JoVE Journal > Cancer Research
Summary
Abstract
Introduction
Protocol
Results
Discussion
Disclosures
Acknowledgements
Materials
References
Türkçe

Automatically Generated
Please note that all translations are automatically generated. Click here for the English version.
Cancer Research

Kronik Lenfositik Lösemi içinde immünglobulin Gene dizi analizi: Sıra yoruma hasta malzemeden

Published: November 26, 2018
doi:
10.3791/57787
, , , , , , , , ,
1Institute of Applied Biosciences,Centre for Research and Technology Hellas, 2Department of Immunology, Genetics and Pathology, Science for Life Laboratory,Uppsala University, 3Department of Molecular Medicine and Surgery,Karolinska Institutet, 4Division of Immunology, Transplantation and Infectious,IRCCS San Raffaele Scientific Institute, 5Department of Immunology, Laboratory for Medical Immunology,Erasmus University Medical Center, 6Hematology Department,Nikea General Hospital, 7Assistance publique – Hôpitaux de Paris (AP-HP), Hopital Pitié-Salpêtrière, Department of Hematology, and UPMC University Paris 06, UMRS 1138, 8Division of Experimental Oncology,IRCCS Istituto Scientifico San Raffaele and Università Vita-Salute San Raffaele

Summary

Burada, biz ayrıntıları teknik özellikleri ve sağlam IG Gen Dizi Analizi hastalarda kronik lenfositik lösemi (CLL), emin olmak için temel gereksinimleri dayalı Avrupa araştırma girişimi birikmiş deneyim bir iletişim kuralı mevcut CLL (ERIC).

Abstract

B hücre olgunlaşma sırasında immünglobulin (Ig) gen V (D) J rekombinasyon karmaşık süreci somatik Hipermutasyon (SHM) verir yükselmeye her bireysel B hücre içinde benzersiz bir DNA dizisi ile birleştiğinde. B hücre maligniteler tek bir hücre klonal genişlemesi sonucu beri IG genler benzersiz bir moleküler imza ortak içinde bireysel bir hasta tüm kötü huylu hücreleri temsil eder; Böylece, IG gen Düzenlemeler klonal işaretleri kullanılabilir. Önemli klonal tanımlayıcı olarak hizmet veren ek olarak, o belirli gelişim dönemleri ile ilişkilidir ve bu nedenle B hücrenin neoplastik dönüşüme dahil tarihinin yansıtır IG gen dizisi ‘moleküler timeline’ davranabilir. Ayrıca, belirli maligniteler için özellikle kronik lenfositik lösemi (CLL), IG gen dizisi prognostik ve potansiyel olarak akıllı yetenekleri içerir. Yani, IG Gen Dizi Analizi anlamlı sonuçları extrapolating güçlü Yöntemler ve araçlar onların analizde yardım mevcut değildi Eğer imkansız olacağını söyledi. Bu makalede, Avrupa araştırma girişimi CLL (ERIC), Ayrıntılar teknik özellikleri ve þartlarý CLL, şimdi tavsiye edilir bir test olarak güvenilir ve tekrarlanabilir IG Gen Dizi Analizi sağlamak için gerekli büyük deneyimi üzerinde çizim tedavi öncesinde tüm CLL hastalar için. Daha ayrıntılı olarak, çeşitli analitik aşamaları clonotypic IG gen yeniden tanımlaması ve nükleotid dizisi belirlenmesi IG gen dizisi verileri doğru klinik yoruma kadar geniş açıklanmıştır.

Introduction

Kronik Lenfositik Lösemi (CLL), lösemi Batı ülkelerinde erişkinlerde en sık görülen olgun neoplastik B hücreleri1klonal genişlemesi ile karakterizedir. Klinik bir bakış açısından, hastalığın agresif bir hastalık yaşıyor, çok erken tanı sonra tedavi gerektiren ve kez relaps veya refrakter terapiye bazı hastalar ile son derece değişken bir derstir. Alışılmışın tersine tembel bir hastalığı ile mevcut, asla tedavi gerektirir ve sağlıklı bireyler yaş eşlemeli2‘ ye benzer bir yaşam beklentisi olan hastalar (~ %30) önemli bir kısmı bu. Bu klinik heterojenite sonuçta sürücü patogenez ve bu hastalığı3ilerlemesini CLL hastalarda bulunan moleküler anormallikleri çeşitliliği yansıtılır.

Kuran bir doğru CLL tanı genellikle basittir, ancak, yukarıda belirtilen klinik heterojenite CLL hastaların etkili yönetim engelleyebilir ve yardımcı prognostik ve akıllı işaretler ihtiyacını vurgular tedavi karar verme2. Çok sayıda çalışma roman klinik ve biyolojik işaretleri önerilen4olmak bir bolluk içinde sonuçlanan CLL prognostication iyileştirmek için çalıştılar. Mutational clonotypic immünglobulin ağır değişken (IGHV) gen bir en güçlü prognostik işaretleri CLL içinde büyük ölçüde (i) bu zamanla ve hastalık ilerledikçe olarak sabit kalır ve (ii) diğer bağımsız nedeniyle Aslında bu durum klinik ve biyolojik parametreler5. Rağmen çok az, varsa işaretçileri, IGHV mutational durum, dahil olmak üzere şu anda klinik rutin tanı anında uygulandığını.

İlk raporlar IG gen sıralama CLL tarih 1999, Otelde 2 bağımsız çalışmalar bildirdi Hayır bu hastalarda veya en az somatik Hipermutasyon (SHM) yük (unmutated CLL, U-CLL) kadar geriye klinik yarar var taşıyan hastalara göre daha kötü olacağını tahmin bir daha yüksek SHM yük (mutasyona uğramış CLL, M CLL)6,7. Daha ayrıntılı olarak, az veya hiç SHM ile clonotypic IGHV gen yataklık olguların U-CLL grup oluşuyordu ve dolayısıyla en yakın germline IGHV gen (≥98%), yüksek bir yüzde kimliğe ise daha yüksek bir mutational yük olan olguların M CLL oluşuyordu (yüzde kimliğine En yakın germline IGHV gen < % 98). Beri erken bu çalışmalar, bu sürekli U-CLL durumlarda daha kısa zaman ilk tedavi (TTFT) ve genel sağkalım (OS) M-CLL için karşılaştırıldığında görüntülemek gösterilmiştir.

Gez, seminal bu çalışmalar B hücre reseptörü (böylece önünü BcR) IG CLL pathobiology içinde önemli rolü için kapsamlı bir araştırma yol açan, sırayla için daha kapsamlı bir takdir CLL microenvironmental etkileşimleri içine vurgulanmış biyolojik heterojenite bu hastalık8,9. Daha yeni çalışmalar (yarı) aynı BcR IG gen dizileri paylaşımı nedeniyle alt kümeleri içinde tek tek servis taleplerini küme açığa tarafından CLL immunogenetic analizleri önemi için ek destek sağlamış, bir fenomen olarak adlandırdığı BcR IG stereotipi10 ,11,12,13. Kanıt biriken kavramı açıkça onları aynı SHM kategori içinde ancak farklı IG gen dizileri ile diğer CLL hastalardan ayrı aynı basmakalıp alt liman benzer clinicobiological özellikleri için atanan bu hastalar destekler; Bu gerçekten de CLL hastalar daha fazla BcR IG stereotipi üzerinde göre sınıflandırılması CLL hastaların toplu segregasyon U-CLL veya M CLL grupları14,15,16, içine iyileştirir bildirilmiştir 17 , 18 , 19 , 20.

Klinik bir bakış açısından, bu clonotypic IGHV gen SHM durumunu chemoimmunotherapy belirli bir tepki ile ilişkili gibi görünüyor dikkat çekicidir. Belirli, M CLL hastalarda fludarabine/siklofosfamid/rituximab (FCR) bir kombinasyonu ile tedavi, altın standart tedavi TP53 gen kusurları, eksik tıbbi olarak uygun CLL hastalar için sergilenen önemli ölçüde daha fazla ilerleme ücretsiz hayatta kalma (PFS) ve aynı tedavi21,22,23alınan U-CLL hastalara göre OS. Bu nedenle, SHM durumu tanımlaması özellikle tedavi yönetiminde CLL hastalar Yani, akıllı bir işaretleyici yardım için olmak yerine, servet hastalığı Yani, klinik seyri değerlendirmek için önemli bir prognostik işaretçisi. Aslında, CLL üzerine uluslar arası çalıştay hazırladığı ncı sponsorluğunda kılavuzları son güncelleştirme göre düzenlenmiş IGHV genler SHM durumunu tedavi başlatma her iki Genel uygulamada önce tüm CLL durumlarda kararlı ve klinik olmalıdır denemeler24. Ayrıca, yakın gelecekte5CLL hastalarının tedavi yönetiminde roman tedavi ajanları ve uyuşturucu çalışmalarda giderek artan sayıda son onay sayesinde, IG molekül SHM durumunu daha büyük bir rol oynayabilir.

