JoVE Journal > Cancer Research
Summary
Abstract
Introduction
Protocol
Results
Discussion
Disclosures
Acknowledgements
Materials
References
Nederlands

Automatically Generated
Please note that all translations are automatically generated. Click here for the English version.
Cancer Research

Immunoglobuline Gene sequentieanalyse In chronische lymfatische leukemie: Van patiënt materiaal reeks interpretatie

Published: November 26, 2018
doi:
10.3791/57787
, , , , , , , , ,
1Institute of Applied Biosciences,Centre for Research and Technology Hellas, 2Department of Immunology, Genetics and Pathology, Science for Life Laboratory,Uppsala University, 3Department of Molecular Medicine and Surgery,Karolinska Institutet, 4Division of Immunology, Transplantation and Infectious,IRCCS San Raffaele Scientific Institute, 5Department of Immunology, Laboratory for Medical Immunology,Erasmus University Medical Center, 6Hematology Department,Nikea General Hospital, 7Assistance publique – Hôpitaux de Paris (AP-HP), Hopital Pitié-Salpêtrière, Department of Hematology, and UPMC University Paris 06, UMRS 1138, 8Division of Experimental Oncology,IRCCS Istituto Scientifico San Raffaele and Università Vita-Salute San Raffaele

Summary

Hierin presenteren wij een protocol dat details de technische aspecten en essentiële eisen om robuuste IG gene sequentieanalyse bij patiënten met chronische lymfatische leukemie (CLL), gebaseerd op de opgedane ervaring van het initiatief van het Europeseonderzoek op CLL (ERIC).

Abstract

Tijdens de rijping van de B-cel, wordt het complexe proces van immunoglobuline (IG) gene V (D) J recombinatie somatische hypermutation (SHM) geeft aanleiding tot een uniek DNA-sequentie binnen elke afzonderlijke cel B gekoppeld. Aangezien B-cel maligniteiten uit de klonale uitbreiding van een enkele cel voortvloeien, vertegenwoordigen IG genen een unieke moleculaire handtekening gemeenschappelijk naar alle kwaadaardige cellen binnen een individuele patiënt; IG gene herschikkingen kunnen dus worden gebruikt als klonen markeringen. Naast een belangrijke klonale id bijeenkomen, kan de IG gensequentie fungeren als een ‘moleculaire Tijdslijn’ omdat het is gekoppeld aan specifieke ontwikkelingsstadia en vandaar de geschiedenis van de B-cel die betrokken zijn bij de neoplastische transformatie weerspiegelt. Bovendien, voor bepaalde maligniteiten, met name chronische lymfatische leukemie (CLL), de gensequentie IG houdt prognostische en potentieel voorspellende mogelijkheden. Dat gezegd hebbende, zinvolle conclusies van IG gene sequentieanalyse extrapoleren zou onmogelijk zijn als robuuste methoden en instrumenten waren niet beschikbaar om te helpen bij hun analyse. In dit artikel, puttend uit de ruime ervaring van het Europese onderzoeksinitiatief inzake CLL (ERIC), details van de technische aspecten en essentiële eisen noodzakelijk zijn om betrouwbare en reproduceerbare IG gene sequentieanalyse in CLL, een test die nu wordt aanbevolen voor alle CLL patiënten voorafgaand aan de behandeling. Meer in het bijzonder, zijn de verschillende analytische fasen beschreven variërend van de identificatie van de gen-omlegging van clonotypic IG en de bepaling van de nucleotide-volgorde de nauwkeurige klinische interpretatie van de IG gene sequencedata.

Introduction

Chronische lymfatische leukemie (CLL), de meest voorkomende vorm van leukemie bij volwassenen in de landen van de westelijke, wordt gekenmerkt door de klonale expansie van volwassen neoplastische B cellen1. Vanuit klinisch oogpunt is de ziekte cursus uiterst variabel met sommige patiënten ervaren een agressieve ziekte, die heel vroeg na de diagnose, behandeling en vaak relapsing of vuurvaste op therapie wordt. Dit is in schril contrast met een aanzienlijk deel van de patiënten (~ 30%) die presenteren met een vadsig ziekte, nooit behandeling vereisen, en een vergelijkbaar met gezonde individuen met leeftijd-matched2levensverwachting hebben. Deze klinische heterogeniteit wordt weerspiegeld in de diversiteit van de moleculaire afwijkingen gevonden bij patiënten met CLL die uiteindelijk de pathogenese en de voortgang van deze ziekte3 rijden.

Tot oprichting van dat een accurate diagnose van CLL is meestal eenvoudig, echter, de bovengenoemde klinische heterogeniteit belemmering kan vormen voor het doeltreffend beheer van CLL patiënten en onderstreept de noodzaak van prognostische en voorspellende markers die helpen bij het kunnen behandeling besluitvorming2. Talrijke studies hebben geprobeerd te verfijnen de prognostication of CLL, culminerend in een overvloed van nieuwe klinische en biologische markers worden voorgestelde4. Het vogelgriepvirus status van het gen clonotypic immunoglobulin zwaar variabele (IGHV) is een van de meest robuuste prognostische markers in CLL, grotendeels te wijten aan het feit dat (i) het blijft stabiel na verloop van tijd en naarmate de ziekte vordert, en (ii) het is onafhankelijk van andere klinische en biologische parameters5. Dat ondanks zeer weinig of geen markeringen, inclusief IGHV vogelgriepvirus status ervan, momenteel in klinische routine op het moment van diagnose toegepast worden.

