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Environment

無菌状態で小さな分子に対する植物の反応を評価するための柔軟な低コスト化の養液栽培システム

Published: August 25, 2018
doi:
10.3791/57800
, , , , , ,
1Brazilian Bioethanol Science and Technology Laboratory (CTBE),Brazilian Center for Research in energy and materials (CNPEM), 2University of Campinas (UNICAMP), 3University of Viçosa (UFV), 4CTBE,CNPEM, 5Brazilian Bioethanol Science and Technology Laboratory (CTBE/CNPEM),Max Planck Partner Group

Summary

単純な汎用性、および低コストの in vitro水耕システムが正常に最適化されて、無菌条件下で大規模な実験を有効にします。このシステム ソリューションと分子、生化学的、生理学的研究のための根の効率的な吸収に化学物質のアプリケーションが容易になります。

Abstract

プラント生物学の研究の広い範囲は、養液栽培のカルチャを使用して実行されます。この作品は、化学薬品および興味の他の物質に対する植物の反応を評価するために設計された体外水耕成長システムが表示されます。このシステムは、それぞれ C3および C4モデル種シロイヌナズナとエノコログサ、均質な苗を得ることに非常に効率的です。無菌栽培は、水耕栽培で植物通常成長のための制限要因が知られている藻類や微生物汚染を回避できます。さらに、このシステムは拡張性が高く、必要な場合、マイナーの機械的損傷と大規模な植物材料の収穫として植物の個々 の部分の収穫を有効にします。植物の成長のための主要なプラットフォームとしてピペット ラックを使用して、このシステムが簡単で低コストのアセンブリをしているを示す詳細なプロトコルを提供しています。このシステムの有効性は、薬 AZD-8055、ラパマイシン (TOR) キナーゼ ターゲットの化学阻害剤の効果を評価するためにシロイヌナズナ実生植物を使用して検証されました。効率的に、根およびシュートの AZD 8055 治療後 30 分も早く TOR 阻害が検出されました。さらに、AZD 8055 扱われる植物には、予想される澱粉過剰表現型が表示されます。一般に、高価な使用を必要とする同位体標識化合物を用いた代謝フラックスの評価として植物の研究者の植物誘導や阻害剤、同様の行動を監視することを目指しての理想的な方法としてこの養液栽培システムを提案試薬。

Introduction

水耕栽培を使用して成長する植物の利点は、再現実験1,2,3を有効にして制服の植物の生産に広く認識されています。このシステムで養液の組成が正しく制御して、植物の成長と開発のすべての段階に沿ったリサイクルします。さらに、根が栄養飢餓と水欠乏4などの土壌で栽培した植物で起こることができるよう、非生物的ストレスにさらされない。栽培土壌で培養したものにかなり似ている水耕存在形態および生理的特性、としてこのシステム広くで採用されている研究ルート/生長と収穫なしの監視できるので怪我2,5。

水耕条件を用いた研究のほとんどはマイクロ ・栄養素1,3 の機能を特徴づける行った組成と栄養液の濃度を変更する可能性があるため、6,7,8。ただし、このシステムは、植物生物学、ホルモンと植物の化学物質の機能を解明するようなアプリケーションの広い範囲に非常に有用であること証明しています。例えば、水耕栽培条件下でホルモン9とブラシノステロイド アプリケーション10によって引き起こされる加速成長表現型の新しいクラスとしてのストリゴラクトンの探索を行った。さらに、このシステムによりラベル付けされた同位体を用いた実験 (例えば、 14N/15N、 13CO2)11,12蛋白質および代謝物質の混入を評価するにはによって質量分析法。

、植物の研究にこのシステムの重要性を考慮した養液栽培文化の数が多いは、水耕容器3,プレートから苗の転移を使用して (i) システムを含む、ここ数年で設計されている13;(ii) ロックウール ルート開発2,14,15; の初期段階へのアクセスを制限します。(iii) ポリエチレン顆粒小分子/治療困難な16の同種のアプリケーションとなる浮体としてまたは植物9,17の (iv) 短縮番号です。これらのプロトコルの多くに記載されている水耕タンクのボリュームは通常大きい (最大 32 L 1-5 L に至る小さなボリューム)18、化学物質のアプリケーションを非常に高価になります。いくつかの研究を行う無菌条件8,の下での水耕栽培を記述する19システムの組み立てはかなり骨の折れる、プラスチックやガラスにナイロン メッシュの完璧な調整から成る、通常コンテナー5,8,17,20。

