本明細書での欧州研究イニシアチブの蓄積された経験に基づいて技術的な側面の詳細および慢性リンパ性白血病 (CLL) 患者の堅牢な IG 遺伝子のシーケンス解析を確保するための必須要件をプロトコルを提案します。CLL (エリック)。
B 細胞の成熟に伴う免疫グロブリン (IG) 遺伝子 V (D) J の組み変えの複雑なプロセスは個々 の B セル内でユニークな DNA シーケンスに上昇する体性 hypermutation (SHM) とつながれます。IG 遺伝子が個々 の患者にすべての悪性細胞に一般的なユニークな分子シグネチャを表す単一細胞のクローン性増殖から B 細胞悪性腫瘍が原因で、したがって、免疫グロブリン遺伝子の再構成は、クローンのマーカーとして使用できます。重要なクローン識別子として機能に加えて、IG 遺伝子の塩基配列は、以来、特定の発達段階に関連付けられ、B 細胞腫瘍の変換に関与するの歴史を反映するそれ故に ‘分子タイムとして機能できます。また、特定の悪性腫瘍、特に慢性リンパ性白血病 (CLL) IG 遺伝子の塩基配列を保持予後および潜在的予測機能します。つまり、免疫グロブリン遺伝子のシーケンス解析から意味のある結論を外挿することは不可能だろう強力なメソッドやツール、分析のために使用されなかった場合。この記事は、CLL (エリック)、技術的な側面の詳細と CLL、今お勧めするテストの信頼性が高く、再現性のある IG 遺伝子配列解析をするために必要不可欠な要件に関する欧州研究イニシアティブの広大な経験上に描画治療前にすべての CLL の患者。具体的には、さまざまな分析段階、clonotypic IG 遺伝子転位の同定と塩基配列の決定から IG 遺伝子シーケンス データの正確な臨床的解釈に至るまでを説明します。
慢性リンパ性白血病 (CLL)、西部国で成人の白血病の最も一般的な形式は、1成熟腫瘍性 B 細胞のクローン性増殖によって特徴付けられます。病気のコースは臨床的観点から、積極的な病が発生して、診断後非常に早期の治療を必要として多くの場合再発されたり療法に不応性患者の一部と非常に変数です。これは無痛症を提示、治療を必要とする、年齢をマッチさせた健常者2のような平均余命 (~ 30%) の患者のかなりの割合は対照的です。この臨床の多様性は、最終的に病因と病3の進行駆動 CLL 患者が見つかりました分子異常の多様性に反映されます。
CLL の診断は通常簡単に確立すること、ただし、前述臨床不均質性 CLL 患者の効果的な管理を妨げる可能性がありで助けることができると予後予測マーカーの必要性を強調治療意思決定2。数多くの研究提案4をされている新しい臨床的および生物学的マーカーの豊富さで最高潮に達する、CLL の前兆を調整しようとしています。Clonotypic 免疫グロブリン重変数 (IGHV) 遺伝子の突然変異の状態は CLL、最も堅牢な予後マーカーの 1 つ主原因という事実に (i) それは安定したまま時間が経つと疾患の進行により、(ii)、他の独立しました。臨床的および生物学的パラメーター5。にもかかわらず、IGHV 突然変異の状態を含む場合、非常に少数のマーカーは、診断の時点で臨床に現在適用されています。
1999 年、2 つの独立した研究報告なしの患者がまたは最小限の体性 hypermutation (SHM) 負荷 (一 CLL、U CLL) まで遡って CLL 日 IG 遺伝子配列の臨床的有用性の最初の報告があるを運んでいる患者よりも予後が悪い、高い SHM 負担 (変異 CLL、M CLL)6,7。具体的には、ほとんどまたはまったく SHM と clonotypic IGHV 遺伝子の場合成っていた U CLL グループおよびそれ故に最も近い生殖 IGHV 遺伝子 (≥98%)、高 % のアイデンティティ M CLL から成っていた高い突然変異荷重症例に対し (パーセントの id、最も近い生殖 IGHV 遺伝子 < 98%)。これらの初期の研究からそれが継続的には実証されて U CLL 例が短い時間に最初の治療 (TTFT) と M CLL と比較して全生存期間 (OS) を表示すること。
後知恵で、これらの種子の研究強調 B 細胞の受容器 (BcR) IG CLL の病理学のための道筋の極めて重要な役割広範な研究を順番より包括的な円高につながった CLL 内微小環境の相互作用にこの疾患8,9の生物学的多様性。最近の研究は、個々 のケースがクラスターのサブセット (準) 同一 BcR IG 遺伝子を共有しているために明らかにして CLL の免疫遺伝学的解析の重要性追加のサポートを提供している、現象と呼ぶ BcR IG 常同症10 ,11,12,13。プロパティに割り当てる同じステレオタイプ化されたサブセット港と同様 clinicobiological 明確に異なる IG 遺伝子シーケンスに対して、同じ SHM カテゴリ内他 CLL 患者からそれらを分離する患者が概念をサポートする証拠の蓄積確かに、U CLL または M CLL グループ14,15,16,に CLL 患者の一括分離を BcR IG 常同症さらに基づく CLL 患者の分類に精製報告されています17,18,19,20。
