स्वस्थ मस्तिष्क-पिट्यूटरी Teleost मछली में पिट्यूटरी कोशिकाओं की Electrophysiological जांच के लिए स्लाइस
Summary
लेख व्यवहार्य मस्तिष्क पिट्यूटरी ऊतक स्लाइस बनाने के लिए एक अनुकूलित प्रोटोकॉल का वर्णन, teleost मछली medaka का उपयोग (Oryzias latipes), पिट्यूटरी पैच का उपयोग कर कोशिकाओं के electrophysiological रिकॉर्डिंग के द्वारा पीछा-clamping तकनीक के साथ छिद्रित पैच विंयास ।
Abstract
पिट्यूटरी कोशिकाओं की Electrophysiological जांच कई हड्डीवाला प्रजातियों में आयोजित किया गया है, लेकिन teleost मछली में बहुत कुछ । इन के अलावा, स्पष्ट बहुमत असंबद्ध प्राथमिक कोशिकाओं पर प्रदर्शन किया गया है । कैसे teleost पिट्यूटरी कोशिकाओं के बारे में हमारी समझ में सुधार करने के लिए, एक अधिक जैविक रूप से प्रासंगिक वातावरण में व्यवहार, इस प्रोटोकॉल से पता चलता है कैसे व्यवहार्य मस्तिष्क पिट्यूटरी स्लाइसें छोटे मीठे पानी मछली medaka (Oryzias latipes) का उपयोग कर तैयार करने के लिए. मस्तिष्क पिट्यूटरी स्लाइसिंग बनाना, पीएच और सभी समाधान के परासरणीयता 25 से 28 डिग्री सेल्सियस पर रहने वाले मीठे पानी में मछली के शरीर के तरल पदार्थ में पाया मूल्यों के लिए समायोजित किया गया । टुकड़ा तैयारी के बाद, प्रोटोकॉल दर्शाता है कैसे electrophysiological छिद्रित पूरे सेल पैच-दबाना तकनीक का उपयोग कर रिकॉर्डिंग का संचालन करने के लिए । पैच-दबाना तकनीक अभूतपूर्व लौकिक संकल्प और संवेदनशीलता के साथ एक शक्तिशाली उपकरण है, एक आयन चैनलों के लिए नीचे बरकरार पूरे कोशिकाओं से बिजली के गुणों की जांच की अनुमति । छिद्रित पैच यह intracellular पर्यावरण पैच पिपेट इलेक्ट्रोड समाधान द्वारा पतला किया जा रहा से cytosol में नियामक तत्वों को रोकने बरकरार रहता है कि में अद्वितीय है. इसके विपरीत, जब पारंपरिक पूरे सेल रिकॉर्डिंग प्रदर्शन, यह है कि medaka पिट्यूटरी कोशिकाओं को जल्दी से कार्रवाई की क्षमता को आग की क्षमता खो देखा गया था । विभिंन वेध उपलब्ध तकनीक के अलावा, इस प्रोटोकॉल को दर्शाता है कि कैसे पैच फंजीसाइड Amphotericin बी का उपयोग कर झिल्ली के छिद्र को प्राप्त करने के लिए ।
Introduction
पिट्यूटरी hypothalamus और ऑप्टिक chiasm के पीछे के नीचे स्थित रीढ़ में एक प्रमुख अंत-स्रावी अंग है. यह उत्पादन और विशिष्ट कोशिका प्रकार से छह से आठ हार्मोन स्रावित करता है । पिट्यूटरी हार्मोन मस्तिष्क और परिधीय अंगों के बीच एक मध्यवर्ती का गठन और विकास, प्रजनन सहित आवश्यक शारीरिक प्रक्रियाओं की एक विस्तृत श्रृंखला ड्राइव, और homeostasis के विनियमन. न्यूरॉन्स के समान, अंत में पिट्यूटरी की कोशिकाओं को कार्रवाई क्षमता को सहज रूप से आग की क्षमता के साथ विद्युत उत्तेजित कर रहे हैं 1. इन कार्रवाई क्षमता की भूमिका कक्ष निर्भर है । स्तनधारी पिट्यूटरी के कई सेल प्रकार में, कार्रवाई की क्षमता intracellular Ca2 + पर्याप्त रूप से हार्मोन 2की एक निरंतर रिलीज के लिए तरक्की कर सकते हैं । इसके अलावा, पिट्यूटरी दोनों stimulatory और निरोधात्मक जानकारी मस्तिष्क कि कोशिकाओं 3,4,5,6की झिल्ली की क्षमता को प्रभावित करता है । आमतौर पर, stimulatory इनपुट उत्तेजित बढ़ जाती है और अक्सर 2 सीए की रिहाई शामिल है+ intracellular स्टोर से और साथ ही बढ़ फायरिंग आवृत्ति 7। समझ कैसे सेल आयन चैनल संरचना का उपयोग करता है और मस्तिष्क से इन इनपुट संकेतों के लिए अनुकूल है हार्मोन संश्लेषण और रिहाई को समझने के लिए महत्वपूर्ण है.
