Een roman verzadiging mutagenese aanpak: Macrostap karakterisering van regelgevende proteïne bindend Sites in RNA met behulp van fosforthioaten
Summary
Eiwitten die specifieke RNA opeenvolgingen binden spelen een kritieke rol in genexpressie. Gedetailleerde karakterisering van deze bandplaatsen is van cruciaal belang voor ons begrip van de genexpressie. Hier, wordt een-voor-stapmodus aanpak voor verzadiging mutagenese van eiwit-bandplaatsen in RNA beschreven. Deze aanpak geldt voor alle websites van de binding aan eiwitten in RNA.
Abstract
Genregulatie speelt een belangrijke rol in de ontwikkeling. Talrijke DNA – en RNA-bindende proteïnen binden hun doel sequenties met hoge specificiteit te controleren van de genexpressie. Deze regelgevende eiwitten bepalen de expressie van genen op het niveau van DNA (transcriptie) of op het niveau van RNA (pre-mRNA-splicing, polyadenylatie, mRNA vervoer, verval en vertaling). Identificatie van regulerende sequenties helpt te begrijpen niet alleen hoe een gen is overgeschakeld in- of uitschakelen, maar ook welke downstream genen worden gereguleerd door een bepaalde regelgevende proteïne. Hier beschrijven we een one-step-aanpak waarmee de verzadiging mutagenese van een bindende eiwit in RNA. Het gaat om doping DNA sjabloon met niet-wild-type nucleotiden binnen de bindende site, synthese van afzonderlijke RNAs met elk nucleotide phosphorothioate en isolatie van de afhankelijke breuk na incubatie met eiwit. Interferentie van niet-wild-type nucleotiden leidt tot hun preferentiële uitsluiting uit de eiwit-gebonden. Dit wordt gecontroleerd door de Elektroforese van het gel na selectieve chemische decolleté met jodium van phosphodiester obligaties met fosforthioaten (phosphorothioate mutagenese of PTM). Deze-voor-stapmodus verzadiging mutagenese aanpak geldt voor de karakterisering van elke site bindende eiwit in RNA.
Introduction
Genregulatie speelt een belangrijke rol in de biologie. Genen kunnen worden geregeld op het niveau van de transcriptie, pre-mRNA-splicing, 3′ eind vorming, RNA export, vertaling, lokalisatie van mRNA, verval, posttranslationele wijziging/stabiliteit, etc. die beide DNA – en RNA-bindende proteïnen spelen een sleutelrol in gen verordening. Terwijl moleculair genetische analyses hebben talrijke regelgevende proteïnen geïdentificeerd, hebben slechts een klein gedeelte van hen volledig was gekenmerkt voor hun cellulaire functies of bindende sites in vivo. Fylogenetische sequentieanalyse en mutagenese bieden complementaire benaderingen karakteriseren van DNA – of RNA-eiwit interacties.
RNA-bindende proteïnen zijn belangrijk in ontwikkelings processen, met inbegrip van seksuele differentiatie. De Drosophila eiwit Sex-dodelijke (SXL) of het geslacht-hoofdschakelaar eiwit ontbreekt in de mannetjes, maar heden bij vrouwtjes. Het herkent uridine-rijke sequenties of pyrimidine-traktaten grenzend aan specifieke splice sites in downstream pre-mRNA doelen (transformator, Sex-dodelijkeen man-specifieke lethal2) in somatische cellen1,2 ,3,4. Daarnaast reguleert het polyadenylatie site overschakelen door binding aan uridine-rijke polyadenylatie versterker sequenties in de versterker van rudimentaire (e(r)) transcript5,6. SXL waarschijnlijk regelt extra doelen in de vrouwelijke germline dat nog moet worden vastgesteld van1,7,8,9,10,11, 12 , 13.
Karakterisering van een bindende site impliceert typisch, mutagenese, bijvoorbeeld door schrapping of vervanging van één of meerdere nucleotiden. Elke mutant bindende site, ten opzichte van de wild-typen RNA volgorde, is vervolgens geanalyseerd met behulp van een reeks eiwitten concentraties te bepalen zijn bindende affiniteit (Kd of evenwicht dissociatie constant) voor de proteïne van belang; Kd is de eiwitconcentratie moet 50% RNA-bindende verkrijgen. Deze arbeidsintensieve proces van gedetailleerde mutagenese betreft generatie en analyse van talrijke mutanten — drie niet-wild type nucleotiden voor elke positie in de bindende site. Er is dus behoefte aan een alternatieve benadering voor snellere, eenvoudigere en goedkope verzadiging mutagenese van eiwit bandplaatsen in RNA.
Hier beschrijven we een one-step-aanpak waarmee de verzadiging mutagenese van een bindende eiwit in RNA. Het gaat om doping DNA sjabloon met niet-wild-type nucleotiden binnen de bindende site, synthese van afzonderlijke RNAs met elk nucleotide phosphorothioate en isolatie van de afhankelijke breuk na incubatie met eiwit. Interferentie van niet-wild-type nucleotiden leidt tot hun preferentiële uitsluiting uit de eiwit-gebonden. Dit wordt gecontroleerd door de Elektroforese van het gel na selectieve chemische decolleté met jodium van phosphodiester obligaties met fosforthioaten (phosphorothioate mutagenese of PTM). Deze-voor-stapmodus verzadiging mutagenese aanpak geldt voor de karakterisering van elke site bindende eiwit in RNA.
