Un Flexible Low Cost système hydroponique, évaluer les réactions des plantes à petites molécules dans des Conditions stériles
Summary
Un système hydroponique simple, polyvalent et économique le in vitro a été optimisé avec succès, permettant à des expériences à grande échelle dans des conditions stériles. Ce système facilite l’application de produits chimiques dans une solution et leur absorption efficace par les racines pour les études moléculaires, biochimiques et physiologiques.
Abstract
Une large gamme d’études en biologie végétale sont effectuées à l’aide de cultures hydroponiques. Dans ce travail, un système hydroponique croissance in vitro conçu pour évaluer les réactions des plantes aux produits chimiques et autres substances d’intérêt est présenté. Ce système est très efficace pour obtenir des semis homogènes et saines des C3 C4 espèces de modèle Arabidopsis thaliana et Setaria viridis, respectivement. La culture stérile évite les algues et la contamination du micro-organisme, qui sont connus des facteurs limitants pour la croissance normale des plantes et le développement en culture hydroponique. En outre, ce système est évolutif, permettant la récolte de matériel végétal à grande échelle avec des dommages mécaniques mineurs, ainsi que la récolte des différentes parties d’une plante, si vous le souhaitez. Un protocole détaillé démontrant que ce système a un assemblage facile et peu coûteuse, puisqu’elle utilise les grilles de la pipette comme plate-forme principale pour cultiver des plantes, est fourni. La faisabilité de ce système a été validée à l’aide de Arabidopsis semis pour évaluer l’effet de la drogue AZD-8055, un inhibiteur chimique de la cible de la rapamycine (TOR) kinase. L’inhibition de TOR a été efficacement détectée dès 30 min après un traitement de AZD-8055 dans les racines et les pousses. En outre, les plantes traitées AZD-8055 affichent le phénotype d’amidon-excédent prévu. Nous avons proposé ce système hydroponique comme une méthode idéale pour les chercheurs de plantes visant à surveiller l’action des plantes inducteurs ou inhibiteurs, ainsi quant à évaluer les flux métaboliques à l’aide de composés de marquage isotopique qui, en général, nécessite l’utilisation du cher réactifs.
Introduction
Les avantages de la croissance des plantes à l’aide de culture hydroponique ont été largement reconnus dans la production des plantes grandes et uniformes, permettant des expériences reproductibles1,2,3. Dans ce système, la composition de la solution nutritive peut être correctement contrôlée et recyclée le long de toutes les étapes de la croissance des plantes et le développement. En outre, racines ne sont pas soumis aux stress abiotiques, comme cela peut arriver dans les plantes en terre, tels que des éléments nutritifs famine et eau carence en4. Comme plantes cultivées hydroponically présents caractéristiques morphologiques et physiologiques assez semblables à celles cultivées dans le sol, ce système a été largement employé dans la recherche car elle permet la surveillance de la croissance de la racine/tige et leur récolte sans blessures2,5.
En raison de la possibilité de modifier la composition et la concentration de la solution nutritive, la plupart des recherches à l’aide de conditions de culture hydroponiques a été effectuée pour caractériser les fonctions du micro et macronutriments1,3 ,6,7,8. Cependant, ce système s’est avéré pour être très utile pour un large éventail d’applications en biologie végétale, de nature à élucider les fonctions des hormones et de produits chimiques dans les usines. Par exemple, la découverte des strigolactones comme une nouvelle classe d’hormones9 et le phénotype d’une croissance accélérée déclenchée par brassinostéroïde demande10 ont été effectuées dans des conditions de culture hydroponiques. En outre, ce système permet des expériences avec des isotopes marqués (par exemple, 14N /15N et 13CO2)11,12 pour évaluer leur incorporation dans les protéines et de métabolites par spectrométrie de masse.
Compte tenu de l’importance de ce système en recherche sur les plantes, un grand nombre de cultures hydroponiques a été conçu dans les années précédentes, y compris les systèmes qui utilisent (i) le transfert des semis de plaques à conteneurs hydroponique3, 13; (ii) laine de roche qui limite l’accès aux premiers stades de la racine développement2,14,15; (iii) granulés de polyéthylène comme le corps flottant, ce qui rend l’application homogène des petites molécules/traitements difficiles16; ou (iv) un réduit nombre de plantes9,17. Le volume des réservoirs hydroponiques décrit dans plusieurs de ces protocoles sont généralement volumineux (petits volumes allant de 1 à 5 L, jusqu’à 32 L)18, ce qui rend l’application de produits chimiques extrêmement coûteux. Bien que peu d’études décrivent une culture hydroponique sous conditions aseptiques8,19, l’Assemblée du système est généralement très laborieux, consistant en l’ajustement parfait des mailles de nylon en plastique ou en verre conteneurs5,8,17,20.