Bu rapor IG Gen Dizi Analizi, uygun malzeme seçimi ve sıralama sonuçları klinik yorumu ile sonuçlanan ile başlayan tüm yönleriyle ayrıntıları. Bu adımların ayrıntılı değerlendirme tanı rutin üretim güvenilir sonuçlar ve klinik çalışmalar içinde doğru hasta stratifikasyon sağlamak için önemlidir. İletişim kuralları IG Gen Dizi Analizi, böylece sonuçları farklı laboratuvarlar arasında karşılaştırılabilir sağlanması yasaların uyumlaştırılması yardım sağlanır.

Protocol

Araştırma Protokolü San Raffaele bilimsel Enstitüsü, Milan, İtalya, Etik Komitesi tarafından kabul edildi. 1. malzeme seçimi Malzeme başlayan seçimNot: CLL çoğu durumda tümör hücre sayısı tanıyı yüksek (> % 80-90). Böylece, hücre sıralama veya zenginleştirme lösemik hücrelerin genellikle gerekli değildir. Periferik kan (PB) kullanarak, bir kan hacmi 10-20 mL arasında seçim en yaygın malzeme IG gen dizi analizi için kullanın. Alternatif olarak, düşük bir CLL hücre yük durumlarda, PB örnekleri veya kemik iliği (BM) veya lenf düğümleri (LN) gibi diğer dokulara malzemeden hücre sıralama kullanın. Örnekleme zamanı Örnekleme zamanında IG SHM durumu istikrarlı fazla mesai verilen bu çok önemli değildir; analiz karmaşık ve güvenilir olmayan sonuçlara yol CLL hücre düşük sayısı belli dönemlerde örnekleme gibi terapi sırasında veya hemen sonra kaçının beri dedi. Malzeme toplama ve depolamaNot: Toplama ve depolama malzeme başlayan bağlıdır güçlü malzeme seçimi. PB ya da BM örnekleri için EDTA veya CPT (sitrat-tris-pyridossalphosphate) koleksiyonu tüpler PCR güçlendirme işleminin inhibisyonu engellemek için kullanın; Alternatif olarak, heparin tüpler kullanın. LN örnekleri için her iki hücre süspansiyonlar, biyopsi taze donmuş doku veya nadir durumlarda formalin sabit parafin gömülü (FFPE) dokularda toplama seçenekleri vardır. 2. yoğunluk Gradient ayırma Not: PB ya da BM en sık senaryodur, seçim başlangıç materyali yoğunluk gradient ayrımı yöntemi kullanılarak mononükleer hücre yalıtım önerilir. EDTA 200 µL ekleyin (0,5 M EDTA / pH 8.0) 50 mL steril toplama tüp için. 20 mL Türkçe ve RPMI 15 mL ekleyin. Pipetting tarafından Mix (2 – 3 kez yeterlidir). Yoğunluk gradient orta 15 mL yeni bir 50 mL toplama tüp ekleyin.Not: PB birim daha az 20 mL olması durumunda, RPMI (önceki adımı) ve yoğunluk gradient hacimleri buna göre değiştirilmesi gerekir. Böylece geçişin bozmak değil yavaş yavaş adım 2.1 çözümde katman. De 800 x g 20 dakika santrifüj fren ile kapalı santrifüj kapasitesi. Üst plazma/trombosit katman ve yoğunluk gradient orta katman steril bir Pasteur pipet kullanarak arasında kurdu mononükleer hücre halka toplamak sonra steril 15 mL toplama tüp aktarmak. RPMI 12 mL nihai bir birime ekleyip karıştırın. 750 x g de 8 dakika santrifüj kapasitesi. Süpernatant atmak. RPMI 10 mL kullanarak hücre Pelet resuspend ve 2.5 arasındaki adımları yineleyin. Hücre Pelet PBS (DPBS, kalsiyum, magnezyum yok) 1 ml geçiyoruz. Örnek 20 µL ve 1:10 80 µL karıştırarak Neubauer plaka kullanan bir hücre sayısı gerçekleştirmek Türk’ın çözüm. Örnek aşağı akım işleme için aynı gün zamanlanmamışsa örneği 750 x g’için 8 dakika santrifüj kapasitesi. Süpernatant atmak ve-80o C., hücre Pelet depolamak 3. nükleik asit çıkarma Bir substrat IG genler SHM durumunu analiz için karar verin. Bir ters transkripsiyon adım gerek yok olduğu genomik DNA (gDNA) en popüler seçimdir; Alternatif olarak, RNA/tamamlayıcı DNA (cDNA) kullanımı en az transkripsiyon düzeyinde, üretken, fonksiyonel clonotypic IG düzenlenmesi “tercih” hedef, sağlanır. Çok sayıda piyasada kitleri gDNA veya toplam RNA çıkarma için uygun ve cDNA sentezi kullanın (bkz. Tablo malzeme). DNA veya RNA hassas nükleik asit miktar sistemleri kullanarak bütünlüğünü değerlendirmek. FFPE malzeme analiz için kullanarak değerlendirmek Eğer kalite ve ayıklanan gDNA/cDNA miktarı bir bilinen temizlik gene, Örneğin retinoik asit reseptör Alfa (RARa), PCR güçlendirme tarafından beta-aktin, vb. 4. güçlendirme ve IGHV-IGHD-IGHJ Gene düzenlemeler sıralama IGH PCR astar seçimi Tercihen, multiplex PCR ile IGHV alt grubu belirli 5′ astar ve IGHJ gen belirli 3′ astar25,26gerçekleştirin. Eğer sonuçları alt-optimal, tek IGHV alt grubu özel primerler kullanılarak ayrı PCR karışımları hazırlayın. Bu da bulunan lider bölgedeki tavlama 5′ astar kullanmak IG düzenlenmesi veya IGHV gen Kodlayıcı bölge (Örneğin çerçeve 1, FR1) alanlarında hemen ters yönde. Buna karşılık SHM düzeylerinin doğru tahmin sağlayacak tüm düzenlenmiş IGHV-IGHD-IGHJ gen sıra, amplifikasyon için izin lideri astar kullanın. Böylece, IGHV lideri astar Güncellenme Zamanı kendi kurallarına IG gen dizisini analiz27ERIC tarafından tavsiye edilir. Nerede clonotypic IG düzenlenmesi yükseltmek için lider astar başarısız durumlarda, IGHV FR1 astar kullanın. Ancak, çerçeve astar SHM düzeyini yanlış belirlenmesine yol açabilir tüm clonotypic IG gen düzenlenmesi yükseltmek değil. Bu senaryo için açıkça devlet klinik raporunda IGHV FR1 astar kullanımı gerçek yüzde kimliğini en yakın germline gen için abartma. 3′ ucu için fikir birliği astar hedefleme IGHJ genler, IGHJ gene özgü astar veya bağlı olarak substrat izotip özgü astar multiplex set kullanın. Astar tavlama için çeşitli yerlerde Şekil 1 gösterir, ancak astar dizileri Tablo 1’de verilmektedir. IGHV-IGHD-IGHJ gen Düzenlemeler amplifikasyon PCR Her alt grubun primer(s) ekimolar miktarlarda tarafsız amplifikasyon sağlamak için astar karışımının hazırlayın. Örneğin, lider primerler kullanılarak, iki farklı astar IGHV1 alt grubu ait düzenlemeler yükseltmek için kullanılır. Böylece, yarısı IGHV4 alt grubu düzenlemeler için tek astar IGHV4L karşılaştırılır (IGHV1L ve IGHV1bL) Bu 2 astar miktarı kullanın. IGHJ1-2 ve IGHJ4-5 astar durumunda ters yaklaşım geçerlidir. Bu astar iki farklı IGHJ gen alt gruplar hedef olarak IGHJ3 ve IGHJ6 astar göre miktarı iki katına. Tablo 1 ilgili astar karışımları hazırlanırken tam astar miktarlarını belirlemek için kullanın. Tablo 2′ de listelenen Mix PCR reaktif. PCR tüp içinde PCR reaktif birleştirerek sonra eklemek Taq polimeraz 0.5 µL ve 100 ng gDNA veya 2 µL cDNA (cDNA hazır RNA’ın 1 µg kullanarak).Not: etkinlik düzelti ile Taq enzim amplifikasyon hata oranı son derece düşüktür ve bu nedenle SHM düzeyini etkilemez, gerekli değildir. Tablo 3′ te ayrıntılı termal PCR Protokolü çalıştırın. Clonality değerlendirmeNot: Clonality desen PCR ürünü değerlendirmek kritik bir sonraki adım içerir. CLL hastalarda clonality değerlendirirken, en yaygın bir tek, monoklonal tepe/grup bulgudur. Yöntemleri ile yüksek-duyarlı, analizi, parça veya heteroduplex gibi clonality değerlendirme28,29için kullanın. Parça Analizi Çoklu PCR 5′ etiketli IGHV lider ya da FR1 alt grubu belirli PCR astar kullanarak gerçekleştirmek; Bu kılcal Elektroforez tarafından ayrılmış PCR ürünleri ortaya çıkarır, böylece clonality değerlendirilmesi IGH PCR ürünleri izin onların IGHV tamamlayıcılık bölge belirleme 3 (CDR3) uzunlukları göre. Astarlar, reaktifler ve termal durumların daha önce bahsedilen bu (bakınız Tablo 1-3) için aynı kullanın. Özel 5´-astar etiketli fluorescently etiketlenir oligos boyalar üzerinde 5′ uç seçeneği ile. 6-FAM, HEX, NED veya TET muhabir boyalar örnekleridir. Böylece, 2 ayrı reaksiyonlar tepki başına 3 farklı boya kullanımı temel gerekli değildir. 