モデル植物シロイヌナズナの重要性、による水耕栽培システムの大部分この種1,2,8,14,18,用に設計されました。19,20. それにもかかわらず、他の植物種の種子の発芽を改善するために前処理の水耕成長機能を報告するいくつかの研究がある、同期率の in vitro8,16.大規模なために、シロイヌナズナや草猫じゃらしなどの他の種を含む植物の成長のための滅菌条件を可能にするシンプルで低コストのメンテナンスの養液栽培システムを設定するためのプロトコルを開発しました。viridis。ここで説明する方法は、苗の生長は最大化、同期、および簡単に監視、別の実験に適しています。さらに、このシステムとして多くの利点: (i) そのアセンブリは簡単で、そのコンポーネントを再利用できます。(ii) 異なる化学物質を液体培地に簡単に適用を可能します。(iii) 苗発芽し、水耕栽培システムに転移を必要とせず培養培地で直接育つ(iv) のシュートと根発達・発育を密接に監督することができ、損害なく苗を収穫しています。(v) それを行うと大きなスケールで動作する生理学的な条件を維持します。

Protocol

1. 液体と固体培養基の準備 ビタミン [コバルト (ii) 塩化物五水和物の 0.0125 mg/L, 銅 (ii) の硫酸塩五水和物の 0.0125 mg/L, 18.35 mg/L エチレンジアミン四酢酸鉄ナトリウム、3.10 mg/L の半分強さ培地、培 (MS) 媒体を用いた液体培地を準備します。ホウ酸、ヨウ化カリウム、マンガンの 8.45 mg/L の 0.415 mg/L 硫酸塩一水和物、ナトリウム モリブデン酸二水和物、硫酸亜鉛七水和物、塩化カルシウム?…

Representative Results

TOR キナーゼは、栄養素と細胞増殖とすべての真核生物の成長を促進するシグナル伝達のエネルギーを統合する主要なレギュレータです。植物の TOR の機能を解明する努力にはシロイヌナズナ形質転換行 TOR によって RNA 干渉または人工マイクロ Rna28,30,31, 条件付き抑圧の世代が含まれてTOR ノ?…

Discussion

この最適化された水耕構造により、植物の培養成功文化です。ピペットの先端フラット面に固体媒体、種子の培養液に浸したシステムと比較するとかなり利得にも種子が発芽します。このシステムの大きな利点は、実生植物の開発の間に根が転移を必要とせず液体培地と接触して直接得ることです。さらに、減らされた容積の液体媒体の化学治療を簡単に適用できます。湿度が高く、?…

Disclosures

The authors have nothing to disclose.

Acknowledgements

この仕事に支えられ、サンパウロ研究財団 (FAPESP;12/19561-0 を付与) とマックス ・ プランク。エリアス F. · アラウージョ (FAPEMIG 14/30594) カロライナ C. モンテ ・ ベロ (FAPESP;グラント 14/10407-3) ヴァレリアネーダー マフラ (FAPESP;グラント 14/07918-6)、ヴィヴィアン C. H. ダ ・ シルバ (岬/CNPEM 24/2013) フェローシップを感謝しています。著者は、RPS6 に対する抗体を気前よく提供するため Institut ジャン ・ ピエール Bourgin (INRA, ヴェルサイユ, フランス) からクリスチャン ・ マイヤーをありがとうございます。著者に感謝 RTV UNICAMP、Ed サンパウロ Aparecido デ · ソウザ マノエル オーディオ中にテクニカル サポートのための記録。

Materials

Ethanol Merck 100983
Sodium hypochlorite solution Sigma-Aldrich 425044
Polysorbate 20   Sigma-Aldrich P2287
Murashige and Skoog (MS) medium including vitamins  Duchefa Biochemie M0222
2-(N-morpholino)ethanesulfonic acid (MES) monohydrate Duchefa Biochemie M1503
Agar  Sigma-Aldrich A7921
Potassium hydroxide Sigma-Aldrich 484016
Laminar flow hood Telstar BH-100
Hotplate AREC F20510011
Growth chamber Weiss Technik HGC 1514
Glass Petri dish (150 mm x 25 mm) Uniglass 189.006
200 μL pipette tip racks  Kasvi K8-200-5 *
300 μL multichannel pipette Eppendorf 3122000060
300 μL pipette tips Eppendorf 30073088
200 μL pipette  Eppendorf 3120000054
200 μL pipette tips Eppendorf 30000870
Scissors Tramontina 25912/108
Tweezer ABC Instrumentos 702915
Scalpel blade Sigma-Aldrich S2771
Adhesive transparent tape (45mm x 50m) Scotch 3M 5803
Disposable plastic boxes, external dimensions: 353 mm (L)x 178 mm (W) x 121mm (H) Maxipac 32771
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Monte-Bello, C. C., Araujo, E. F., Martins, M. C., Mafra, V., da Silva, V. C., Celente, V., Caldana, C. A Flexible Low Cost Hydroponic System for Assessing Plant Responses to Small Molecules in Sterile Conditions. J. Vis. Exp. (138), e57800, doi:10.3791/57800 (2018).
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