En raison de l’importance de l’Arabidopsis thaliana comme une plante modèle, la majorité des systèmes de culture hydroponique ont été conçue pour cette espèce1,2,8,14,18, 19 , 20. Néanmoins, il existe quelques études présentant les caractéristiques de la culture hydroponique d’autres espèces végétales avec un prétraitement des semences pour améliorer leur germination et synchronisation des taux in vitro8,16 . Afin de travailler sur une grande échelle, nous avons développé un protocole pour la mise en place d’un système hydroponique de maintenance simple et peu coûteuse qui permet des conditions stériles pour la culture de plantes, dont a. thaliana et autres espèces, comme l’herbe Setaria viridis. La méthode décrite ici est adaptée aux différentes expériences, comme la croissance des semis peut être maximisée, synchronisée et facilement contrôlée. En outre, ce système présente de nombreux avantages comme : (i) son montage est simple et ses composants peuvent être réutilisés ; (ii) elle permet l’application facile des différents produits chimiques dans le milieu liquide ; (iii) les semis germent et poussent directement dans le milieu de culture sans la nécessité du transfert vers le système de culture hydroponique ; (iv) la développement/croissance caulinaire et racinaire peut être étroitement surveillée et les semis sont récoltées sans dommages-intérêts ; et (v) elle permet de travailler sur une grande échelle, maintenir des conditions physiologiques.
Protocol
Representative Results
Discussion
Cette structure hydroponique optimisée permet la culture réussie in vitro de plantes. Les graines germent bien sur le milieu solide à la surface plane de pointe de pipette, un gain considérable par rapport aux systèmes où les graines sont trempées avec la solution nutritive. Un grand avantage de ce système est que, pendant le développement de la plantule, racines obtenir directement en contact avec le milieu liquide sans avoir besoin du transfert. En outre, traitement chimique peut être facilement appl…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Ce travail a été soutenu par la Fondation de recherche de São Paulo (FAPESP ; Accorder 12/19561-0) et la Société Max Planck. Elias F. Araújo (FAPEMIG 14/30594), Caroline C. Monte-Bello (FAPESP ; Grant 10407-14/3), Valéria Mafra (FAPESP ; Grant 14/07918-6), et Viviane C. H. da Silva (CAPES/CNPEM 24/2013) sommes reconnaissants pour les bourses. Les auteurs remercient Christian Meyer de l’Institut Jean Pierre Bourgin (INRA, Versailles, France) pour offrir généreusement anticorps contre RPS6. Les auteurs remercient RTV UNICAMP et Manoel Ed Paulo Aparecido de Souza pour leur soutien technique au cours de l’audio d’enregistrement.
Materials
| Ethanol | Merck | 100983 | |
| Sodium hypochlorite solution | Sigma-Aldrich | 425044 | |
| Polysorbate 20 | Sigma-Aldrich | P2287 | |
| Murashige and Skoog (MS) medium including vitamins | Duchefa Biochemie | M0222 | |
| 2-(N-morpholino)ethanesulfonic acid (MES) monohydrate | Duchefa Biochemie | M1503 | |
| Agar | Sigma-Aldrich | A7921 | |
| Potassium hydroxide | Sigma-Aldrich | 484016 | |
| Laminar flow hood | Telstar | BH-100 | |
| Hotplate | AREC | F20510011 | |
| Growth chamber | Weiss Technik | HGC 1514 | |
| Glass Petri dish (150 mm x 25 mm) | Uniglass | 189.006 | |
| 200 μL pipette tip racks | Kasvi | K8-200-5 * | |
| 300 μL multichannel pipette | Eppendorf | 3122000060 | |
| 300 μL pipette tips | Eppendorf | 30073088 | |
| 200 μL pipette | Eppendorf | 3120000054 | |
| 200 μL pipette tips | Eppendorf | 30000870 | |
| Scissors | Tramontina | 25912/108 | |
| Tweezer | ABC Instrumentos | 702915 | |
| Scalpel blade | Sigma-Aldrich | S2771 | |
| Adhesive transparent tape (45mm x 50m) | Scotch 3M | 5803 | |
| Disposable plastic boxes, external dimensions: 353 mm (L)x 178 mm (W) x 121mm (H) | Maxipac | 32771 |
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