1 kullanarak PCR ürünlerde (Bu yüzde sonuçları en iyi çözünürlük) bir yüzde (% 6) polyacrylamide jel boyutunu değerlendirmek x TBE çalışan bir tampon olarak. 80 çalıştırmak için 45 dk V.Not: Bu PCR ürünleri üzerinde jel böylece monoklonal örnekleri poliklonal kökenli ayrılabilen ve DNA boyutu marker yeterince ayırabilirsiniz yeterli zaman geçirmek için izin verilen tavsiye edilir. Boyutu ve kalınlığı jel gibi faktörler Hayır tek ayar (gerilim ve zaman), örnek de geçirme riskini en aza indirir gibi 45 dakikadır 80 V gerilim ayarı iyi bir başlangıç noktası olduğunu söyledi bir en iyi sonuç garanti edemez geçiş etkileyebilir hızlı bir şekilde ve ‘çalışan’ off jel. Yaklaşık 500 baz IGHV lideri primerler kullanılarak zaman çifti ve 350 baz çifti PCR ürünleri için IGHV FR1 astar karışımları kullanarak kontrol edin.Not: ender durumlarda CLL durumlarda çift, monoklonal ürünleri taşımak tespit edilmiştir ve hatta nadir durumlarda, bir oligokonal desen durumlarda sergileyebilirler. İntercalating bir ajan gibi etidyum bromür (EtBr) veya daha az tehlikeli ve daha hassas piyasada bulunan DNA lekeleri DNA görselleştirme akrilamid jelleri UV uyarma veya mavi ışık kullanarak tarih için kullanılabilir. PCR ürünü arıtmaNot: PCR ürünleri için suboptimal sıralama neden olabilir dimer CLL örnek hem de astar içinde normal B hücreleri kaynaklanan poliklonal herhangi bir arka plan çıkarmak için saf. Adi dNTPs ve astar için PCR temizlik, enzimatik bir tedavisi, Örneğin, Sap (karides alkalen fosfataz) gibi kaldırır herhangi bir yöntemi kullanın / Exo (eksonükleaz ben), veya sütunlara göre arıtma. PCR ürünü % 3 düşük erime özel jel üzerine toplam hacmi yükleyin. PCR ürünler onlar ayrı arka plan kadar jel üzerinde çalışmaya olanak sağlar. Keskin, tanınmış PCR bantları tüketim, arındırmak ve elute. İki düzenlemeler algıladıysa, her iki grup eksize ve ayrı sıralı. SAP/Exo temizlik gerçekleştirmek için kullanmak için belirli birimleri ile ilgili üreticinin yönergeleri izleyin; Ancak tipik bir tepki 1 µL içerebilir Sap, 0. 5 µL Exo ve 2 µL 5 x kuluçka arabellek 5-10 µL PCR reaksiyon. Yavaşça vortexing tarafından her örnek mix ve 37 ° C’de PCR blokta 30 dakika boyunca kuluçkaya. 15 dakika ila 85 ° C Isıtma tarafından enzimler devre dışı bırakabilirsiniz. PCR ürünleri ürün saflığı değerlendirmek için %3 özel jel üzerinde küçük bir miktar yük. 5. Sanger sıralama Not: çeşitli sıralama stratejiler vardır, ancak, tam yaklaşım ne olursa olsun, her iki ipliklerini sıralama doğrudan güvenilir bir sonuç sağlamak için zorunludur. Genel sıralama iletişim kuralları Amplifikasyon tek primerler kullanılarak gerçekleştirilen, uygun IGHV – ve IGHJ – veya sabit bölge-özgül primerler kullanılarak sıralama ile devam edin. Bu yaklaşım da kabul edilmesi fluorescently multiplexed etiketli astar kullanılmıştır ve PCR ürünü parça Analizi (sıralama primerler değil biçiminde etiketlenmiş olmalıdır) ile değerlendirildi. Çoğaltılmış astar kullanılan ve clonality üzerinde bir jel değerlendirildi sonra bir aşağı akım astar sıralama Örneğin bir fikir birliği IGHJ astar, ilk aşamada 5′-GTGACCAGGGTNCCTTGGCCCCAG-3 olmak sıra ile kullanırsanız,’. Alternatif olarak, bir CH astar cDNA substrat kullanıldığında kullanılabilir. Daha sonra alt grup özel IGHV lider ya da FR1 astar ikinci sıralama adım için kullanın. Örnek sıralama iletişim kuralıNot: Çeşitli sıralama protokoller bulunmaktadır ve bir örnek Protokolü aşağıda ayrıntılı. 33 seyreltik toplam hacmi kullanarak, Örneğin, steril su 11,5 µL PCR ürünü ng. PCR ürünü 5 dakika ila 95 ° C Isıtma tarafından denatüre. Hemen buz ikincil yapılar oluşumunu önlemek 10 dakika yerleştirin. Her tüp (5 pmol için karşılık gelen) 0.5 µL astar ile birlikte 8 µL ana karışımı ekleyin. Bir denetim olarak ana karışımı 8 µL, 0.5 µL pUC18 denetim şablonu, 2 µL (-) 47 sıralama astar ve 9,5 µL steril su içeren bir tüp hazırlayın. Son toplam hacim her tüpün içinde 20 µL olmalıdır. Ayrıntılı Tablo 4olarak sıralama reaksiyon için Termal Bisiklet koşullarını kullanın. Sodyum asetat 3 M (pH 5.2), 2 µL 2 µL karıştırılarak durdurmak çözüm hazırlamak EDTA 100 Mm (pH 8.0) ve glikojen 1 µL (konsantrasyon 20 mg/mL), her örnek için 5 µL ekleyin. Ürün yeni bir microcentrifuge tüp aktarın. 60 µL % 100 etanol (-20 ° C) ekleyin ve karışımı yavaşça. 14.000 rpm’de santrifüj kapasitesi 15 dakika (4 ° C). Süpernatant atmak. 100 µL % 70 etanol (-20 ° C) ekleyin ve karışımı yavaşça. 14.000 rpm’de santrifüj kapasitesi 10 dakika (4 ° C). Süpernatant atmak. Bir kez yinelenir. Pelet oda sıcaklığında 90 dakika kuru. 40 µL Sodyum Lauryl Sülfat (SDS) çözüm her örnek için ekleyin. Örnek bir sıralama plakasına, transfer kapak ile şerit büyük harf ya da teyp mühürler, yük makineye ve Sanger gerçekleştirmek sıralama. Sıralama plaka genellikle bir 96-Peki, v-alt, tam-etek PCR plaka Sequencer’ı ile uyumlu olduğunu. Tabakları barkodlu nasıl yapılacağını şirket içinde gerçekleştirilecek olmasına bağlı olarak, ticari bir şirket veya bir akademik sıralama merkezi/platform olabilir. Sıralama sonra ‘bir tam IGHV gen düzenlenmesi Yani, fikir birliği sıra oluşturmak için bireysel sıralama adımlardan oluşturulan 2 okuma birleştirmek’. 6. dizi analizi Not: Aşağıdaki bölümleri odağı analiz ederken IMGT/V-QUEST aracı30 dan elde edilen çıktıyı IG dizileri ve IMGT/JunctionAnalysis31ikisi de özellikle klinik raporlama ve araştırma için uygundur, yeniden düzenlenmiş çalışmalar. IMGT/V-arayışı IG dizileri IMGT başvuru directory ile30ayarlar Kullanıcı karşılaştırır bir hizalama araç gönderilmiş olduğunu. Araç çıktı Kullanıcı belirli parametreleri tanımlamak içinde çeşitli bölümler içerir. Tür, Örneğin, Homo sapiens (insan) ve reseptör tip veya odağı (Örneğin IGH, IGK veya IGL) belirtin. Dizileri, FASTA formatı ve üstbilgiler, dahil metin alanına (toplu işlem başına en fazla 50 sıralarının) içine analiz edilecek yapıştırın. Alternatif olarak, FASTA dizileri içeren bir yerel dosya yolunu girmek için bir seçeneği sağlanır. Sonuçlar için aşağıdaki 3 görüntüleme seçeneklerinden birini seçin: Ayrıntılı görünümü: tek tek her sıra için sonuçları almak için bu seçeneği seçin. Sentez görünümü: bir Özet Tablo IGHV ve gen alleli ad veya sıra giriş sipariş sipariş derlemek için bu seçeneği seçin. Bu seçenek ayrıca, gönderilen herhangi bir toplu iş, aynı IGHV gen ve gen atanan dizileri bir uyum sağlar. Excel dosyası: tüm dosyaları tek bir dosyaya dahil elektronik tablolar olarak çıktı sağlamak için bu seçeneği seçin. Tüm görüntüleme seçenekleri, ancak seçim için temel ve Gelişmiş parametreleri geniş bir yelpazesi var sadece CLL IG dizi analizi için en geçerli faktörün ‘Temsilcisi sonuçları’ bölümünde aşağıda ele alınmıştır. 7. tutuklama/AssignSubsets aracı BcR IG stereotipi CLL (Ayrıntılar aşağıda ‘Temsilcisi sonuçları’ bölümünde sağlanan) içinde araştırmak için IGHV-IGHD-IGHJ FASTA dizileri tutuklama/AssignSubsets aracı32gönderin. Araç alt kümeleri büyük CLL atamaya kalıplaşmış raporlar. Alt-atama aracı ile birlikte ayrıntılı talimatlar bulunmaktadır, tutuklama/AssignSubset Web sitesi32 ve aynı zamanda ERIC Web sitesi Hizmetleri sekmesi altında.