Eerste verslagen over het klinisch nut van IG gen sequencing in CLL datum reeds in 1999, toen 2 onafhankelijke studies gerapporteerd dat patiënten met geen of een minimale somatische hypermutation (SHM) belasting (→ CLL, U-CLL) hebben een slechtere prognose dan patiënten die een hogere lasten van de SHM (gemuteerde CLL, M-CLL)6,7. Meer in het bijzonder, de U-CLL-groep bestond uit gevallen herbergen clonotypic IGHV genen met weinig of geen SHM en dus een hoog percentage identiteit aan het dichtst germline IGHV gen (≥98%), overwegende dat M-CLL bestond uit gevallen met een hogere vogelgriepvirus belasting (percentage identiek zijn aan de dichtstbijzijnde germline IGHV gene < 98%). Sinds deze vroege studies, is continu gebleken dat U-CLL gevallen een kortere tijd-aan-eerste behandeling (TTFT) en de totale overleving (OS) vergeleken met M-CLL weergeven.

Achteraf gezien bleek deze baanbrekende studies dat de sleutelrol van de B-cel receptor (BHG) IG in CLL pathobiology, dus de weg vrijmaakt voor uitgebreid onderzoek in CLL-microenvironmental interacties die op zijn beurt geleid tot een meer uitgebreide waardering van de biologische diversiteit van deze ziekte8,9. Meer recente studies hebben extra steun verleend voor het belang van immunogenetic analyses in CLL door te onthullen die individuele gevallen kunnen cluster in subsets als gevolg van (quasi) identieke BHG IG gensequenties delen, een fenomeen genoemd BHG IG stereotypy10 ,11,12,13. Vergaren van bewijs ondersteunt het idee dat patiënten die zijn toegewezen aan dezelfde stereotiepe deelverzameling haven vergelijkbaar clinicobiological eigenschappen die duidelijk te van andere CLL patiënten binnen dezelfde categorie SHM maar met verschillende IG gensequenties scheiden; het heeft inderdaad gemeld dat de categorisering van CLL patiënten op basis van het BHG IG stereotypy verder de segregatie van de bulk van CLL patiënten in U-CLL of M-CLL groepen14,15,16, verfijnt 17 , 18 , 19 , 20.

Vanuit klinisch oogpunt is het opmerkelijk dat de SHM-status van de clonotypic IGHV-gen lijkt te correleren met een specifiek antwoord op chemoimmunotherapy. In bepaalde, M-CLL patiënten behandeld met een combinatie van fludarabine/cyclofosfamide/rituximab (FCR), de gouden standaard behandeling voor medisch fit CLL patiënten ontbreekt TP53 gen gebreken, tentoongesteld aanzienlijk langer progressie-vrije voortbestaan (PFS) en OS in vergelijking met U-CLL-patiënten die de dezelfde behandeling21,22,23te ontvangen. Daarom, identificatie van de SHM status belangrijk geworden in het bijzonder voor het assisteren in het therapeutische beheer van CLL patiënten dat wil zeggen, een voorspellende marker, in plaats van voor de beoordeling van het klinische verloop van de ziekte dat wil zeggen, een prognostische marker. In feite, volgens de recente update van de NCI-gesponsorde richtsnoeren van de International Workshop on CLL moet de SHM-status van de andere volgorde IGHV genen vastberaden zijn in alle gevallen van CLL voorafgaand aan behandeling initiatie in de beide huisartspraktijk en klinische proeven24. Bovendien kan de SHM-status van de IG-molecuul ten gevolge van de recente goedkeuring van nieuwe behandeling agenten, en het groeiende aantal drugs in proeven, een nog grotere rol spelen in de therapeutische behandeling van patiënten met CLL in de nabije toekomst5.

Dit verslag beschrijft in detail alle aspecten van IG gene sequentieanalyse, begin met het kiezen van het juiste materiaal en afgesloten met de klinische interpretatie van de resultaten van het rangschikken. Grondige evaluatie van deze stappen is belangrijk bij diagnostische routine voor de productie van betrouwbare resultaten en om ervoor te zorgen nauwkeurige patiënt stratificatie binnen klinische proeven. Protocollen worden geleverd om te helpen bij de harmonisatie van de IG gene sequentieanalyse, waardoor dat resultaten vergelijkbaar onder verschillende laboratoria zijn.

