نهجاً الطفرات تشبع رواية: وصف خطوة مفردة بروتين تنظيمي ملزم مواقع في الجيش الملكي النيبالي باستخدام فوسفوروثيواتيس
Summary
البروتينات التي تربط تسلسل معين من الحمض النووي الريبي تلعب أدواراً حاسمة في التعبير الجيني. وصف مفصل لمواقع الربط هذه الأهمية الحاسمة لفهمنا لتنظيم الجينات. ويرد هنا، اتباع نهج خطوة واحدة للطفرات تشبع مواقع ربط البروتين في الجيش الملكي النيبالي. وهذا النهج ذات الصلة لجميع مواقع ملزمة البروتين في الجيش الملكي النيبالي.
Abstract
تنظيم الجينات يلعب دوراً هاما في التنمية. ربط العديد الحمض النووي والجيش الملكي النيبالي ملزم البروتينات على تسلسلات الهدف مع خصوصية عالية للتحكم في التعبير الجيني. هذه البروتينات التنظيمية التحكم في التعبير الجيني أما على مستوى الحمض النووي (النسخ) أو على مستوى الحمض النووي الريبي (الربط مرناً قبل بوليادينيليشن، ومرناً، والانحلال والنقل والترجمة). تحديد تسلسل تنظيمي يساعد على فهم ليس فقط كيف يتم تبديل جين أو إيقاف تشغيله، ولكن أيضا الجينات المصب التي ينظمها بروتين تنظيمية خاصة. وهنا يصف لنا اتباع نهج خطوة واحدة يتيح الطفرات التشبع من موقع ملزمة البروتين في الجيش الملكي النيبالي. أنها تنطوي على تعاطي المنشطات قالب الحمض النووي مع النيوكليوتيدات غير-نوع البرية داخل الموقع ملزم، توليف للكشف منفصلة مع كل من النوكليوتيدات فوسفوروثيواتي، وعزله في كسر ملزمة بعد الحضانة مع البروتين. تدخل من نوع البرية غير النيوكليوتيدات النتائج في استبعادهم تفضيلية من الكسر البروتين زمنياً. ويرصد هذا التفريد جل عقب انشقاق الكيميائية انتقائية مع اليود سندات فوسفوديستير التي تحتوي على فوسفوروثيواتيس (الطفرات فوسفوروثيواتي أو PTM). يعتبر هذا الأسلوب الطفرات تشبع خطوة واحدة تنطبق على وصف أي موقع ملزمة البروتين في الجيش الملكي النيبالي.
Introduction
تنظيم الجينات يلعب دوراً هاما في مجال البيولوجيا. الجينات يمكن أن تنظم على مستوى النسخ، مرناً قبل الربط، 3 ‘ تشكيل نهاية، تصدير الجيش الملكي النيبالي، والترجمة، التعريب مرناً، تسوس، بوستترانسلاشونال التعديل/الاستقرار، إلخ كلا البروتينات الحمض النووي والجيش الملكي النيبالي الملزمة تلعب أدواراً رئيسية في الجينات التنظيم. بينما حددت التحليلات الجينية الجزيئية البروتينات التنظيمية العديدة، اتسمت فقط مجموعة فرعية صغيرة من لهم تماما للوظائف الخلوية أو ربط المواقع في فيفو. تحليل تسلسل النشوء والتطور والطفرات نقدم نهج تكميلية لوصف التفاعلات الحمض النووي أو الحمض النووي الريبي البروتين.
الجيش الملكي النيبالي ملزم البروتينات هامة في العمليات الإنمائية، بما في ذلك التمييز الجنسي. البروتين المورفولوجية الجنس الفتاكة (SXL) أو البروتين الرئيسي تبديل الجنس غائبا في الذكور، ولكن الوقت الحالي في الإناث. أنه يعترف بتسلسل الغنية uridine أو بيريميدين-مساحات المتاخمة لمواقع الوصلة المحددة في أهداف مرناً قبل المصب (المحولاتو الجنس الفتاكة، و lethal2 الخاصة بالذكور) في الخلايا الجسدية1،2 ،،من34. وباﻹضافة إلى ذلك، فإنه ينظم الموقع بوليادينيليشن التبديل بواسطة الربط إلى تسلسل محسن بوليادينيليشن الغنية أردين في5،نص محسن من بدائية (e(r))6. SXL المحتمل ينظم أهداف إضافية في germline الإناث التي لا يزال يتعين تحديد1،،من78،،من910،11، 12 , 13.