Representative Results

Aşağıda verilen örnekler IG gen sıralama Analizi aşağıdaki adımları yukarıda ayrıntılı elde edilen sonuçları göstermektedir. DNA ve/veya RNA ayıklama olmakla birlikte çoğu klinik/araştırma laboratuarlar için rutin prosedürleri, ilk kritik adım kalite/miktar gDNA ve/veya RNA bir spektrofotometre veya diğer uygun teknoloji ile yüksek hassasiyet kullanarak denetimi içerir. Bir sonraki önemli adım clonotypic IGHV-IGHD-IGHJ gen düzenlenmesi amplifikasyon PCR içerir. Yukarıda belirtildiği gibi sadece IGHV lideri astar kullanın böylece belirlenecek gerçek SHM yük izin düzenlenmiş IGHV gen dizisinin tam uzunluğunu amplifikasyon sağlar; Bu nedenle, IGHV lideri astar önerilen astar (Şekil 2) bir seçimdir. Ender durumlarda, nerede IGHV lideri astar clonotypic IG düzenlenmesi yükseltmek değil IGHV FR1 astarlar kullanılır. Özellikle gDNA Başlangıç materyali olduğunda Şekil 3′ te kanıtladığı, birçok PCR ürünleri/bantları, gözlenen; Bu bantların eksize ve ayrı sıralı. IGHV lideri ve IGHV FR1 astar sonuçlar için başarısız olursa, bir yeni hasta örnek (uygun olduğunda) kullanarak analiz yinelenmelidir. Son denetim noktası sıralama önce parça Analizi (Şekil 4) kullanarak örnek clonality belirliyor. Elde edilen dizileri IMGT/V-QUEST aracı30kullanarak analiz edilmelidir. Kullanıcı tarafından seçilen parametre türleri, reseptör tip veya odağı, arama ekleme ve silme seçeneği, vb dahil ve numara sıralarının analiz ile birlikte listelenir. Her FASTA sırası görüntülenir ve V-IMGT/V-QUEST tarafından analiz alan’ın yeşil renkle vurgulanır. Ayrıca, giriş dizisi ters yönde (antisens) olsaydı, program otomatik olarak tamamlayıcı ters sırada sağlar ve bu FASTA sıra belirtiyor. Özet tablo doğrudan ‘Detaylı Görünüm’ üstündeki FASTA sıra aşağıda verilen sonuç sonuç sayfası ve IG Gen Dizi Analizi CLL klinik raporlamada önemli bilgileri içerir. Bu tablodaki her satır aşağıda açıklanmıştır. Sonuç özeti. İlk satırda sonuçları tablo giriş dizisi işlevselliğini devletler: bir yeniden düzenlenmiş IG sıra verimli veya verimsiz olabilir (Şekil 5A ve 5B). Bir IG gen düzenlenmesi verimsiz dur Eğer kodon V-D-J-bölge (VH için) veya V-J-bölgesini (VL) içinde bulunan ve/veya yeniden olup olmadığını out-of-ekleme/silme nedeniyle çerçevedir. Üçüncü bir çıkış sağlanan işlevselliği tespit edilemez zaman IGHV-IGHD-IGHJ bağlantı tanımlanamıyor; Yani, Bu durumda, sonuç Özeti ‘düzenlenmesi bulundu’ veya ‘Kavşağı bulundu’ olarak okurdu. Sadece üretken unutmamak önemlidir ve böylece, işlevsel düzenlemeler daha fazla analiz edilmelidir. Eğer tek IG düzenlenmesi güçlendirilmiş işlevsel değildir (verimsiz veya ‘düzenlenmesi bulundu’), PCR güçlendirme işleminin yinelenmelidir. Sonuç negatif devam ederse yeni bir hasta örnek alınmalıdır. V-gen ve alleli. ‘V-gen ve gen’ satır en yakın germline IGHV gen alleli ile hizalama puanı ve yüzde kimlik ile gösterir. Birkaç gene(s) ve gen aynı yüksek puanı verirsen, listelenir. SHM durumu belirler bu yana gönderilen sıralı ve en yakın IGHV gen alleli arasında yüzde kimlik belirli önem taşımaktadır. Bu değer 3′ sonuna CDR3 hariç V bölgesinin V bölgenin ilk nükleotit hesaplanır. IGHV FR1 astar kullanılması halinde, bu astar için karşılık gelen sıra her zaman doğru olarak mümkün olduğunca bir sonuç sağlamak için kaldırılmalıdır. Bu unutulmamalıdır ki düşük kimlik yüzde (< % 85) bir ekleme veya silinmesine neden (aşağıda daha fazla tartışılan) ve bu durumda olması gereken bir 'Uyarı' Not kullanıcıyı uyarmak için 'Sonuç Özeti' satırda görünecek. Ve J-gen alleli. İçin belgili tanımlık V-gen ve alleli yukarıda açıklandığı gibi ‘J-gen ve gen’ satır en yakın germline IGHJ gen ve alleli ile hizalama puanı ve yüzde kimliğini gösterir. Ancak, IGHJ gen oldukça kısadır ve sonuna 5′ eksonükleaz aktivitesi nedeniyle kesilmiş gibi alternatif seçenekler de üst üste aynı nükleotit en yüksek sayısına göre aracı tarafından aranır. D-Gen ve IMGT/JunctionAnalysis tarafından alleli. Vardı-gen ve IMGT/JunctionAnalysis tarafından alleli gösterir en yakın germline IGHD gen ve alleli aracın Kullanıcı sıra ile tanımlanan D-bölge okuma çerçevesi ile. IMGT/JunctionAnalysis31 kavşak ayrıntılı ve doğru analizini sunuyor ve IMGT/V-QUEST araç arayüzü içine entegre edilmiştir. Bu araç IGHD ve gen alleli kimlik Yani, için (ı)-bölgesi; D kısa uzunluğu bağlı zorluk tüm yönleriyle yöneten (ii) 2 hatta 3 kare okuma kullanımı; (iii) eksonükleaz kırpma genin her iki ucunda; ve (iv) mutasyonlar varlığı. FR-IMGT uzunlukları, CDR-IMGT uzunlukları ve AA kavşak. Bu satır IGHV FRs ve parantez içinde gösterilen ve noktalar ve amino asit (AA) Kavşağı tarafından ayrılmış CDRs uzunluğunu gösterir. (İ) bir içinde veya out-of-çerçeve düzenlenmesi kavşak AA dizisini göstermektedir (çerçeve pozisyonlar ‘#’ işareti ile gösterilir), (II varlığı ya da yokluğu stop kodon (bir kodonu yıldız işareti gösterilir ‘ *’) ve (iii) varlığı ya da yokluğu çapa VH CDR3-IMGT: C (2-CYS 104) ve W (J-TRP 118). Somatik hypermutations ağırlıklı olarak tek nükleotid değişiklikleri oluşur, ancak, küçük eklemeler ve silmeler V-bölgesi içinde bir çok daha düşük frekans33da olsa görülebilir. Ne zaman varsayılan IMGT/V-QUEST parametreleri, eklemeleri ve silme işlemlerini kullanarak değil otomatik olarak algılanır; Ancak, bu tür değişiklikler, Yani, düşük bir yüzde kimlik ve/veya farklı IGHV CDR1-IMGT ve CDR2-IMGT uzunlukları arasında gönderilen Kullanıcı sırası ve en yakın germline gen ve gen, bir sıra taşıyabilir güçlü işaretler tarafından algılanır Aracı ve bir uyarı görünür sonuçları Özet tabloya (Şekil 5C). IMGT ‘Göstermek-den sonuçlanmak’ bölümünün altında yer alan ‘Gelişmiş parametreleri’ bölümünde ‘Ara eklemeler ve silmeler için’ adlı bir seçenek sağlar. Nerede ilgili uyarılar görünür durumda da, bu işlevi kullanmak için tavsiye edilir. Eklemeler ve silmeler algılandığında, ekleme veya silme dahil olmak üzere (i) nerede ‘Sonuç Özet’ bölümünde yer Yani, VH FR-IMGT veya CDR-IMGT olması koşuluyla kapsamlı bulgu ayrıntılarıdır; (ii) eklenen/silinmiş nükleotit sayısı; (iii) sırasını (yalnızca eklenenleri); (iv) olup olmadığını bir frameshift oluştu; (v) V-bölge kodon hangi ekleme veya silme işlemi başlar; ve (vi) gönderilen etkilenen nükleotit bulunduğu sıralaması (Şekil 5 d). Eklemeler, araç insertion(s) gönderilen Kullanıcı sırasından kaldırır ve standart IMGT/V-QUEST parametreler kullanılarak sırası yeniden analiz eder. Silmeler algıladıysa, aracın boşluklar, analiz tekrarlanmadan önce silinen nükleotid yerine nokta ile temsil ekler. Klinik laboratuarlarda gerçekleştirilen her tanı ya da prognostik test gelince, sıkı standartlar ve tekrarlanabilirlik yüksek düzeyde son derece önemlidir. IMGT/V-QUEST çıktı hemen CLL, Yani, (i) IGHV, IGHD ve IGHJ genler ve kullanılacak allelleri IG gen dizi analizi sonuçlarını raporlama için gerekli bilgileri sağlar; (II) clonotypic IGHV-IGHD-IGHJ gen düzenlenmesi Yani, işlevselliğini yeniden üretken ya da verimsiz; olup ve (III) düzenlenmiş yüzde kimliğini IGHV gen ve gen alleli ve onun en yakın germline IGHV gen ile karşılaştırıldığında. CLL, sorunlu yorumlanması veya teknik olarak zor durumlarda ve IGHV gen SHM statüsünde CLL doğru ve sağlam bir şekilde belirlenmesi için öneriler IG genlerin klinik raporlama ile ilgili kapsamlı bilgi için okuyucu yönlendirilir Son zamanlarda için ERIC yönergeleri ve raporlar27,34güncelledi. Son olarak, CLL BcR IG stereotipi ile ilgili bizim büyüyen bilgi sayesinde atama taleplerinin kalıplaşmış Binbaşı alt kümeleri IG gen Düzenlemeler CLL içinde klinik bildirdiği için ek bir önerilen gereksinimi ile ilgilidir. Analiz üretken IGHV gen düzenlenmesi büyük kalıplaşmış alt kümeleri, yani alt kümeleri #1, #2, #4 veya #812,27birine atanmış olup olmadığını şimdi klinik rapor durumda önerilir. Atama büyük kalıplaşmış CLL alt kümeleri için tutuklama/AssignSubsets Aracı (Şekil 6)32kullanımı ile yapılmalıdır. 