Protocol

Het onderzoeksprotocol werd goedgekeurd door de ethische commissie van het San Raffaele wetenschappelijk instituut, Milan, Italië. 1. materiaalkeuze Keuze van de grondstofOpmerking: In de meeste gevallen van CLL de telling van de cel tumor is diagnose hoog (> 80-90%). Dus, het sorteren van de cel of de verrijking van de leukemische cellen is meestal niet nodig. Als perifeer bloed (PB), het meest voorkomende materiaal bij uitstek voor IG gene sequentieanalyse, gebruiken een volume bloed tussen 10-20 mL. Ook in gevallen met een lage CLL cel lasten gebruiken cel sorteren van PB monsters of materiaal van andere weefsels, zoals het beenmerg (BM) of lymfeklieren (LN). Bemonsteringstijdstip Bemonstering is niet cruciaal daar de status van de IG SHM stabiel overuren is; dat gezegd hebbende, Vermijd bemonstering in bepaalde periodes, zoals meteen na of tijdens de therapie, omdat het lage aantal CLL cellen kan de analyse bemoeilijken en tot onbetrouwbare resultaten leiden. Materiële inzameling en opslagOpmerking: Inzameling en opslag van grondstof hangt sterk af van de materiaalkeuze. Van PB of BM steekproeven, EDTA of CPT (citraat-tris-pyridossalphosphate) collectie tubes te gebruiken om te voorkomen dat de remming van de PCR versterking proces; u kunt ook gebruik heparine buizen. Collectie opties zijn voor LN monsters, ofwel cel schorsingen, biopten uit vers bevroren weefsel of, in zeldzame gevallen formaline-vaste paraffine-ingebedde (FFPE) weefsels. 2. dichtheid verlopende scheiding Opmerking: Als PB of BM de grondstof van keuze, wat de meest voorkomende scenario is is, mononucleaire cel isolatie met behulp van dichtheid verlopende scheiding wordt aanbevolen. Voeg 200 µL van EDTA (0.5 M EDTA / pH 8,0) voor een tube van 50 mL steriele collectie. Voeg 20 mL PB en 15 mL RPMI. Meng door pipetteren (2 – 3 keer is voldoende). Voeg toe 15 mL van de kleurovergang medium dichtheid aan een nieuwe collectie-tube van 50 mL.Opmerking: In het geval dat het PB-volume is minder dan 20 mL, de hoeveelheid RPMI (vorige stap) en dichtheid verloop moeten dienovereenkomstig worden gewijzigd. Langzaam laag in de oplossing van stap 2.1, zodat het het verloop niet verstoort. Centrifugeer bij 800 x g gedurende 20 minuten met de centrifuge rem af. Ringu mononucleaire cellen die heeft gevormd tussen de bovenste plasma/bloedplaatjes laag en de dichtheid kleurovergang middellange laag met behulp van een precisiepipet Pasteur steriele verzamelen en overbrengen in een steriele 15 mL collectie buis. Voeg RPMI toe aan een eindvolume van 12 mL en meng. Centrifugeer bij 750 x g gedurende 8 minuten. Verwijder het supernatant. Resuspendeer de pellet van de cel met behulp van 10 mL van RPMI en herhaalt u stap 2.5. Los de cel pellet in 1 mL PBS (DPBS, geen calcium, geen magnesium). Uitvoeren van een telling van de cel met behulp van een Neubauer-plaat door het mengen van 20 µL van monster en 80 µL van 1:10 Türk de oplossing. Als downstream processing van het monster is niet gepland voor dezelfde dag, het monster bij 750 x g gedurende 8 minuten centrifugeren. Verwijder het supernatant en opslaan van de cel pellet bij-80o C. 3. nucleïnezuur extractie Beslissen over een substraat voor analyse van de status van de SHM van IG genen. Genomic DNA (gDNA) is de meest populaire keuze als er geen noodzaak voor een omgekeerde transcriptie stap is; Als alternatief, het gebruik van RNA/complementaire DNA (cDNA) zorgt ervoor dat, ten minste op het transcriptional niveau, de productieve, functionele clonotypic IG-omlegging is de doelstelling van de “favoriet”. Gebruik een van de talrijke commercieel beschikbare kits geschikt voor gDNA of totaal RNA extractie en de synthese van cDNA (Zie Tabel van materialen). De integriteit van het DNA of RNA met behulp van gevoelige nucleïnezuur kwantificering systemen te beoordelen. Als met behulp van FFPE materiaal voor de analyse, het beoordelen van de kwaliteit en kwantiteit van de uitgepakte gDNA/cDNA door PCR versterking van een bekende huishouding gen, bijvoorbeeld retinoic acid receptor alpha (RARa), bèta-actine, enz. 4. de versterking