عادة، يشمل توصيف موقع الربط الطفرات، على سبيل المثال، بحذف أو استبدال واحد أو متعددة النيوكليوتيدات. كل موقع ملزم المسخ، بالنسبة لتسلسل الحمض النووي الريبي البرية من نوع، ثم يتم تحليل استخدام سلسلة من تركيزات البروتين لتحديد ما تقارب ملزم (الانفصالكد أو التوازن المستمر) لبروتين الاهتمام؛ كد هو تركيز البروتين اللازم للحصول على ربط الحمض النووي الريبي 50%. تتضمن هذه العملية ذات العمالة الكثيفة للطفرات مفصلة توليد وتحليل لطفرات عديدة – ثلاثة النيوكليوتيدات-نوع البرية لكل وظيفة في موقع الربط. وبالتالي، هناك حاجة إلى نهج بديل للطفرات تشبع أسرع وأبسط، وغير مكلفة لمواقع ربط بروتين في الجيش الملكي النيبالي.
وهنا يصف لنا اتباع نهج خطوة واحدة يتيح الطفرات التشبع من موقع ملزمة البروتين في الجيش الملكي النيبالي. أنها تنطوي على تعاطي المنشطات قالب الحمض النووي مع النيوكليوتيدات غير-نوع البرية داخل الموقع ملزم، توليف للكشف منفصلة مع كل من النوكليوتيدات فوسفوروثيواتي، وعزله في كسر ملزمة بعد الحضانة مع البروتين. تدخل من نوع البرية غير النيوكليوتيدات النتائج في استبعادهم تفضيلية من الكسر البروتين زمنياً. ويرصد هذا التفريد جل عقب انشقاق الكيميائية انتقائية مع اليود سندات فوسفوديستير التي تحتوي على فوسفوروثيواتيس (الطفرات فوسفوروثيواتي أو PTM). يعتبر هذا الأسلوب الطفرات تشبع خطوة واحدة تنطبق على وصف أي موقع ملزمة البروتين في الجيش الملكي النيبالي.
Protocol
Representative Results
Discussion
الطفرات منذ فترة طويلة تستخدم لوصف مواقع ربط بروتين. أولاً، يمكن تبني سلسلة من طفرات واختبار فردي في ملزمة فحوصات لتحليل آثارها على ملزمة تقارب. بينما يقدم نهجاً الطفرات قياسية طريقة لتحليل عدة سلاسل، خطوات متعددة تشترك في نهج قياسية، مثل تشييد طفرات وأداء سلسلة ملزما ردود الفعل لكل متحو?…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
المعاهد الوطنية للصحة لتمويل الماضية وذلك بفضل مقدم البلاغ وذلك بفضل مايكل ر الأخضر لتوليف النوكليوتيد.
Materials
| Uridine 5’ a-thio triphosphate | NEN (Boston, Massachusetts) | NLP-017 | |
| Adenosine 5’ a-thio triphosphate | NEN (Boston, Massachusetts) | NLP-016 | |
| Vacuum manifold | Fisher Scientific | XX1002500 | Millipore 25 mm Glass Microanalysis Vacuum Filter |
| Vacuum manifold | Millipore | XX2702552 | 1225 Sampling Vacuum Manifold |
| Nitrocellulose | Millipore | HAWP | |
| Nitrocellulose | Schleicher & Schuell | PROTRAN | |
| Dephosphorlyation Kit | NEB | M0508 | |
| T4 Polynucleotide Kinase | NEB | M0201S | |
| Proteinase K | NEB | P8107S | |
| T7 RNA polymerase | NEB | M0251S | |
| RNasin | Promega | RNase inhibitor | |
| Glass Plates | Standard | Standard | |
| Gel Electrophoresis equipment | Standard | Standard | |
| X-ray films | Standard | Standard | |
| Polyacrylamide gel solutions | Standard | Standard |
References
- Schutt, C., Nothiger, R. Structure, function and evolution of sex-determining systems in Dipteran insects. Development. 127 (4), 667-677 (2000).