5′ IGHV FR1 astar Astar sıra Astar Mix 60 μL için miktar IGHV1 CAGGTGCAGCTGGTGCAGTCTGG 10 IGHV2 CAGGTCAACTTAAGGGAGTCTGG 10 IGHV3 GAGGTGCAGCTGGTGGAGTCTGG 10 IGHV4 CAGGTGCAGCTGCAGGAGTCGGG 10 IGHV5 GAGGTGCAGCTGTTGCAGTCTGC 10 IGHV6 CAGGTACAGCTGCAGCAGTCAGG 10 5′ IGHV lideri astar IGHV1L AAATCGATACCACCATGGACTGGACCTGGAGG 5 IGHV1bL AAATCGATACCACCATGGACTGGACCTGGAG(C/A) 5 IGHV2aL AAATCGATACCACCATGGACACACTTTGCT (A/C) AC 5 IGHV2bL AAATCGATACCACCATGGACATACTTTGTTCCAC 5 IGHV3aL AAATCGATACCACCACCATGGAGTTTGGGCTGAGC 5 IGHV3bL AAATCGATACCACCACCATGGA(A/G)(C/T)T(G/T)(G/T)G(G/A)CT(G/C/T) (A/C/T) GC 5 IGHV4L AAATCGATACCACCATGAAACACCTGTGGTTCTT 10 IGHV5L AAATCGATACCACCATGGGGTCAACCGCCATC 10 IGHV6L AAATCGATACCACCATGTCTGTCTCCTTCCTC 10 3′ IGHJ astar IGHJ1-2 TGAGGAGACGGTGACCAGGGTGCC 20 IGHJ3 TGAAGAGACGGTGACCATTGTCCC 10 IGHJ4-5 TGAGGAGACGGTGACCAGGGTTCC 20 IGHJ6 TGAGGAGACGGTGACCGTGGTCCC 10 Tablo 1. Astar dizileri ve clonotypic IGHV-IGHD-IGHJ gen düzenlenmesi PCR amplifikasyon için miktarları. Reaktif Birim (μL) RB x 10 arabellek 5 MgCl2 (50 mM) 3 dNTPs (10 mΜ) 2 Astar IGHV lideri/FR1 mix (10 mikron) 3 Astar IGHJ mix (10 mikron) 3 H2O 31.5 Toplam hacim 47,5 Tablo 2. Clonotypic IGHV-IGHD-IGHJ gen düzenlenmesi PCR amplifikasyon kimyasalları. Sıcaklık Süresi Döngü sayısı Açıklama 94 ° C 5 dakika 1 polimeraz etkinleştirme 94 ° C 1 dakika 39 denatürasyon 59 ° C 1 dakika tavlama 72 ° C 1.5 dakika Uzantısı 72 ° C 10 dakika 1 Son uzantısı 18 ° C ∞ 1 koruma Tablo 3. Clonotypic IGHV-IGHD-IGHJ gen düzenlenmesi PCR amplifikasyon için Termal Bisiklet koşullarını. Sıcaklık Süresi Döngü sayısı Açıklama 94 ° C 5 dakika 1 polimeraz etkinleştirme 96 ° C 20 saniye 30 denatürasyon 50 ° C 20 saniye tavlama 60 ° C 4 dakika Uzantısı 4 ° C ∞ 1 koruma Tablo 4. Termal Bisiklet koşullarını IG gen sıralama tepki için. Şekil 1. Bir IGHV-IGHD-IGHJ gen düzenlenmesi çeşitli astar belirtilen yerlerde tavlama ile şematik gösterimi. 5′ IGHV astar IGHV kodlama dizisi akıntıya karşı bulunduğu lider sıra TAV. 3′ IGHJ astar düzenlenmiş IGHJ gen sonuna kadar TAV ise düzenlenmiş IGHV gen içinde bulunduğu FR1 bölge başına 5′ IGHV framework (FR) astar tavlamak. UTR’nin: çevrilmeyen bölgesi. Bu rakam daha büyük bir versiyonunu görüntülemek için buraya tıklayınız. Şekil 2. IGHV-IGHD-IGHJ gen düzenlenmesi 5′ IGHV lideri primerler kullanılarak 7 hasta örneklerinde amplifikasyon PCR. PCR negatif kontrol dokuzuncu şeride yüklendi, ancak sekizinci lane olumlu denetim temsil eder. Beklenen PCR ürünü yaklaşık 500 baz çifti boyutunda IGHV lideri primerler kullanılarak olduğunda. Yıldız jel son sütun içinde 100 bp DNA merdiven gösterir. Bu rakam daha büyük bir versiyonunu görüntülemek için buraya tıklayınız. Şekil 3. IGHV-IGHD-IGHJ gen düzenlenmesi 13 hasta örneklerinde IGHV FR1 primerler kullanılarak amplifikasyon PCR. Negatif kontrol onbeşinci şeride yüklü iken on dördüncü lane olumlu denetimi içerir. Şeritte 2, kendisi için Başlangıç materyali, DNA’sı kanıtladığı gibi birçok PCR bantları, güvenliğe ve ayrı sıralı gözlenir. Örnekleri Lanes 5, 7 ve 13 (jel smear kanıtladığı) poliklonal sonuç vermedi ve bu nedenle PCR adım yinelenmelidir. Düzenlenmiş IG yükseltmek ikinci bir PCR başarısız olursa gene(s) Analizi (mümkünse) yeni bir örneğe bağlı olarak gerçekleştirilmesi gereken veya farklı bir astar kullanarak ayarlayın. Beklenen PCR ürünü yaklaşık 350 baz çifti boyutunda IGHV FR1 astar karışımları kullanıldığında. Yıldız jel son sütun içinde 100 bp DNA merdiven gösterir. Bu rakam daha büyük bir versiyonunu görüntülemek için buraya tıklayınız. Şekil 4. Clonality genescan analizi ile değerlendirilmesi. Poliklonal PCR ürünleri ürün boyutları (alt paneli) içinde daha fazla normal dağılım neden ise genescan analizi, floresan ürünleri aynı boyutta (üst paneli), baskın bir zirveye monoklonal PCR ürünleri neden olmaktadır. Kırmızı izleri zirveleri üzerinden aynı kapiller enjeksiyon analiz örnek olarak yüklendiği fluorescently etiketli DNA merdiven vardır. Boyutu standart parçaları aynı elektroforetik güç örnek olarak tabi ve bu nedenle aynı enjeksiyon koşullara maruz kalır. Tekdüzen aralığı boyutu standart parçalarının hassas boyut arama onaylar. Mavi izlemeler monoklonal (üst panel) temsil veya poliklonal örnekleri doğası (alt paneli). Bu rakam daha büyük bir versiyonunu görüntülemek için buraya tıklayınız. Şekil 5. IMGT/V-QUEST tarafından sağlanan sonuç Özet tablo örnekleri. (A) sonuç Özet Tablo bir üretken IGHV-IGHD-IGHJ gen düzenlenmesi (yok dur codon(s) ve bir kare dizisi junction) için. IGHV4 – 34 * 01 ve IGHJ6 V-gen alleli ve J-gen ve Kullanıcı sırayla IMGT/V-QUEST tarafından tanımlanan alleli bu durumda vardır * 02 (bazında en yüksek hizalama puanı değerlendirme). Bir tek somatik mutasyon nedeniyle .65 yüzde kimliktir. D-Gen ve IMGT/JunctionAnalysis tarafından tanımlanan alleli kare 1 okuma IGHD3 – 3 * 01 var. 4 çerçeve bölgeleri (FRs) yanı sıra 3 tamamlayıcılık belirleyici bölgeleri (CDRs) uzunlukları parantez içinde gösterilir. IGHV-D-J kavşak amino asit (AA) dizisi de sağlanır. Bu örnekte kavşak oluşan 22 AAs. (B) sonuç Özet Tablo için bir çerçeve kavşak nedeniyle verimsiz bir IGHV-IGHD-IGHJ gen düzenlenmesi sıra. CDR3-IMGT uzunluğu için bir X için bu sırası uzunluğu belirlenemedi olduğunu gösterir. AA kavşak sırayla gözlenen ‘#’ işareti bir frameshift gösterir. (C) düşük V-bölge kimliğini (.94) uyarı ve ‘Gelişmiş parametreleri’ bölümünde ‘eklemeler ve silmeler’ seçeneğini kullanılması gerektiğini gösteren sonuç Özet Tablo. (D) sonuç Özet Tablo ile (C) ‘eklemeler ve silmeler için ara’ seçeneğini kullanarak dizi analizi yinelenen sonra resimli germline düşük yüzde kimlik durum için. Doğru kimlik yüzde parantez içinde görüntülenir ve tek bir mutational olay olarak ekleme dikkate alınarak hesaplanır. Bu rakam daha büyük bir versiyonunu görüntülemek için buraya tıklayınız. Şekil 6. Tutuklama/AssignSubsets aracı tarafından oluşturulan alt atama rapor tablosu. 10 CLL hastalardan (A1-A10) FASTA IG dizileri tutuklama/AssignSubsets aracına sunuldu. Servis talebi A4 kalıplaşmış CLL alt #2 (Bu gruptaki hastalar SHM yükü ne olursa olsun kötü prognoz olduğu bilinmektedir) ile yüksek güvenilirlik atandı. Yedi diğer durumlarda/dizileri değil büyük bir sterotiplenmiş alt kümesine atanmış ve bu nedenle atanmamış olarak sınıflandırılır. İki (A7 ve A8) gönderilen sıralarının alt görev için kullanılamadı ve bunun yerine atlanır/sağlıksız sorunlar nedeniyle olarak sınıflandırılır sıralaması, Yani, bir çerçeve kavşak veya stop kodon varlığı nedeniyle ile. Tablo başlıkları ve aracın kapsamlı bir açıklama tutuklama/AssignSubsets Web sitesi32mevcuttur. Bu rakam daha büyük bir versiyonunu görüntülemek için buraya tıklayınız.