पैच-दबाना तकनीक देर से 1970 के दशक में Sakmann और Neher द्वारा विकसित किया गया था 8,9,10 और आगे Hamill द्वारा सुधार 11, और कोशिकाओं के electrophysiological गुणों की विस्तृत जांच की अनुमति देता है एकल आयन चैनलों के लिए नीचे । इसके अलावा, तकनीक दोनों वर्तमान और वोल्टेज का अध्ययन करने के लिए इस्तेमाल किया जा सकता है । आज, पैच-clamping सेल के electrophysiological गुणों को मापने के लिए सोने के मानक है । तंग सील पैच-दबाना तकनीक के चार प्रमुख विन्यास 11विकसित किया गया है; सेल-संलग्न, अंदर-बाहर, बाहर बाहर, और पूरे सेल पैच । तीन पहले विन्यास आमतौर पर एकल आयन चैनल जांच के लिए उपयोग किया जाता है. चौथे के लिए, सेल संलग्न विंयास के बाद, कोशिका झिल्ली में एक छेद उप वायुमंडलीय दबाव का उपयोग किया जाता है । इस विंयास भी पूरे 12सेल के आयन चैनल संरचना की जांच की अनुमति देता है । हालांकि, इस तकनीक की एक सीमा है कि cytoplasmic अणुओं पैच पिपेट 13 समाधान (चित्रा 1ए) द्वारा पतला कर रहे हैं, इस प्रकार अध्ययन किया कोशिकाओं के विद्युत और शारीरिक प्रतिक्रियाओं को प्रभावित. दरअसल, उन अणुओं में से कुछ संकेत के transduction में या विभिन्न आयन चैनलों के नियमन में महत्वपूर्ण भूमिका निभा सकते हैं. इस से बचने के लिए, लिंडाऊ और फर्नांडीज 14 एक तरीका है जहां एक ताकना बनाने यौगिक पैच पिपेट में जोड़ा जाता है विकसित की है । सेल संलग्न विंयास के बाद, यौगिक पैच के तहत प्लाज्मा झिल्ली में शामिल करने और धीरे cytosol (चित्रा 1ख) के साथ विद्युत संपर्क बनाने झिल्ली छिद्र होगा । ऐसे nystatin 15 और amphotericin बी 16, या सर्फेक्टेंट जैसे saponin बीटा-escin 17,18 के रूप में कई अलग विरोधी रोधी इस्तेमाल किया जा सकता है । इन यौगिकों बनाने के लिए काफी बड़े pores cytosol और पैच पिपेट के बीच monovalent कटियन और सीएल प्रसार की अनुमति है, जबकि cytosolic के अणुओं स्तर और Ca2 + 15की तरह बड़ा आयनों के संरक्षण, 16.