en de Sequencing van IGHV-IGHD-IGHJ gen herschikkingen IGH PCR primer selectie Bij voorkeur, multiplex PCR met IGHV deelgroep specifieke 5′ primers en IGHJ gen specifieke 3′ inleidingen25,26uit te voeren. Als resultaten suboptimale, bereiden aparte PCR mixen met behulp van één IGHV deelgroep-specifieke primers. Gebruik 5′ inleidingen die aan hetzij de leider regio ontharden onmiddellijk stroomopwaarts van de IG-omlegging of binnen de codering regio (bijvoorbeeld kader 1, FR1) van het IGHV-gen. Gebruik leider inleidingen, waarmee voor de versterking van de gehele herschikt de gensequentie IGHV-IGHD-IGHJ, waardoor op zijn beurt de nauwkeurige schatting van SHM niveaus. Dus zijn IGHV leider inleidingen aangeraden door ERIC in hun bijgewerkte richtsnoeren voor IG gene sequentie analyse27. In gevallen waar leider inleidingen niet versterken van de IG-omlegging van clonotypic, gebruikt u IGHV FR1 inleidingen. Kader inleidingen doen echter niet de hele clonotypic IG gene omlegging, hetgeen tot onjuiste bepaling van het gehalte aan SHM leiden kan versterken. In dit scenario, duidelijk in het klinische verslag dat het gebruik van IGHV FR1 inleidingen de ware percentage identiteit aan het dichtst germline gen kan overschatten. Voor de 3′ eind, gebruik consensus inleidingen gericht op de IGHJ genen, multiplex sets van IGHJ gen-specifieke primers of isotype-specifieke primers, afhankelijk van het substraat. Primer sequenties zijn opgenomen in tabel 1, overwegende dat Figuur 1 de verschillende locaties voor primer gloeien toont. PCR versterking van IGHV-IGHD-IGHJ gen herschikkingen De mix van de primer met mengsel hoeveelheid van elke deelgroep primer(s) om onpartijdige versterking voor te bereiden. Bijvoorbeeld, als u leider inleidingen, worden twee verschillende inleidingen gebruikt om te versterken herschikkingen die behoren tot de IGHV1 subgroep. Een aantal van deze 2 inleidingen (IGHV1L en IGHV1bL) dat is dat de helft in vergelijking met IGHV4L, die de enige primer voor IGHV4 deelgroep herschikkingen is zaak dus aanhangig maken. Toepassing van de tegenovergestelde benadering in het geval van de IGHJ1-2 en IGHJ4-5 inleidingen. Aangezien deze inleidingen richten op twee verschillende IGHJ gene subgroepen, het dubbele van de hoeveelheid ten opzichte van de IGHJ3 en IGHJ6 inleidingen. Gebruik tabel 1 om te bepalen van het exacte primer hoeveelheden bij de voorbereiding van relevante primer mixen. Mix-PCR reagentia zoals vermeld in tabel 2. Na het combineren van alle de PCR reagentia in een PCR-buis, Voeg 0,5 µL van Taq polymerase en 100 ng van gDNA of 2 µL van cDNA (cDNA moet worden voorbereid met 1 microgram van RNA).Opmerking: Een enzym Taq met proeflezen van activiteit is niet essentieel omdat het foutenpercentage versterking extreem laag is en dus niet van invloed op het niveau van de SHM. De thermische PCR protocol gedetailleerd in tabel 3worden uitgevoerd. Tentiemechanismen beoordelingOpmerking: Een belangrijke volgende stap omvat het patroon van de tentiemechanismen van het PCR product evalueren. Bij de beoordeling van tentiemechanismen bij patiënten van CLL, is de meest voorkomende bevinding een enkele, monoklonaal piek/band. Methoden gebruiken met hoog-gevoeligheid, zoals fragment of heteroduplex analyse, voor tentiemechanismen beoordeling28,29. Fragment analyse Uitvoeren van multiplex PCRs met 5′-label IGHV leider of FR1 deelgroep specifieke PCR inleidingen; Dit zal het opleveren van PCR producten die kunnen worden gescheiden door capillaire elektroforese, zodoende mogelijk te maken tentiemechanismen beoordeling van het IGH PCR producten op basis van de complementariteit van hun IGHV regio bepalen lengtes van 3 (CDR3). Gebruik primers, reagentia en thermische omstandigheden identiek aan die eerder genoemde (zie tabellen 1-3). Aangepaste 5´-label inleidingen worden fluorescently oligos met een keuze van kleurstoffen op het einde 5′ aangeduid. Voorbeelden van verslaggever kleurstoffen zijn 6-FAM, HEX, NED of TET. Dus zijn 2 aparte reacties vereist op basis van het gebruik van 3 verschillende kleurstoffen per reactie. Beoordelen