- Mahowald, A. P., Wei, G. Sex determination of germ cells in Drosophila. Ciba Found. Symp. 182, 193-202 (1994).
- Steinmann-Zwicky, M. How do germ cells choose their sex? Drosophila as a paradigm. Bioessays. 14 (8), 513-518 (1992).
- Salz, H. K. Sex, stem cells and tumors in the Drosophila ovary. Fly (Austin). 7 (1), 3-7 (2013).
- Gawande, B., Robida, M. D., Rahn, A., Singh, R. Drosophila Sex-lethal protein mediates polyadenylation switching in the female germline. Embo J. 25 (6), 1263-1272 (2006).
- Robida, M. D., Rahn, A., Singh, R. Genome-wide identification of alternatively spliced mRNA targets of specific RNA-binding proteins. PLoS One. 2 (6), e520 (2007).
- Samuels, M. E., et al. RNA binding by Sxl proteins in vitro and in vivo. Mol. Cell. Biol. 14 (7), 4975-4990 (1994).
- Fujii, S., Amrein, H. Genes expressed in the Drosophila head reveal a role for fat cells in sex-specific physiology. EMBO J. 21 (20), 5353-5363 (2002).
- Kelley, R. L., et al. Expression of msl-2 causes assembly of dosage compensation regulators on the X chromosomes and female lethality in Drosophila. Cell. 81 (6), 867-877 (1995).
- Hager, J., Cline, T. Induction of female Sex-lethal RNA splicing in male germ cells: implications for Drosophila germline sex determination. Development. 124 (24), 5033-5048 (1997).
- Vied, C., Halachmi, N., Salzberg, A., Horabin, J. I. Antizyme is a target of sex-lethal in the Drosophila germline and appears to act downstream of hedgehog to regulate sex-lethal and cyclin B. Dev Biol. 253 (2), 214-229 (2003).
- Chau, J., Kulnane, L. S., Salz, H. K. Sex-lethal facilitates the transition from germline stem cell to committed daughter cell in the Drosophila ovary. Genetics. 182 (1), 121-132 (2009).
- Chau, J., Kulnane, L. S., Salz, H. K. Sex-lethal enables germline stem cell differentiation by down-regulating Nanos protein levels during Drosophila oogenesis. Proc Natl Acad Sci U S A. 109 (24), 9465-9470 (2012).
- Singh, R., Valcarcel, J., Green, M. R. Distinct binding specificities and functions of higher eukaryotic polypyrimidine tract-binding proteins. Science. 268 (5214), 1173-1176 (1995).
- Singh, R., Banerjee, H., Green, M. R. Differential recognition of the polypyrimidine-tract by the general splicing factor U2AF65 and the splicing repressor sex-lethal. RNA. 6 (6), 901-911 (2000).
- Sakashita, E., Sakamoto, H. Characterization of RNA binding specificity of the Drosophila sex- lethal protein by in vitro ligand selection. Nucleic Acids Res. 22 (20), 4082-4086 (1994).
- Kanaar, R., Lee, A. L., Rudner, D. Z., Wemmer, D. E., Rio, D. C. Interaction of the sex-lethal RNA binding domains with RNA. EMBO J. 14 (18), 4530-4539 (1995).
- Milligan, J. F., Uhlenbeck, O. C. Synthesis of small RNAs using T7 RNA polymerase. Methods Enzymol. 180, 51-62 (1989).
- Gish, G., Eckstein, F. DNA and RNA sequence determination based on phosphorothioate chemistry. Science. 240 (4858), 1520-1522 (1988).