छिद्रित पैच का उपयोग करने की चुनौती संभावित उच्च श्रृंखला प्रतिरोध है । श्रृंखला प्रतिरोध (आरएस) या उपयोग प्रतिरोध पैच जमीन के सापेक्ष पिपेट पर संयुक्त प्रतिरोध है । पैच-दबाना रिकॉर्डिंग के दौरान, आरएस झिल्ली प्रतिरोध (आरएम)के साथ समानांतर में हो जाएगा । आरएम और आरएस एक वोल्टेज डिवाइडर के रूप में समानांतर काम में । उच्च आर एस के साथ, वोल्टेज रिकॉर्डिंग में त्रुटियों दे आरएस पर गिर जाएगी । त्रुटि दर्ज की गई बड़ी धाराओं के साथ बड़ा हो जाएगा । इसके अलावा, वोल्टेज डिवाइडर भी आवृत्ति एक कम पास फिल्टर बनाने निर्भर है, इस प्रकार लौकिक संकल्प को प्रभावित करने । प्रभाव में, छिद्रित पैच हमेशा वोल्टेज gated Na+ धाराओं की तरह बड़े और तेजी से धाराओं की रिकॉर्डिंग की अनुमति नहीं हो सकता है (विस्तृत रीडिंग के लिए संदर्भ 19देखें). इसके अलावा, आरएस पैच दबाना रिकॉर्डिंग के दौरान भिंन हो सकते हैं, फिर से दर्ज वर्तमान में परिवर्तन के लिए अग्रणी । इस प्रकार, झूठी सकारात्मक स्थितियों जहां आरएस दवा आवेदन के दौरान परिवर्तन में हो सकता है ।
कटा हुआ ऊतक पर इलेक्ट्रोफिजियोलॉजी पहले एंडरसन प्रयोगशाला द्वारा शुरू किया गया था मस्तिष्क में न्यूरॉन्स की electrophysiological विशेषताओं का अध्ययन करने के लिए 20. तकनीक ने एकल कक्षों की विस्तृत जांच के साथ ही सेल-सेल संचार और सेल सर्किट को अधिक अक्षुण्ण वातावरण में करने का मार्ग प्रशस्त कर रखा है । पिट्यूटरी स्लाइस करने के लिए एक समान तकनीक Guérineau एट अल द्वारा १९९८ में पेश किया गया था । 21. हालांकि, यह २००५ से पहले नहीं था, कि मस्तिष्क-पिट्यूटरी टुकड़ा तैयारी सफलतापूर्वक teleost 22में पैच-क्लैंप अध्ययन के लिए इस्तेमाल किया गया था । इस अध्ययन में, लेखकों को भी छिद्रित पैच दबाना रिकॉर्डिंग के उपयोग की सूचना दी । हालांकि, अब तक, पिट्यूटरी कोशिकाओं की electrophysiological जांच के अधिकांश स्तनधारियों में आयोजित किया गया है, और केवल एक मुट्ठी भर अन्य रीढ़, teleost मछली सहित 1,2,22,23 . teleosts में लगभग सभी अध्ययनों से प्राथमिक असंबद्ध कोशिकाओं पर प्रदर्शन किया गया 24,25,26,27,28,29,30 .
वर्तमान अखबार में, हम मॉडल मछली medaka से स्वस्थ मस्तिष्क पिट्यूटरी स्लाइस की तैयारी के लिए एक अनुकूलित प्रोटोकॉल रूपरेखा । दृष्टिकोण कई प्राथमिक असंबद्ध सेल संस्कृतियों की तुलना में लाभ का प्रतिनिधित्व करता है । सबसे पहले, कोशिकाओं असंबद्ध सेल संस्कृति की स्थिति की तुलना में एक अपेक्षाकृत संरक्षित वातावरण में दर्ज कर रहे हैं । दूसरा, स्लाइस तैयारी हमें अप्रत्यक्ष मार्ग सेल-सेल संचार 22, जो असंबद्ध सेल संस्कृति की स्थिति में संभव नहीं है द्वारा मध्यस्थता का अध्ययन करने के लिए अनुमति देते हैं । इसके अलावा, हम कैसे प्राप्त ऊतक के लिए छिद्रित पूरे सेल पैच-amphotericin बी के साथ ताकना बनाने एजेंट के रूप में तकनीक का उपयोग कर स्लाइस पर electrophysiological रिकॉर्डिंग का संचालन करने के लिए प्रदर्शन ।