van de grootte van de PCR producten op een zes procent (6%) polyacrylamide-gel (dit percentage resulteert in de optimale resolutie), met behulp van 1 x TBE als een actieve buffer. Uitvoeren bij 80 V voor 45 min.Opmerking: Het wordt aanbevolen dat PCR producten zijn toegestaan om te migreren op de gel voor voldoende tijd zodat monoclonal monsters kunnen worden gescheiden van de polyklonale achtergrond en de DNA grootte markering adequaat kunt scheiden. Factoren, zoals de grootte en de dikte van de gel kunnen dus geen afzonderlijke instelling (spanning en tijd) kan garanderen een optimaal resultaat dat zei, het instellen van de spanning bij 80 V voor 45 minuten is een goed uitgangspunt als het minimaliseert het risico van het monster te migreren migratie beïnvloeden snel en ‘draaien’ off de gel. Controleer voor PCR producten van ongeveer 500 baseparen bij het gebruik van de IGHV leider inleidingen en 350 baseparen bij het gebruik van de IGHV FR1 primer mixen.Opmerking: In zeldzame gevallen, CLL gevallen bleken te voeren double, monoklonaal producten en in nog zeldzamer gevallen, gevallen een oligoclonale patroon kunnen vertonen. Een intercalating agent zoals ethidiumbromide (EtBr) of minder gevaarlijke en gevoeliger verkrijgbare DNA vlekken kan worden gebruikt voor de visualisatie van DNA op acrylamide gels met UV excitatie of blauw-licht. PCR product zuiveringOpmerking: PCR producten zijn gezuiverd om elke polyklonale achtergrond die afkomstig zijn van normale B cellen binnen het CLL monster evenals primer Dimeren die tot suboptimaal volgorde leiden kunnen te verwijderen. Elke methode die designated dNTPs en inleidingen voor PCR-opschonen, zoals een enzymatische behandeling, bijvoorbeeld Sap (garnalen alkalische fosfatase) verwijdert / Exo (Exonuclease ik), of kolom gebaseerde zuivering. Laad het totale volume van het PCR-product op een 3% laag-smelten agarose gel. Laat de PCR producten uit te voeren op de gel totdat ze van de achtergrond scheiden. De scherpe, prominente PCR bands accijnzen, zuiveren en elueer. Als twee herschikkingen worden gedetecteerd, worden beide bands moeten worden weggesneden en sequenced apart. Voor het uitvoeren van Sap/Exo-opschonen, volg de instructies van de fabrikant met betrekking tot de specifieke volumes te gebruiken; echter een typische reactie kan bevatten 1 µL Sap, 0. 5 µL Exo en 2 µL 5 x incubatie buffer per 5-10 µL PCR reactie. Meng door zachtjes vortexing elk monster en incubeer op een PCR-blok bij 37 ° C gedurende 30 minuten. Inactivering van de enzymen door verhitting tot 85 ° C gedurende 15 minuten. Het laden van een kleine hoeveelheid van de PCR producten op een 3% agarose gel te beoordelen van de zuiverheid van het product. 5. Sanger Sequencing Opmerking: Meerdere rangschikken strategieën bestaan, echter, ongeacht de exacte benadering, directe sequencing van beide strengen is verplicht om een betrouwbaar resultaat. Algemene rangschikking-protocollen Als versterking is uitgevoerd met behulp van enkele inleidingen, gaat u verder met sequencing met behulp van de juiste IGHV – en IGHJ- of constante land / regiospecifieke inleidingen. Deze benadering kan ook worden gevolgd als multiplexed fluorescently geëtiketteerde inleidingen zijn gebruikt en het PCR product werd beoordeeld met behulp van fragment analyse (sequencing inleidingen moeten niet worden aangeduid). Als multiplexed inleidingen zijn gebruikt en tentiemechanismen werd beoordeeld op een gel, vervolgens bij de eerste stap van sequencing zoals een consensus IGHJ primer een stroomafwaartse primer gebruik met de volgorde wordt 5′-GTGACCAGGGTNCCTTGGCCCCAG-3′. Anderzijds kan een CH-primer worden gebruikt als cDNA werd gebruikt als substraat. Gebruik vervolgens deelgroep-specifieke IGHV leider of FR1 inleidingen voor de tweede stap van de sequencing. In het volgende voorbeeld sequencing protocolOpmerking: Er zijn verschillende sequencing protocollen en een protocol voorbeeld hieronder is gedetailleerd. Verdun 33 ng van het PCR-product in een totaal volume van 11,5 µL gebruikt, bijvoorbeeld steriel water. Het denatureren van het PCR-product door verhitting tot 95 ° C gedurende 5 minuten. Onmiddellijk plaats op het ijs gedurende 10 minuten om te voorkomen dat de vorming van secondaire structuren. 