臨床的観点からは、SHM ステータス clonotypic IGHV 遺伝子の誘導に固有の応答と相関するようであることは注目に値するです。特に、M CLL 患者におけるフルダラビン/シクロホスファミド/リツキシマブ (FCR) の併用治療、 TP53遺伝子欠陥を欠けている医学的に不適当の CLL の患者のための金本位治療展示大幅に長く無増生存 (PFS) と同じ治療21,22,23を受けた U CLL 患者と比較して OS。したがって、SHM 状態の同定が重要になって特に CLL 患者などの治療管理の予測マーカーを支援ではなく、病気などの臨床経過を評価するため、予後マーカー。実際には、CLL 国際ワーク ショップから nci ガイドラインの最近の更新によると再配置の IGHV 遺伝子の SHM 状態する必要があります CLL の場合一般的な実践の両方で治療開始前に決定し、臨床試験24。また、新規処理剤及び試験で薬剤の数の増加の最近の承認により免疫グロブリン分子の SHM 状態は近い将来5CLL の患者の治療の管理にも大きな役割を果たす可能性があります。
このレポートは、IG 遺伝子のシーケンス解析、適切な材料を選択すると、シーケンスの結果の臨床的解釈で最高潮に達する開始のすべての側面を詳しく説明します。これらの手順の詳細な評価は、診断ルーチン臨床試験内正確な患者層別化を確保するため信頼性の高い結果の生産のために重要です。IG 遺伝子のシーケンス解析、結果、異なる研究室の中で比較しないように調和を支援するプロトコルが提供されます。
CLL の IG 遺伝子の研究は、だけでなく疾患病態により良い理解を提供するため、また患者のリスク層別化を改善するために重要されている.したがって、IG 遺伝子配列解析のマルチ ステップの手順とシーケンス データのそれに続く解釈が標準化された方法で実行されることが重要です。適切かつ十分な患者材料の可用性、およびサンプリングのタイミングは PB と高 CLL 腫瘍細胞数と任意のサンプル テストを実行することができますので、IG 遺伝子変異解析を実行する能力に影響する必要があります。勾配分離方法を使用して血単核細胞の分離は、診断研究所で行われる日常的に、いつものようにケアをグラデーションを含むチューブに血液/RPMI ソリューションを追加するときに取られるべきこの作業は、グラデーションを妨害を避けるために、細胞の損失を防ぐためにゆっくりと、穏やかな方法で実行する必要があります。
次の細胞分離、核酸を抽出します。両方の cDNA と gDNA SHM clonotypic IGH の転位の解析に適しています、しかし、どちらかの材料の使用の長所と短所があります。PCR の拡大の前に実行される逆のトランスクリプションを持たないので gDNA を使用するとき、研究室ワークフローは速く進みます。言われて、順番に、追加の実践的な研究作業、すなわち、浄化または複数の PCR の製品のゲル切り出しにつながることができる生産的かつ非生産的な語順換えの増幅 PCR 用基板として gDNA を使用してすべて再編成の個々 のシーケンス。CDNA と gDNA アプローチを比較すると、後者逆のトランスクリプション ステップ実行する必要が前に PCR の拡大。ただし、ほとんどの場合、このインスタンスの生産的な IG 再編成のみ増幅されその後シーケンスします。したがって、PCR の製品は 1 つだけを精製した、シーケンス、結果の解釈はより簡単ですが。
増幅の効率は、敏感な定量化と利用したプライマーを使用して査定されるべき gDNA/cDNA の質によって大きく異なります。使用されるプライマーは、SHM レベルの正確な測定は、再配置の IGHV 遺伝子の全体のシーケンスを増幅することによってのみ実現できますので全体の分析手順に重要です。フルレングスの転位は、エリックの推奨事項は、最近の使用のリーダー プライマー27を正当化するため、5′ IGHV リーダーのプライマーを使用する場合にのみ評価できます。不完全な IGHV-IGHD-IGHJ 遺伝子の語順換えの増幅につながる代替のプライマーの使用 IGHV 遺伝子変異解析には適していません、したがってに対して強く助言します。唯一の例外は IGHV リーダーのプライマーを使用する場合、繰り返し否定的な結果を生成する場合に関連し、新しい患者材料の解析がされていない可能かもしない結果が得られない。原因は腫瘍細胞量が低すぎると、リンパ球増加は、原因が CLL クローンかもしれない別患者の検体や材料 (gDNA/cDNA) および様々 なプライマーの使用は、PCR の製品を生産するはまだ失敗を設定する場合 (その場合、イムノフェノ タイプする必要があります再評価される)。分析のために使用されるプライマーは、臨床レポートで常に記載すべき。
CLL は IGHV-IGHD-IGHJ 遺伝子再構成は、同じ単クローン性 B 細胞の蓄積の結果、大多数の場合クローナリティの評価を明らかにするユニークなモノクローナル抗体ピーク、すなわち、単一のクローン。まれに、ダブル再編成またはオリゴグローナル パターンも生じることが35。このような場合は、ゲルの電気泳動は、クロナリティのため最寄りの方法とフラグメント解析などのより敏感な方法を適用する必要があります。一度クローナリティを確認すると、シーケンスの前に最後のステップ シーケンスの高品質が得られることを確保するため PCR の製品の浄化に関連します。最後に、IMGT/V-クエスト ツールはエリックが IG シーケンス解析の推奨リソースです。IMGT データベースが常に更新され、一貫したとも注釈の方法の結果を報告このツールにより、標準化された分析、臨床や学術の施設間での比較分析が容易になります。
CLL の免疫遺伝学的解析、予後と、特に予測への影響、主要な CLL に割り当てを含む IGHV-IGHD-IGHJ 遺伝子再構成のロバスト解析ステレオタイプのサブセット、はやだけ望ましいが重要な鍵です。これは特に明らか治療薬、免疫グロブリン遺伝子解析が治療決定5,21,22,23,36,37 をガイドしている潜在的なこの時代に ,38, CLL24国際ワーク ショップから nci ガイドラインの最近のアップデートで公式に示されます。厳格な基準が保証されます、特に、clonotypic の SHM 状態の定量は、CLL の患者における IGHV 遺伝子を再配置、些細な問題ではないと複数の手順が含まれます。重要なは、特定の実験の手順、特にプライマー、特定のオプションやアプローチ、優れた結果が得られますの選択が守られて、他の技術的な側面は、材料の選択などの柔軟性のある程度または、場合は、最終的な結果について、彼らは微妙な違いにつながるという事実のために、クローナリティを評価するための方法。