Discussion

CLL genlerinde IG çalışma değil sadece hastalık pathobiology daha iyi anlaşılmasını sağlamak için aynı zamanda hasta risk stratifikasyon geliştirmek için çok önemli olmuştur. Bu nedenle IG Gen Dizi Analizi çok adım prosedürü ve sonraki sıra veri yorumlanması standart bir şekilde gerçekleştirilir her şeyden önemlidir. Uygun ve yeterli hasta malzeme kullanılabilirliğini ve örnekleme zamanlaması test PB ve herhangi bir örnek yüksek CLL tümör hücre sayısı ile gerçekleştirilen bu yana IG gen mutational çözümlemesi yapma yeteneği üzerinde etkisi değil. Kan mononükleer hücrelere degrade ayırma yöntemleri kullanarak ayrılması düzenli olarak tanı laboratuvarlarda yapılan ve her zaman olduğu gibi kan/RPMI çözüm içeren degrade tüp eklerken özen gösterilmelidir; Bu görevi geçişin rahatsız edici önlemek ve hücrelerinin kaybı önlemek için yavaş, nazik bir şekilde yapılmalıdır.

Hücre ayrılık, nükleik asitler ayıklanır. Her iki gDNA ve cDNA clonotypic IGH düzenlenmesi SHM analizi için uygundur, ancak, avantajları ve dezavantajları her iki malzeme kullanımı için vardır. Laboratuvar iş akışı daha hızlı hiçbir ters transkripsiyon PCR güçlendirme önce yapılması gerekiyor beri gDNA kullanırken devam eder. Dedi, hangi, sırayla, ek uygulamalı laboratuar çalışmaları, Yani, arıtma veya jel kesme birden fazla PCR ürünlerinin yol açabilir hem verimli hem de verimsiz düzenlemeler amplifikasyon içinde belgili tanımlık substrate PCR neden olabileceğinden gDNA kullanarak ve bireysel tüm düzenlemeler sıralama. GDNA ve cDNA yaklaşımlar karşılaştırırken, ikincisi için bir ters transkripsiyon adım PCR güçlendirme işlemine devam etmeden önce gerçekleştirilmelidir. Ancak, çoğu durumlarda, bu durumda yalnızca üretken IG düzenlemeler olacak güçlendirilmiş ve daha sonra sıralı. Böylece, yalnızca tek bir PCR ürün saflaştırılmış ve sıralı sonuçları yorumlama daha basit olmakla birlikte.

Amplifikasyon verimliliğini büyük ölçüde hassas miktar Yöntem ve kullanılan astar kullanarak değerlendirilmesi gDNA/cDNA kalitesine bağlı. SHM düzeyi doğru belirlenmesi sadece düzenlenmiş IGHV gen tüm dizi yükseltecek tarafından elde edilebilir çünkü kullanılan astar bütün analitik prosedür için kritik öneme sahiptir. 5′ IGHV lideri astar kullanılırsa böylece Eric lideri astar27son öneriler kullanımı için haklı bir tam uzunlukta düzenlenmesi yalnızca tespit edilebilir. Eksik IGHV-IGHD-IGHJ gen Düzenlemeler, amplifikasyon lider alternatif astar kullanımı IGHV gen mutational analiz için uygun değildir ve bu nedenle karşı güçlü tavsiye edilir. Tek istisna IGHV lideri astar kullanıldığında hangi art arda olumsuz sonuçlara neden servis talepleriyle ilgili ve yeni hasta malzemenin analizidir mümkün veya Ayrıca mu sonuçlar verir. Farklı bir hasta örnek ve/veya malzeme (gDNA/cDNA) ve çeşitli astar PCR ürünü üretmek için hala başarısız ayarlarsa, tümör hücre yük çok düşük olduğunu ya da o lymphocytosis nedeniyle CLL klon değil olası nedenlerden kaynaklanabilir (Bu durumda immunophenotype yeniden değerlendirilmiş olmalıdır). Analiz için kullanılan astar her zaman klinik raporda belirtilmelidir.

CLL monoklonal B hücreleri aynı IGHV-IGHD-IGHJ gen düzenlenmesi taşıyan birikimi sonucu gibi durumlarda clonality büyük çoğunluğu için bir benzersiz monoklonal tepe, Yani, tek bir klon değerlendirme ortaya çıkaracaktır. Nadir durumlarda, iki katı düzenlemeler veya bile oligokonal desenler35gözlenen. Bu gibi durumlarda, jel elektroforez clonality değerlendirmesi için tercih edilen yöntem değildir ve parça analizi gibi daha hassas Yöntemler uygulanmalıdır. Clonality onaylandıktan sonra sıralama önce son adım dizileri yüksek kalite elde edilen emin olmak için PCR ürünü arıtma ile ilgilidir. Son olarak, IMGT/V-QUEST IG dizi analizi için ERIC tarafından önerilen kaynak araçtır. IMGT veritabanları sürekli güncelleştirilir ve sonuçları tutarlı ve iyi açıklama eklediğiniz şekilde rapor olarak, bu araç standart analiz sağlar ve farklı klinik veya akademik tesisleri arasında karşılaştırmalı analizi kolaylaştırır.