Medaka एक छोटे मीठे पानी एशिया के लिए देशी मछली है, मुख्य रूप से जापान में पाया । फिजियोलॉजी, भ्रूणविज्ञान, और medaka के आनुवंशिकी बड़े पैमाने पर १०० साल 31के लिए अध्ययन किया गया है, और यह कई प्रयोगशालाओं में एक सामान्य रूप से इस्तेमाल किया अनुसंधान मॉडल है. इस कागज के लिए विशेष महत्व के hypothalamus के विशिष्ट रूपात्मक संगठन-teleost मछली में पिट्यूटरी जटिल है: जबकि स्तनधारियों और पक्षियों में हाइपोथैलेमस न्यूरॉन्स उनके न्यूरो हार्मोनों को विनियमित पिट्यूटरी स्रावी कोशिकाओं जारी औसत उभार के पोर्टल प्रणाली में, वहां teleost मछली ३२में पिट्यूटरी के अंत में स्रावी कोशिकाओं पर हाइपोथैलेमस न्यूरॉन्स के एक प्रत्यक्ष तंत्रिका प्रक्षेपण है. इस प्रकार, ध्यान से मस्तिष्क पिट्यूटरी टुकड़ा करने की क्रिया का आयोजन मछली में विशेष महत्व का है, हम एक अच्छी तरह से संरक्षित मस्तिष्क-पिट्यूटरी नेटवर्क में पिट्यूटरी कोशिकाओं के electrophysiological विशेषताओं की जांच करने के लिए अनुमति देता है, और विशेष रूप से कैसे पिट्यूटरी कोशिकाओं नियंत्रण उनकी उत्तेजितता और इस तरह2 सीए + homeostasis ।
Protocol
Representative Results
Discussion
Electrophysiological रिकॉर्डिंग मस्तिष्क पर पैच-दबाना तकनीक का उपयोग-पिट्यूटरी स्लाइसें सावधान अनुकूलन की आवश्यकता होती है. teleosts में विशेष रूप से लाइव सेल जांच के संचालन के लिए अच्छी तरह से अनुकूलित प्रोटोकॉल सीमि?…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
हम उसके medaka सुविधा बनाए रखने में मदद के लिए सुश्री LourdesCarreon जी टैन धंयवाद और उदाहरण के आंकड़े के लिए एंथनी Peltier । यह काम NMBU द्वारा और नॉर्वे, अनुदान संख्या २४४४६१ (जलीय कृषि कार्यक्रम) और २४८८२८ (डिजिटल जीवन नॉर्वे कार्यक्रम) के अनुसंधान परिषद द्वारा वित्त पोषित किया गया ।
Materials
| Vibratome | Leica | VT1000 S | |
| Chirurgical glue | WPI | VETBOND | 3M Vetbond Tissue Adhesive |
| Stainless steel blades | Campden Instruments | 752-1-SS | |
| metal molds | SAKURA | 4122 | |
| steel harp | Warner instruments | 64-1417 | |
| PBS | SIGMA | D8537 | |
| Ultrapure LMP agarose | invitrogen | 166520-100 | |
| patch pipettes | Sutter Instrument | BF150-110-10HP | Borosilicate with filament O.D.:1.5mm, I.D.:1.10mm |
| Microscope Slicescope | Scientifica | pro6000 | |
| P-Clamp10 | Molecular Devices | #1-2500-0180 | sofware |
| Digitizer Digidata 1550A1 | Molecular Devices | DD1550 | |
| Amplifier Multiclap 700B Headstage CV-7B | Molecular Devices | 1-CV-7B | |
| GnRH | Bachem | 4108604 | H-Glu-His-Trp-Ser-His-Gly-Leu-Ser-Pro-Gly-OH trifluoroacetate salt |
| pipette puller | Sutter Instrument | P-1000 | |
| amphotericin B | SIGMA | A9528 | pore-forming antibiotic |
| polyethylenimine | SIGMA | P3143 | 50% PEI solution |
| microfiler syringe | WPI | MF28/g67-5 | |
| glass for the agar bridge | Sutter Instrument | BF200-116-15 | Borosilicate with filament O.D.:2.0mm, I.D.:1.16mm Fire polished |
| Micro-Manager software | Open Source Microscopy Software | ||
| optiMOS sCMOS camera | Qimaging | 01-OPTIMOS-R-M-16-C | |
| sonicator | Elma | D-7700 singen | |
| NaCl | SiGMA | S3014 | |
| KCl | SiGMA | P9541 | |
| MgCl2 | SiGMA | M8266 | |
| D-Glucose | SiGMA | G5400 | |
| Hepes | SiGMA | H4034 | |
| CaCl2 | SiGMA | C8106 | |
| Sucrose | SiGMA | 84097 | |
| D-mannitol | SiGMA | 63565 | |
| MES-acid | SIGMA | M0895 | |
| BSA | SIGMA | A2153 |
References
- Stojilkovic, S. S., Tabak, J., Bertram, R. Ion channels and signaling in the pituitary gland. Endocr Rev. 31 (6), 845-915 (2010).