8 µL van master mix toevoegen aan elke buis samen met 0,5 µL (overeenkomend met 5 pmol) van de primer. Als een besturingselement voorbereiden voor een buis met 8 µL van master mix, 0,5 µL pUC18 controle sjabloon, 2 µL (-) 47 sequencing primer en 9.5 µL steriel water. Het uiteindelijke totale volume in elke buis moet 20 µL. Gebruiksvoorwaarden thermische fietsen voor de reactie van sequencing zoals gedetailleerd in tabel 4. Bereid de oplossing stoppen door het mengen van 2 µL van natriumacetaat 3M (pH 5.2), 2 µL EDTA 100 Mm (pH 8.0) en 1 µL van glycogeen (concentratie 20 mg/mL), voeg vervolgens toe 5 µL aan elk monster. Het product overbrengen in een nieuwe microcentrifuge buis. Voeg 60 µL van 100% ethanol (-20 ° C) en meng voorzichtig. Centrifugeer bij 14.000 rpm gedurende 15 minuten (4 ° C). Verwijder het supernatant. Voeg 100 µL van 70% ethanol (-20 ° C) en meng voorzichtig. Centrifugeer bij 14.000 omwentelingen per minuut gedurende 10 minuten (4 ° C). Verwijder het supernatant. Eenmaal herhaald. Droog de pellet gedurende 90 minuten bij kamertemperatuur. Voeg toe 40 µL van het natrium dodecyl sulfaat (SDS) oplossing voor elk monster. Het monster overbrengen in een plaat sequencing, bedek met strip caps of tape afdichtingen, laden naar de machine en uitvoeren Sanger sequencing. De sequencing plaat is meestal een 96-well, v-bodem, full-rok PCR plate compatibel met de sequencer. De platen mogelijk barcoded al naar gelang de volgorde moet intern worden uitgevoerd, bij een commercieel bedrijf of bij een academische sequencing center/platform. Na sequencing, ‘stik’ de 2 leest gegenereerd op basis van de individuele sequencing stappen vormen een compleet IGHV gene omlegging dat wil zeggen, de volgorde van de consensus. 6. de sequentieanalyse Opmerking: De volgende secties focus op de output verkregen uit de IMGT/V-QUEST gereedschap30 bij het analyseren van herschikt IG sequenties, en IMGT/JunctionAnalysis31, die beide zijn bijzonder relevant voor klinische rapportage en onderzoek studies. IMGT/V-QUEST is een uitlijning tool die gebruiker vergelijkt afkomstig IG sequenties met de IMGT verwijzing directory ingesteld op30. De uitvoer van het hulpprogramma bevat verschillende secties waarbinnen de gebruiker bepaalde parameters kunt definiëren. Geef de soorten, bijvoorbeeld Homo sapiens (mens), en type van receptor of locus (bijvoorbeeld IGH, IGK of IGL). Plak sequenties te analyseren, in FASTA formaat en met inbegrip van de kop, in het tekstgebied (in batches van maximaal 50 reeksen per run). U kunt ook wordt een optie om de pad naar een lokaal bestand met de FASTA sequenties geleverd. Kies een van de volgende 3 weergaveopties voor de resultaten: Gedetailleerde weergave: Kies deze optie om de resultaten voor elke reeks afzonderlijk. Synthese-weergave: Kies deze optie om te compileren van een overzichtstabel besteld door de IGHV gen en -allel naam of opeenvolging input volgorde. Deze optie biedt ook een aanpassing van de sequenties die, in elk ingediende batch, worden toegewezen aan de hetzelfde IGHV gen en -allel. Excel-bestand: Kies deze optie om alle werkbladen in één bestand opgenomen uitvoerbestanden. Alle weergaveopties hebben een grote selectie van basis- en geavanceerde parameters om uit te kiezen, maar alleen de factoren die het meest relevant zijn voor CLL IG sequentieanalyse worden hieronder besproken in de sectie ‘Vertegenwoordiger resultaten’. 7. arrestatie/AssignSubsets Tool Indienen om te onderzoeken BHG IG stereotypy binnen CLL (aanvullende details hieronder in het gedeelte ‘Vertegenwoordiger resultaten’), IGHV-IGHD-IGHJ FASTA sequenties aan de arrestatie/AssignSubsets tool32. De tool meldt dat de toewijzing aan grote CLL gestereotypeerd deelverzamelingen. Het hulpprogramma deelverzameling-toewijzing met gedetailleerde instructies zijn beschikbaar op de website van arrestatie/AssignSubset32 , en ook op de website van ERIC onder het tabblad services.