最後の 10 年間、エリックは、標準化と CLL の診断および前兆に関連するさまざまな方法の調和を促進するために努めて参りました。これは出版された推薦と免疫遺伝学的解析27,34, 多くの整頓されていた教育ワーク ショップやイベントに専門家のオンライン フォーラムと同様、IG ネットワークの確立のためのガイドラインに反映されます。話し合うし、CLL の IG 遺伝子シーケンスの解釈に関するガイダンスを提供します。これらのアクションによってエリックの全体的な目標は、最適な診療と患者のケアを促進するためです。強烈な努力にもかかわらずこのタスクは、程遠いですし、実は免疫プロファイリングを目指した新規高スループット シーケンスの開発により複雑になっています。それにもかかわらず、課題を永続化、CLL の IG 遺伝子解析の堅牢な標準化のための集中的な努力を続ける、エリック内で継続的な活動の焦点は、現在。
The authors have nothing to disclose.
私たちは彼らのコミットメントと CLL に免疫遺伝学の研究に熱意の研究グループ、IgCLL グループとエリックは、現在と過去のメンバーに感謝します。また全員 IMGT/CLL-DB イニシアチブと、特に、教授マリー = ポール ・ Lefranc と Dr ヴェロニク Giudicelli、d’Immunogenetique らが参加した Moleculaire、LIGM、大学の信頼のコラボレーションを認識したいと思いますモンペリエ II、モンペリエ、フランス、IMGT、国際学会情報システムは、彼らの巨大なサポートし、IG 遺伝子のシーケンス解析に役立ちます。この作品は TRANSCAN 179 小説 JTC 2016 年; からの補助金によって一部にはサポートラ Ricerca スル Cancro AIRC (捜査官グラント #20246 および特別なプログラム分子臨床腫瘍学-5 パーミル #9965) あたり Associazione イタリア、ミラノ、イタリア;における地域再生戦略・ ディ ・ Rilevante インテレッセ ナツィオナーレ通り (プリント) # 2015ZMRFEA、MIUR、ローマ, イタリア;スウェーデン癌協会、スウェーデン研究評議会、クヌートとアリス バレンベリー財団、カロリンスカ研究所、ウプサラ大学、ウプサラ大学病院とライオンのがん研究振興財団、ウプサラ;オデュッセウスのプログラム、「アクションの戦略的な開発研究と技術分野」、オペレーション プログラム「競争力、アントレプレナーシップおよびイノベーション」によって資金を供給下で実施 (NSRF 2014 年-2020 年) ギリシャの協調融資と欧州連合 (欧州地域開発基金)。
BD Vacutainer Plastic Blood Collection Tubes with K2EDTA: Tube Stopper | ThermoFisher scientific | 02-689-4 | material storage |
BD Vacutainer CPT Mononuclear Cell Preparation Tube – Sodium Heparin | Becton Dickinson | 362753 | material storage |
BD Vacutainer Heparin Blood Collection Tubes FAQ | Daigger Scientific | 366480 | material storage |
UltraPure 0.5 M EDTA pH 8.0 | Invitrogen | 15575038 | cell processing |
Centrifuge tubes 15 mL CS500 | Corning | 352096 | cell processing |
Centrifuge tubes PP 50 mL CS500 | Corning | 352070 | cell processing |
RPMI Medium 1640 (1X) liquid | Invitrogen | 21875-091 | cell processing |
Ficoll-Paque PLUS, 6 x 100 mL | STEMCELL Technologies | 17-1440-02 | cell processing |
Serological pipettes 5 mL | Sarstedt | 861,253,001 | cell processing |
Serological pipettes 10 mL | Sarstedt | 861,254,001 | cell processing |
Serological pipettes 25 mL | Sarstedt | 861,685,001 | cell processing |
Dulbecco's Phosphate-Buffered Saline (D-PBS) (1X) | Invitrogen | 14190250 | cell processing |
Neubauer plate | Marienfeld-Superior | 640010 | cell processing |