- Stojilkovic, S. S., Zemkova, H., Van Goor, F. Biophysical basis of pituitary cell type-specific Ca2+ signaling-secretion coupling. Trends Endocrinol Metab. 16 (4), 152-159 (2005).
- Van Goor, F., Goldberg, J. I., Chang, J. P. Dopamine-D2 actions on voltage-dependent calcium current and gonadotropin-II secretion in cultured goldfish gonadotrophs. J Neuroendocrinol. 10 (3), 175-186 (1998).
- Chang, J. P., Pemberton, J. G. Comparative aspects of GnRH-Stimulated signal transduction in the vertebrate pituitary – Contributions from teleost model systems. Mol Cell Endocrinol. , (2017).
- Heyward, P. M., Chen, C., Clarke, I. J. Inward membrane currents and electrophysiological responses to GnRH in ovine gonadotropes. Neuroendocrinology. 61 (6), 609-621 (1995).
- Ben-Jonathan, N., Hnasko, R. Dopamine as a Prolactin (PRL) Inhibitor. Endocrine Reviews. 22 (6), 724-763 (2001).
- Sanchez-Cardenas, C., Hernandez-Cruz, A. GnRH-Induced [Ca2+]i-signalling patterns in mouse gonadotrophs recorded from acute pituitary slices in vitro. Neuroendocrinology. 91 (3), 239-255 (2010).
- Neher, E., Sakmann, B. Single-channel currents recorded from membrane of denervated frog muscle fibres. Nature. 260 (5554), 799-802 (1976).
- Sakmann, B., Neher, E. Patch clamp techniques for studying ionic channels in excitable membranes. Annu Rev Physiol. 46, 455-472 (1984).
- Neher, E., Baker, P. F. . Techniques in cellular physiology. , 4-19 (1981).
- Hamill, O. P., Marty, A., Neher, E., Sakmann, B., Sigworth, F. J. Improved patch-clamp techniques for high-resolution current recording from cells and cell-free membrane patches. Pflugers Arch. 391 (2), 85-100 (1981).
- Cahalan, M., Neher, E. Patch clamp techniques: an overview. Methods Enzymol. 207, 3-14 (1992).
- Marty, A., Neher, E., Sakmann, B., Neher, E. . Single Channel Recording. , 113-114 (1983).
- Lindau, M., Fernandez, J. M. IgE-mediated degranulation of mast cells does not require opening of ion channels. Nature. 319 (6049), 150-153 (1986).
- Horn, R., Marty, A. Muscarinic activation of ionic currents measured by a new whole-cell recording method. J Gen Physiol. 92 (2), 145-159 (1988).
- Rae, J., Cooper, K., Gates, P., Watsky, M. Low access resistance perforated patch recordings using amphotericin B. J Neurosci Methods. 37 (1), 15-26 (1991).
- Fan, J. S., Palade, P. Perforated patch recording with beta-escin. Pflugers Arch. 436 (6), 1021-1023 (1998).
- Hodne, K., von Krogh, K., Weltzien, F. A., Sand, O., Haug, T. M. Optimized conditions for primary culture of pituitary cells from the Atlantic cod (Gadus morhua). The importance of osmolality, pCO(2), and pH. Gen Comp Endocrinol. 178 (2), 206-215 (2012).
- Sigworth, F. J., Sakmann, B., Neher, E. . Single-Channel Recording. , 3-35 (1983).
- Andersen, P. Brain slices – a neurobiological tool of increasing usefulness. Trends in Neurosciences. 4, 53-56 (1981).
- Guerineau, N. C., Bonnefont, X., Stoeckel, L., Mollard, P. Synchronized spontaneous Ca2+ transients in acute anterior pituitary slices. J Biol Chem. 273 (17), 10389-10395 (1998).
- Levavi-Sivan, B., Bloch, C. L., Gutnick, M. J., Fleidervish, I. A. Electrotonic coupling in the anterior pituitary of a teleost fish. Endocrinology. 146 (3), 1048-1052 (2005).
- Guerineau, N. C., McKinney, R. A., Debanne, D., Mollard, P., Gahwiler, B. H. Organotypic cultures of the rat anterior pituitary: morphology, physiology and cell-to-cell communication. J Neurosci Methods. 73 (2), 169-176 (1997).