Representative Results

Hieronder vindt u voorbeelden van resultaten van IG gen sequencing analyse volgende de stappen hierboven is uiteengezet. Hoewel DNA en/of RNA extractie routine procedures voor de meeste klinisch/onderzoekslaboratoria, omvat een eerste cruciale stap controleren de kwaliteit/kwantiteit van gDNA en/of RNA met een spectrofotometer of andere geschikte technologie met hoge gevoeligheid. De volgende cruciale stap impliceert PCR versterking van de clonotypic IGHV-IGHD-IGHJ gen omlegging. Zoals hierboven vermeld, kan alleen het gebruik van IGHV leider inleidingen versterking van de volledige lengte van de andere volgorde IGHV gensequentie, dus mooi de ware SHM belasting vast te stellen; IGHV leider inleidingen zijn dus de aanbevolen primer keuze (Figuur 2). In zeldzame gevallen waar IGHV leider inleidingen kunnen niet het versterken van de IG-omlegging van clonotypic, mag IGHV FR1 inleidingen worden gebruikt. Zoals blijkt uit Figuur 3, verschillende PCR producten/bands kunnen in acht worden genomen, vooral wanneer de gDNA is de grondstof; deze bands moeten worden weggesneden en sequenced apart. Als zowel de leider van de IGHV als IGHV FR1 inleidingen mislukken resultaten oplevert, moet de analyse worden herhaald met gebruikmaking van een nieuwe patiënt monster (indien mogelijk). De laatste checkpoint voorafgaand aan het rangschikken is het bepalen van de tentiemechanismen van het monster met behulp van fragment analyse (Figuur 4). Sequenties verkregen moeten worden geanalyseerd met behulp van de IMGT/V-QUEST gereedschap30. Gebruiker geselecteerde parameters omvatten soorten receptor Typ of locus, zoeken naar inbrengen, en verwijdering optie, etc. en staan samen met het aantal sequenties geanalyseerd. Elke FASTA sequentie wordt weergegeven en het V-domein geanalyseerd door IMGT/V-QUEST is gemarkeerd in het groen. Bovendien als de input sequence was in de tegenovergestelde richting (antisense), het programma automatisch de complementaire omgekeerde volgorde en dit boven de FASTA volgorde. Het resultaat overzichtstabel u direct onder de FASTA volgorde, op de top van de ‘gedetailleerde weergave vindt’ resultaten pagina, en bevat informatie die belangrijk zijn voor de klinische rapportage van IG gene sequentieanalyse in CLL. Elke rij van deze tabel wordt hieronder uitgelegd. Resultaat samenvatting. De eerste rij in de tabel van de resultaten staat de functionaliteit voor de input sequence: een opeenvolging van IG herschikt kunnen productief of onproductieve (figuur 5A & 5B). Een IG gen-omlegging is onproductieve als stop codonen binnen de V-D-J-regio (VH) of binnen de V-J-regio (VL) en/of als de omlegging is out-voor-frame als gevolg van de ingevoegde/verwijderde. Een derde uitgang is geboden als de functionaliteit niet kan worden vastgesteld, dat wil zeggen, als het kruispunt IGHV-IGHD-IGHJ niet kon worden geïdentificeerd; in dit geval, zou het resultaat samenvatting gelezen als ‘Geen omlegging gevonden’ of ‘Geen knooppunt gevonden’. Het is belangrijk op te merken dat slechts productieve en, dus, functionele herschikkingen verder moeten worden geanalyseerd. Als de zool IG-omlegging versterkt is niet functioneel (onproductieve of ‘geen omlegging gevonden’), de PCR versterking proces moet worden herhaald. Als het resultaat negatief blijft moet een nieuwe patiënt monster worden verkregen. V-gen en allel. De ‘V-gen en allel’ rij geeft de dichtstbijzijnde germline IGHV gen en het allel met de score van de uitlijning en het percentage identiteit. Als verschillende gene(s) en allelen de dezelfde hoge score geven, die alle worden weergegeven. Het percentage identiteit tussen de ingediende reeks en de dichtstbijzijnde IGHV gene allel is van bijzonder belang, aangezien het de SHM status bepaalt. Deze waarde is berekend op basis van de eerste nucleotide van de V-regio aan het einde 3′ van de V-regio met uitzondering van de CDR3. Als IGHV FR1 inleidingen worden gebruikt, moet de volgorde die overeenkomt met die van de primer altijd worden verwijderd om ervoor te zorgen als nauwkeurig een resultaat mogelijk. Opgemerkt moet worden dat een lage identiteit percentage (< 85%) kunnen voortvloeien uit een invoeging of schrapping (zie verder hieronder) en, indien dat het geval een "Waarschuwing" notitie verschijnt in de rij 'Resultaat Samenvatting' om de gebruiker te waarschuwen. J-gen en allel. Zoals beschreven voor het V-gen en de allel hierboven, geeft het ‘J-gen en allel’ rij de dichtstbijzijnde germline IGHJ gen en -allel met de score van de uitlijning en het percentage identiteit. Echter, zoals het IGHJ-gen vrij kort is en zijn 5′-eind kan hebben ingekort vanwege exonucleaseactiviteit, alternatieve keuzes worden eveneens doorzocht door de tool, gebaseerd op het hoogste aantal opeenvolgende identiek nucleotiden. D-gen en allel door IMGT/JunctionAnalysis. De had-gen en de allel door IMGT/JunctionAnalysis geeft aan de dichtstbijzijnde germline IGHD gen en -allel met de D-regio leesraam geïdentificeerd door het onderdeel in de volgorde van de gebruiker. IMGT/JunctionAnalysis31 biedt een gedetailleerde en nauwkeurige analyse van de kruising en is geïntegreerd in de IMGT/V-QUEST hulpmiddel interface. Dit hulpprogramma beheert alle aspecten van de problemen gekoppeld aan IGHD gen en -allel identificatie d.w.z., (i) de korte