Protocol
Representative Results
Discussion
Mutagenese heeft lange tijd gebruikt om het eiwit bandplaatsen karakteriseren. Eerst kan een aantal mutanten worden gebouwd en individueel getest in de testen voor het analyseren van de gevolgen daarvan voor affiniteit bindend bindend. Hoewel een standaard mutagenese aanpak biedt een manier om te analyseren verschillende reeksen, meerdere stappen betrokken bij de standaardbenadering, zoals de bouw van mutanten en uitvoeren van een reeks van bindende reacties voor elke mutant, is moeizaam en tijdrovend en kan niet het toe…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
De auteur dankt de National Institutes of Health voor de afgelopen financiering en Bedankt Michael R. Green voor synthese oligonucleotides.
Materials
| Uridine 5’ a-thio triphosphate | NEN (Boston, Massachusetts) | NLP-017 | |
| Adenosine 5’ a-thio triphosphate | NEN (Boston, Massachusetts) | NLP-016 | |
| Vacuum manifold | Fisher Scientific | XX1002500 | Millipore 25 mm Glass Microanalysis Vacuum Filter |
| Vacuum manifold | Millipore | XX2702552 | 1225 Sampling Vacuum Manifold |
| Nitrocellulose | Millipore | HAWP | |
| Nitrocellulose | Schleicher & Schuell | PROTRAN | |
| Dephosphorlyation Kit | NEB | M0508 | |
| T4 Polynucleotide Kinase | NEB | M0201S | |
| Proteinase K | NEB | P8107S | |
| T7 RNA polymerase | NEB | M0251S | |
| RNasin | Promega | RNase inhibitor | |
| Glass Plates | Standard | Standard | |
| Gel Electrophoresis equipment | Standard | Standard | |
| X-ray films | Standard | Standard | |
| Polyacrylamide gel solutions | Standard | Standard |
References
- Schutt, C., Nothiger, R. Structure, function and evolution of sex-determining systems in Dipteran insects. Development. 127 (4), 667-677 (2000).
- Mahowald, A. P., Wei, G. Sex determination of germ cells in Drosophila. Ciba Found. Symp. 182, 193-202 (1994).
- Steinmann-Zwicky, M. How do germ cells choose their sex? Drosophila as a paradigm. Bioessays. 14 (8), 513-518 (1992).
- Salz, H. K. Sex, stem cells and tumors in the Drosophila ovary. Fly (Austin). 7 (1), 3-7 (2013).
- Gawande, B., Robida, M. D., Rahn, A., Singh, R. Drosophila Sex-lethal protein mediates polyadenylation switching in the female germline. Embo J. 25 (6), 1263-1272 (2006).
- Robida, M. D., Rahn, A., Singh, R. Genome-wide identification of alternatively spliced mRNA targets of specific RNA-binding proteins. PLoS One. 2 (6), e520 (2007).
- Samuels, M. E., et al. RNA binding by Sxl proteins in vitro and in vivo. Mol. Cell. Biol. 14 (7), 4975-4990 (1994).
- Fujii, S., Amrein, H. Genes expressed in the Drosophila head reveal a role for fat cells in sex-specific physiology. EMBO J. 21 (20), 5353-5363 (2002).
- Kelley, R. L., et al. Expression of msl-2 causes assembly of dosage compensation regulators on the X chromosomes and female lethality in Drosophila. Cell. 81 (6), 867-877 (1995).
- Hager, J., Cline, T. Induction of female Sex-lethal RNA splicing in male germ cells: implications for Drosophila germline sex determination. Development. 124 (24), 5033-5048 (1997).
- Vied, C., Halachmi, N., Salzberg, A., Horabin, J. I. Antizyme is a target of sex-lethal in the Drosophila germline and appears to act downstream of hedgehog to regulate sex-lethal and cyclin B. Dev Biol. 253 (2), 214-229 (2003).
- Chau, J., Kulnane, L. S., Salz, H. K. Sex-lethal facilitates the transition from germline stem cell to committed daughter cell in the Drosophila ovary. Genetics. 182 (1), 121-132 (2009).
- Chau, J., Kulnane, L. S., Salz, H. K. Sex-lethal enables germline stem cell differentiation by down-regulating Nanos protein levels during Drosophila oogenesis. Proc Natl Acad Sci U S A. 109 (24), 9465-9470 (2012).
- Singh, R., Valcarcel, J., Green, M. R. Distinct binding specificities and functions of higher eukaryotic polypyrimidine tract-binding proteins. Science. 268 (5214), 1173-1176 (1995).
- Singh, R., Banerjee, H., Green, M. R. Differential recognition of the polypyrimidine-tract by the general splicing factor U2AF65 and the splicing repressor sex-lethal. RNA. 6 (6), 901-911 (2000).
- Sakashita, E., Sakamoto, H. Characterization of RNA binding specificity of the Drosophila sex- lethal protein by in vitro ligand selection. Nucleic Acids Res. 22 (20), 4082-4086 (1994).
- Kanaar, R., Lee, A. L., Rudner, D. Z., Wemmer, D. E., Rio, D. C. Interaction of the sex-lethal RNA binding domains with RNA. EMBO J. 14 (18), 4530-4539 (1995).
- Milligan, J. F., Uhlenbeck, O. C. Synthesis of small RNAs using T7 RNA polymerase. Methods Enzymol. 180, 51-62 (1989).
- Gish, G., Eckstein, F. DNA and RNA sequence determination based on phosphorothioate chemistry. Science. 240 (4858), 1520-1522 (1988).