CLL analizde prognostik ve, özellikle, akıllı üzerindeki etkileri, sağlam büyük kalıplaşmış CLL alt kümeleri, atamaya dahil olmak üzere IGHV-IGHD-IGHJ gen düzenlenmesi analizini artık sadece arzu ama anahtar önemini immunogenetic. Bu roman tedavi ve tedavi kararları5,21,22,23,36,37 kılavuzunu IG gen analizi vardır potansiyel çağında özellikle belirgindir ,38CLL24üzerine uluslar arası çalıştay hazırladığı ncı sponsorluğunda kılavuzları son güncelleştirme olarak resmen belirttiği,. Özellikle clonotypic SHM durumunu belirlenmesi CLL hastalarda IGHV geni yeniden düzenlenmiş gibi dedi, titiz standartları, garanti altındadır bu önemsiz bir konu değildir ve bir çok adım süreci içerir. Önemlisi, deneysel belirli adımları, astar, ne zaman özel seçenekleri ve/veya yaklaşımlar verim üstün sonuçlar en önemlisi seçimi için yapıştırılır, başka teknik özelliği esneklik, malzeme seçimi gibi bir dereceye mükellef bulunmaktadır veya gerçeğini onlar varsa kesin sonuçları ile ilgili olarak ince farklar için kurşun nedeniyle clonality, değerlendirmek için yöntem.

Son on yıl içinde ERIC standardizasyon ve çeşitli yöntemler CLL teşhis ve prognostication ilgili yasaların uyumlaştırılması tanıtmak gayret. Bu yayımlanmış öneriler ve immunogenetic analiz27,34, çok sayıda organize eğitim atölye çalışmaları ve Etkinlikler, Ig ağ gibi bir uzman online forum kurulması için kurallar yansıtılır ele ve IG gen dizisi yorumu CLL üzerinde rehberlik sağlar. ERIC genel amacı bu eylemleri aracılığıyla en iyi klinik yönetim ve hasta bakımı teşvik etmektir. Yoğun çabalara rağmen bu görev uzak tamamlandıktan ve hatta bağışıklık profil oluşturma amaçlı roman yüksek üretilen iş sıralama geliştirilmesi sayesinde daha karmaşık hale geldi. Yine de, ancak sorunlar devam ederse, IG gen analizinin CLL sağlam standardizasyon yoğun çabaları devam ve şu anda ERIC devam eden etkinliklerine odaklanmıştır.

Disclosures

The authors have nothing to disclose.

Acknowledgements

Biz mevcut ve geçmiş bizim araştırma grupları, IgCLL grubunun üyeleri ve ERIC, onların bağlılık ve coşku CLL immunogenetics eğitim için teşekkür ederiz. Ayrıca tüm üyeleri IMGT/CLL-DB girişimi ve özellikle, Profesör Marie-Paule Lefranc ve Dr Veronique Giudicelli, Laboratoire d’Immunogenetique Moleculaire, LIGM, Universite güvenilir işbirliği kabul etmek istiyorum II. Montpellier, Montpellier, Fransa ve IMGT, uluslararası ImMunoGeneTics bilgi için sistem, onların çok büyük destek ve IG Gen Dizi Analizi ile yardım. Bu eser kısmen TRANSCAN-179 roman JTC 2016 gelen hibe tarafından desteklenen; Associazione Italiana la Ricerca sul Cancro AIRC (araştırmacı Grant #20246 ve özel programı moleküler klinik Onkoloji-5 mille #9965 başına) başına, Milano, İtalya; Progetti di Rilevante Interesse Nazionale (PRIN) #2015ZMRFEA, MIUR, Roma, İtalya; İsveçli Kanser Derneği, İsveçli Araştırma Konseyi, Knut ve Alice Wallenberg Vakfı, Karolinska Institutet, Uppsala Üniversitesi, Uppsala Üniversitesi Hastanesi ve aslan’ın Kanser Araştırma Vakfı, Uppsala; ODYSSEUS programı, “eylem için stratejik geliştirme üzerinde araştırma ve teknolojik”Rekabet, girişimcilik ve yenilik”operasyonel programı tarafından finanse edilen sektörü”, altında uygulanan (NSRF 2014-2020) ve Co Yunanistan tarafından finanse edilen ve Avrupa Birliği (Avrupa Bölgesel Kalkınma Fonu).