- Yu, Y., Ali, D. W., Chang, J. P. Characterization of ionic currents and electrophysiological properties of goldfish somatotropes in primary culture. Gen Comp Endocrinol. 169 (3), 231-243 (2010).
- Price, C. J., Goldberg, J. I., Chang, J. P. Voltage-activated ionic currents in goldfish pituitary cells. Gen Comp Endocrinol. 92 (1), 16-30 (1993).
- Van Goor, F., Goldberg, J. I., Chang, J. P. Electrical membrane properties and ionic currents in cultured goldfish gonadotrophs. Can J Physiol Pharmacol. 74 (6), 729-743 (1996).
- Xu, S., Shimahara, T., Cooke, I. M. Capacitance increases of dissociated tilapia prolactin cells in response to hyposmotic and depolarizing stimuli. Gen Comp Endocrinol. 173 (1), 38-47 (2011).
- Haug, T. M., Hodne, K., Weltzien, F. A., Sand, O. Electrophysiological properties of pituitary cells in primary culture from Atlantic cod (Gadus morhua). Neuroendocrinology. 86 (1), 38-47 (2007).
- Strandabo, R. A., et al. Signal transduction involved in GnRH2-stimulation of identified LH-producing gonadotropes from lhb-GFP transgenic medaka (Oryzias latipes). Mol Cell Endocrinol. 372 (1-2), 128-139 (2013).
- Hodne, K., et al. Electrophysiological differences between fshb- and lhb-expressing gonadotropes in primary culture. Endocrinology. 154 (9), 3319-3330 (2013).
- Wittbrodt, J., Shima, A., Schartl, M. Medaka–a model organism from the far East. Nat Rev Genet. 3 (1), 53-64 (2002).
- Ball, J. N. Hypothalamic control of the pars distalis in fishes, amphibians, and reptiles. Gen Comp Endocrinol. 44 (2), 135-170 (1981).
- . pCLAMP 10 Data Acquisition and Analysis For Comprehensive Electrophysiology User Guide. Molecular Devices Corporation. , (2006).
- . MultiClamp 700B COMPUTER-CONTROLLED MICROELECTRODE AMPLIFIER Theory and Operation. Axon Instruments / Molecular Devices Corp. , (2005).
- Dominguez-Mancera, B., et al. Leptin regulation of inward membrane currents, electrical activity and LH release in isolated bovine gonadotropes. Biochem Biophys Res Commun. 491 (1), 53-58 (2017).
- Schmidt-Nielsen, K. . Animal Physiology : adptation and environment fifth edition. , 613 (1997).
- Burton, R. F. Evolutionary determinants of normal arterial plasma pH in ectothermic vertebrates. J Exp Biol. 205, 641-650 (2002).
- Burton, R. F. The dependence of normal arterial blood pH on sodium concentration in teleost fish. Comparative Biochemistry and Physiology Part A: Physiology. 114 (2), 111-116 (1996).
- Heming, T. A., Blumhagen, K. A. Plasma acid-base and electrolyte states of rainbow trout exposed to alum (aluminum sulphate) in acidic and alkaline environments. Aquatic Toxicology. 12 (2), 125-139 (1988).
- Reeves, R. B. The interaction of body temperature and acid-base balance in ectothermic vertebrates. Annu Rev Physiol. 39, 559-586 (1977).
- Baicu, S. C., Taylor, M. J. Acid-base buffering in organ preservation solutions as a function of temperature: new parameters for comparing buffer capacity and efficiency. Cryobiology. 45 (1), 33-48 (2002).
- Miyanishi, H., Inokuchi, M., Nobata, S., Kaneko, T. Past seawater experience enhances seawater adaptability in medaka, Oryzias latipes. Zoological Lett. 2, 12 (2016).
- Cass, A., Finkelstein, A., Krespi, V. The ion permeability induced in thin lipid membranes by the polyene antibiotics nystatin and amphotericin B. J Gen Physiol. 56 (1), 100-124 (1970).
- Holz, R., Finkelstein, A. The water and nonelectrolyte permeability induced in thin lipid membranes by the polyene antibiotics nystatin and amphotericin B. J Gen Physiol. 56 (1), 125-145 (1970).
