Promega | RNase inhibitor | |
| Glass Plates | Standard | Standard | |
| Gel Electrophoresis equipment | Standard | Standard | |
| X-ray films | Standard | Standard | |
| Polyacrylamide gel solutions | Standard | Standard |
References
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