Materials

BD Vacutainer Plastic Blood Collection Tubes with K2EDTA: Tube Stopper ThermoFisher scientific 02-689-4 material storage
BD Vacutainer CPT Mononuclear Cell Preparation Tube – Sodium Heparin Becton Dickinson 362753 material storage
BD Vacutainer Heparin Blood Collection Tubes FAQ Daigger Scientific 366480 material storage
UltraPure 0.5 M EDTA pH 8.0 Invitrogen 15575038 cell processing
Centrifuge tubes 15 mL CS500 Corning 352096 cell processing
Centrifuge tubes PP 50 mL CS500 Corning 352070 cell processing
RPMI Medium 1640 (1X) liquid Invitrogen 21875-091 cell processing
Ficoll-Paque PLUS, 6 x 100 mL STEMCELL Technologies 17-1440-02 cell processing
Serological pipettes 5 mL Sarstedt 861,253,001 cell processing
Serological pipettes 10 mL Sarstedt 861,254,001 cell processing
Serological pipettes 25 mL Sarstedt 861,685,001 cell processing
Dulbecco's Phosphate-Buffered Saline (D-PBS) (1X) Invitrogen 14190250 cell processing
Neubauer plate Marienfeld-Superior 640010 cell processing
Tuerk solution Sigma-Aldrich 93770 cell processing
PureLink Genomic DNA Mini Kit Invitrogen K1820-01 DNA extraction
QIAamp RNA Blood Mini Kit Qiagen 52304 RNA extraction
AllPrep DNA/RNA Mini Kit Qiagen 80204 DNA/RNA extraction
5X first-strand buffer Invitrogen P/N Y02321 cDNA synthesis
Random Primers, 20 µg Promega C1181 cDNA synthesis
RNaseOUT&trade;  Recombinant Ribonuclease Inhibitor Invitrogen 10777019 cDNA synthesis
DTT Invitrogen P/N Y00147 cDNA synthesis
SuperScript II Reverse Transcriptase Invitrogen 18064-014 cDNA synthesis
10 mM dNTP Mix Invitrogen 18427013 cDNA synthesis, PCR
PCR Buffer Invitrogen O00065 PCR
MgCl2 (magnesium chloride) (25 mM) ThermoFisher scientific AB0359 PCR
Taq DNA Polymerase, recombinant Invitrogen 10342-020 PCR
Applied Biosystems 5′ Labeled Primers ThermoFisher scientific – PCR/Clonality assessment
Agilent High Sensitivity DNA Kit Agilent Technologies 5067-4626 PCR product quantification
UltraPure TBE Buffer, 10X ThermoFisher scientific 15581044 gel electrophoresis
UltraPure Ethidium Bromide, 10 mg/mL ThermoFisher scientific 15585011 gel electrophoresis
SYBR Safe DNA Gel Stain ThermoFisher scientific S33102 gel electrophoresis
10X BlueJuice Gel Loading Buffer Invitrogen 16500100 gel electrophoresis
DNA Ladder 1000 bp/1 kb ladder BLUE ready-to-use Geneon 305-105 gel electrophoresis
UltraPure Agarose ThermoFisher scientific 16500500 gel electrophoresis
Agarose low gelling temperature Sigma-Aldrich A9414-250G gel electrophoresis
Novex TBE Gels, 10%, 10 well ThermoFisher scientific EC6275BOX gel electrophoresis
ExoSAP-IT PCR Product Cleanup Reagent ThermoFisher scientific 78201.1.mL PCR product clean-up
QIAquick Gel Extraction Kit (50) Qiagen 28704 PCR product clean-up
GenomeLab DTCS Quick Start Kit Beckman Coulter 608120 Sanger sequencing
Sodium Acetate Solution (3 M), pH 5.2 ThermoFisher scientific R1181 Sanger sequencing
Glycogen, molecular biology grade ThermoFisher scientific R0561 Sanger sequencing
Ethanol absolute EMD Millipore 1024282500 Sanger sequencing
SafeSeal tube 1.5 mL Sarstedt 72,706 general use
Multiply-Pro cup 0.2 mL, PP Sarstedt 72,737,002 general use
Centrifuge equipment
PCR machine equipment
Bioanalyzer Agilent Technologies equipment
DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Swerdlow, S. H., et al. . WHO classification of tumors of haematopoietic and lymphoid tissues. 2, (2017).
  2. Baliakas, P., Mattsson, M., Stamatopoulos, K., Rosenquist, R. Prognostic indices in chronic lymphocytic leukaemia: where do we stand how do we proceed?. Journal of Internal Medicine. 279 (4), 347-357 (2016).
  3. Sutton, L. A., Rosenquist, R. The complex interplay between cell-intrinsic and cell-extrinsic factors driving the evolution of chronic lymphocytic leukemia. Seminars in Cancer Biology. , (2015).
  4. Mina, A., et al. Using prognostic models in CLL to personalize approach to clinical care: Are we there yet?. Blood Reviews. , (2017).
  5. Sutton, L. A., et al. Immunoglobulin genes in chronic lymphocytic leukemia: Key to understanding the disease and improving risk stratification. Haematologica. 102 (6), 968-971 (2017).
  6. Damle, R. N., et al. Ig V gene mutation status and CD38 expression as novel prognostic indicators in chronic lymphocytic leukemia. Blood. 94 (6), 1840-1847 (1999).
  7. Hamblin, T. J., Davis, Z., Gardiner, A., Oscier, D. G., Stevenson, F. K. Unmutated Ig V(H) genes are associated with a more aggressive form of chronic lymphocytic leukemia. Blood. 94 (6), 1848-1854 (1999).
  8. Burger, J. A., Chiorazzi, N. B cell receptor signaling in chronic lymphocytic leukemia. Trends in Immunology. 34 (12), 592-601 (2013).
  9. Packham, G., et al. The outcome of B-cell receptor signaling in chronic lymphocytic leukemia: proliferation or anergy. Haematologica. 99 (7), 1138-1148 (2014).
  10. Messmer, B. T., et al. Multiple distinct sets of stereotyped antigen receptors indicate a role for antigen in promoting chronic lymphocytic leukemia. The Journal of Experimental Medicine. 200 (4), 519-525 (2004).
  11. Stamatopoulos, K., et al. Over 20% of patients with chronic lymphocytic leukemia carry stereotyped receptors: Pathogenetic implications and clinical correlations. Blood. 109 (1), 259-270 (2007).
  12. Agathangelidis, A., et al. Stereotyped B-cell receptors in one-third of chronic lymphocytic leukemia: a molecular classification with implications for targeted therapies. Blood. 119 (19), 4467-4475 (2012).
  13. Stamatopoulos, K., Agathangelidis, A., Rosenquist, R., Ghia, P. Antigen receptor stereotypy in chronic lymphocytic leukemia. Leukemia. 31 (2), 282-291 (2017).
  14. Baliakas, P., et al. Clinical effect of stereotyped B-cell receptor immunoglobulins in chronic lymphocytic leukaemia: A retrospective multicentre study. The Lancet Haematology. 1 (2), 74-84 (2014).
  15. Gounari, M., et al. Excessive antigen reactivity may underlie, the clinical aggressiveness of chronic lymphocytic leukemia stereotyped subset #8. Blood. 125 (23), 3580-3587 (2015).
  16. Ntoufa, S., et al. B cell anergy modulated by TLR1/2 and the miR-17 approximately 92 cluster underlies the indolent clinical course of chronic lymphocytic leukemia stereotyped subset #4. Journal of Immunology. 196 (10), 4410-4417 (2016).
  17. Mansouri, L., et al. Functional loss of IkappaBepsilon leads to NF-kappaB deregulation in aggressive chronic lymphocytic leukemia. The Journal of Experimental Medicine. 212 (6), 833-843 (2015).
  18. Navrkalova, V., et al. ATM mutations in major stereotyped subsets of chronic lymphocytic leukemia: enrichment in subset #2 is associated with markedly short telomeres. Haematologica. 101 (9), e369-e373 (2016).
  19. Rossi, D., et al. Association between molecular lesions and specific B-cell receptor subsets in chronic lymphocytic leukemia. Blood. 121 (24), 4902-4905 (2013).
  20. Sutton, L. A., et al. Different spectra of recurrent gene mutations in subsets of chronic lymphocytic leukemia harboring stereotyped B-cell receptors. Haematologica. 101 (8), 959-967 (2016).
  21. Fischer, K., et al. Long-term remissions after FCR chemoimmunotherapy in previously untreated patients with CLL: Updated results of the CLL8 trial. Blood. 127 (2), 208-215 (2016).
  22. Rossi, D., et al. Molecular prediction of durable remission after first-line fludarabine-cyclophosphamide-rituximab in chronic lymphocytic leukemia. Blood. 126 (16), 1921-1924 (2015).
  23. Thompson, P. A., et al. Fludarabine, cyclophosphamide, and rituximab treatment achieves long-term disease-free survival in IGHV-mutated chronic lymphocytic leukemia. Blood. 127 (3), 303-309 (2016).
  24. Hallek, M., et al. Guidelines for diagnosis, indications for treatment, response assessment and supportive management of chronic lymphocytic leukemia. Blood. , (2018).
  25. van Dongen, J. J., et al. Design and standardization of PCR primers and protocols for detection of clonal immunoglobulin and T-cell receptor gene recombinations in suspect lymphoproliferations: report of the BIOMED-2 Concerted Action BMH4-CT98-3936. Leukemia. 17 (12), 2257-2317 (2003).
  26. Campbell, M. J., Zelenetz, A. D., Levy, S., Levy, R. Use of family specific leader region primers for PCR amplification of the human heavy chain variable region gene repertoire. Molecular Immunology. 29 (2), 193-203 (1992).
  27. Rosenquist, R., et al. Immunoglobulin gene sequence analysis in chronic lymphocytic leukemia: updated ERIC recommendations. Leukemia. 31 (7), 1477-1481 (2017).
  28. Linke, B., et al. Automated high resolution PCR fragment analysis for identification of clonally rearranged immunoglobulin heavy chain genes. Leukemia. 11 (7), 1055-1062 (1997).
  29. Gonzalez, M., et al. Heteroduplex analysis of VDJ amplified segments from rearranged IgH genes for clonality assessments in B-cell non-Hodgkin’s lymphoma. A comparison between different strategies. Haematologica. 84 (9), 779-784 (1999).
  30. Brochet, X., Lefranc, M. P., Giudicelli, V. IMGT/V-QUEST: The highly customized and integrated system for IG and TR standardized V-J and V-D-J sequence analysis. Nucleic Acids Research. 36 (Web Server issue), W503-W508 (2008).
  31. Yousfi Monod, M., Giudicelli, V., Chaume, D., Lefranc, M. P. IMGT/JunctionAnalysis: The first tool for the analysis of the immunoglobulin and T cell receptor complex V-J and V-D-J JUNCTIONs. Bioinformatics. 20, i379-i385 (2004).
  32. Bystry, V., et al. ARResT/AssignSubsets: A novel application for robust subclassification of chronic lymphocytic leukemia based on B cell receptor IG stereotypy. Bioinformatics. 31 (23), 3844-3846 (2015).
  33. Belessi, C. J., et al. IGHV gene insertions and deletions in chronic lymphocytic leukemia: "CLL-biased" deletions in a subset of cases with stereotyped receptors. European Journal of Immunology. 36 (7), 1963-1974 (2006).
  34. Langerak, A. W., et al. Immunoglobulin sequence analysis and prognostication in CLL: guidelines from the ERIC review board for reliable interpretation of problematic cases. Leukemia. 25 (6), 979-984 (2011).
  35. Heyman, B., Volkheimer, A. D., Weinberg, J. B. Double IGHV DNA gene rearrangements in CLL: Influence of mixed-mutated and -unmutated rearrangements on outcomes in CLL. Blood Cancer Journal. 6 (7), e440 (2016).
  36. Farooqui, M. Z., et al. Ibrutinib for previously untreated and relapsed or refractory chronic lymphocytic leukaemia with TP53 aberrations: A phase 2, single-arm trial. The Lancet Oncology. 16 (2), 169-176 (2015).
  37. Furman, R. R., et al. Idelalisib and rituximab in relapsed chronic lymphocytic leukemia. The New England Journal of Medicine. 370 (11), 997-1007 (2014).
  38. Burger, J. A., et al. Ibrutinib as initial therapy for patients with chronic lymphocytic leukemia. The New England Journal of Medicine. 373 (25), 2425-2437 (2015).

Tags

Immunoglobulin Gene Sequence AnalysisChronic Lymphocytic LeukemiaPrognosisPCRDensity GradientMononuclear CellsCell CountPrimer MixPCR Reagents

Play Video
PDF
DOI
DOWNLOAD MATERIALS LIST
Cite This Article
Agathangelidis, A., Sutton, L. A., Hadzidimitriou, A., Tresoldi, C., Langerak, A. W., Belessi, C., Davi, F., Rosenquist, R., Stamatopoulos, K., Ghia, P. Immunoglobulin Gene Sequence Analysis In Chronic Lymphocytic Leukemia: From Patient Material To Sequence Interpretation. J. Vis. Exp. (141), e57787, doi:10.3791/57787 (2018).
Download Citation
Reprints and Permissions

View Video

✖

To prove you're not a robot, please enter the text in the image below

CAPTCHA Image
Play CAPTCHA Audio
Refresh Image