Tuerk solution | Sigma-Aldrich | 93770 | cell processing |
PureLink Genomic DNA Mini Kit | Invitrogen | K1820-01 | DNA extraction |
QIAamp RNA Blood Mini Kit | Qiagen | 52304 | RNA extraction |
AllPrep DNA/RNA Mini Kit | Qiagen | 80204 | DNA/RNA extraction |
5X first-strand buffer | Invitrogen | P/N Y02321 | cDNA synthesis |
Random Primers, 20 µg | Promega | C1181 | cDNA synthesis |
RNaseOUT™ Recombinant Ribonuclease Inhibitor | Invitrogen | 10777019 | cDNA synthesis |
DTT | Invitrogen | P/N Y00147 | cDNA synthesis |
SuperScript II Reverse Transcriptase | Invitrogen | 18064-014 | cDNA synthesis |
10 mM dNTP Mix | Invitrogen | 18427013 | cDNA synthesis, PCR |
PCR Buffer | Invitrogen | O00065 | PCR |
MgCl2 (magnesium chloride) (25 mM) | ThermoFisher scientific | AB0359 | PCR |
Taq DNA Polymerase, recombinant | Invitrogen | 10342-020 | PCR |
Applied Biosystems 5′ Labeled Primers | ThermoFisher scientific | – | PCR/Clonality assessment |
Agilent High Sensitivity DNA Kit | Agilent Technologies | 5067-4626 | PCR product quantification |
UltraPure TBE Buffer, 10X | ThermoFisher scientific | 15581044 | gel electrophoresis |
UltraPure Ethidium Bromide, 10 mg/mL | ThermoFisher scientific | 15585011 | gel electrophoresis |
SYBR Safe DNA Gel Stain | ThermoFisher scientific | S33102 | gel electrophoresis |
10X BlueJuice Gel Loading Buffer | Invitrogen | 16500100 | gel electrophoresis |
DNA Ladder 1000 bp/1 kb ladder BLUE ready-to-use | Geneon | 305-105 | gel electrophoresis |
UltraPure Agarose | ThermoFisher scientific | 16500500 | gel electrophoresis |
Agarose low gelling temperature | Sigma-Aldrich | A9414-250G | gel electrophoresis |
Novex TBE Gels, 10%, 10 well | ThermoFisher scientific | EC6275BOX | gel electrophoresis |
ExoSAP-IT PCR Product Cleanup Reagent | ThermoFisher scientific | 78201.1.mL | PCR product clean-up |
QIAquick Gel Extraction Kit (50) | Qiagen | 28704 | PCR product clean-up |
GenomeLab DTCS Quick Start Kit | Beckman Coulter | 608120 | Sanger sequencing |
Sodium Acetate Solution (3 M), pH 5.2 | ThermoFisher scientific | R1181 | Sanger sequencing |
Glycogen, molecular biology grade | ThermoFisher scientific | R0561 | Sanger sequencing |
Ethanol absolute | EMD Millipore | 1024282500 | Sanger sequencing |
SafeSeal tube 1.5 mL | Sarstedt | 72,706 | general use |
Multiply-Pro cup 0.2 mL, PP | Sarstedt | 72,737,002 | general use |
Centrifuge | equipment | ||
PCR machine | equipment | ||
Bioanalyzer | Agilent Technologies | equipment |