lengte van de D-regio; (ii) gebruik van 2 of zelfs 3 lezen frames; (iii) exonuclease trimmen aan beide uiteinden van het gen; en (iv) de aanwezigheid van mutaties. FR-IMGT lengtes, CDR-IMGT lengtes en AA JUNCTION. Deze rij bevat de lengte van de IGHV FRs en CdR haakjes weergegeven en gescheiden door puntjes en de kruising aminozuur (AA). De AA-volgorde van het knooppunt illustreert de omlegging van (i) een in – of uit-van-frame (out-voor-frame posities worden aangeduid met het teken ‘#’), (ii) de aanwezigheid of afwezigheid van stop codonen (een stop codon wordt weergegeven met een sterretje ‘ *’), en (iii) de aanwezigheid of de afwezigheid van de ankers van de VH CDR3-IMGT: C (2e-CYS 104) en W (J-TRP 118). Somatische hypermutations bestaan voornamelijk uit één nucleotide wijzigingen, echter kleine invoegingen en verwijderingen in de V-regio kunnen worden waargenomen, zij het op een veel lagere frequentie33. Wanneer met behulp van de IMGT/V-QUEST standaardparameters, invoegingen en verwijderingen worden niet automatisch gedetecteerd; echter sterke aanwijzingen dat een reeks dergelijke veranderingen, dat wil zeggen, een laag percentage identiteit en/of verschillende IGHV CDR1-IMGT en CDR2-IMGT lengtes tussen de volgorde ingediend gebruiker dichtst germline gen en de allel, mag worden gedetecteerd door de gereedschap en een waarschuwing van de waarschuwing verschijnt onder de samenvattende tabel van de resultaten (figuur 5C). IMGT biedt een optie genaamd ‘Zoeken naar ingevoegde en verwijderde items’ in de sectie ‘Geavanceerde parameters’ is gelegen onder de sectie ‘Display resultaten’. In gevallen waar relevante waarschuwingen worden weergegeven, is het raadzaam om deze functionaliteit te gebruiken. Wanneer ingevoegde en verwijderde items worden gedetecteerd, uitgebreide details van de bevinding worden verstrekt in de sectie van de ‘Resultaat Samenvatting’ met inbegrip van (i) waar de invoeging of schrapping gelegen dat wil zeggen, VH FR-IMGT of CDR-IMGT is; (ii) het aantal geïntroduceerd/geëlimineerd nucleotiden; (iii) de volgorde (enkel voor ingevoegde); (iv) of een frameshift heeft plaatsgevonden; (v) de V-regio codon waaruit de invoeging of schrapping begint; en (vi) de positie waarin dit probleem optreedt nucleotide in de ingediende volgorde (figuur 5D). Voor invoegingen, het hulpprogramma verwijdert het insertion(s) uit de ingezonden gebruiker volgorde en vervolgens opnieuw analyseert de volgorde met behulp van de standaard IMGT/V-QUEST-parameters. Als verwijderingen worden gedetecteerd, voegt het hulpprogramma hiaten, vertegenwoordigd door stippen, ter vervanging van de verwijderde nucleotiden voordat de analyse herhaald. Wat elke diagnostische of voorspellende test uitgevoerd in klinische laboratoria, zijn strenge normen en een hoog beschermingsniveau van de reproduceerbaarheid van het allergrootste belang. De IMGT/V-QUEST-output verschaft veel van de informatie die nodig is voor de rapportage van de resultaten van IG gene sequentieanalyse in CLL, dat wil zeggen, (i) de IGHV, IGHD en IGHJ genen en allelen worden benut; (ii) de functionaliteit van de clonotypic IGHV-IGHD-IGHJ gen omlegging dat wil zeggen, of de omlegging is productief of onproductieve; en (iii) het percentage identiteit van de andere volgorde IGHV gen en -allel in vergelijking met zijn naaste germline IGHV gen en -allel. Voor meer uitgebreide informatie met betrekking tot de klinische rapportage van IG genen in CLL, de interpretatie van problematisch of technisch uitdagende gevallen en aanbevelingen voor de vaststelling van het nauwkeurig en robuust voor IGHV gen SHM status in CLL, is de lezer gericht om onlangs bijgewerkte ERIC richtsnoeren en rapporten27,34. Tot slot, als gevolg van onze groeiende kennis over BHG IG stereotypy in CLL, een extra aanbevolen vereiste voor de klinische rapportage van IG gene herschikkingen in CLL heeft betrekking op de toewijzing van zaken aan grote gestereotypeerd deelverzamelingen. Het is nu aanbevolen om staat in het klinische verslag of de geanalyseerde productieve IGHV gene omlegging kan worden toegewezen aan een van de grote stereotiepe subsets, namelijk deelverzamelingen #1, #4 en #2 en #812,27. Toewijzing aan grote CLL gestereotypeerd deelverzamelingen moet worden verricht met het gebruik van de arrestatie/AssignSubsets tool (Figuur 6)32. 5′ IGHV FR1 inleidingen Primer volgorde Hoeveelheid voor 60 μL primer mix IGHV1 CAGGTGCAGCTGGTGCAGTCTGG 10 IGHV2 CAGGTCAACTTAAGGGAGTCTGG 10 IGHV3 GAGGTGCAGCTGGTGGAGTCTGG 10 IGHV4 CAGGTGCAGCTGCAGGAGTCGGG 10 IGHV5 GAGGTGCAGCTGTTGCAGTCTGC 10 IGHV6 CAGGTACAGCTGCAGCAGTCAGG 10 5′ IGHV leider inleidingen IGHV1L AAATCGATACCACCATGGACTGGACCTGGAGG 5 IGHV1bL AAATCGATACCACCATGGACTGGACCTGGAG(C/A) 5 IGHV2aL AC AAATCGATACCACCATGGACACACTTTGCT (AIRCO) 5 IGHV2bL AAATCGATACCACCATGGACATACTTTGTTCCAC 5 IGHV3aL AAATCGATACCACCACCATGGAGTTTGGGCTGAGC 5 IGHV3bL AAATCGATACCACCACCATGGA(A/G)(C/T)T(G/T)(G/T)G(G/A)CT(G/C/T) (A/C/T) GC 5 IGHV4L AAATCGATACCACCATGAAACACCTGTGGTTCTT 10 IGHV5L AAATCGATACCACCATGGGGTCAACCGCCATC 10 IGHV6L AAATCGATACCACCATGTCTGTCTCCTTCCTC 10 3′ IGHJ primers IGHJ1-2 TGAGGAGACGGTGACCAGGGTGCC 20 IGHJ3 TGAAGAGACGGTGACCATTGTCCC 10 IGHJ4-5 TGAGGAGACGGTGACCAGGGTTCC 20 IGHJ6 TGAGGAGACGGTGACCGTGGTCCC 10 Tabel 1. Primer sequenties en hoeveelheden voor de PCR versterking van de clonotypic IGHV-IGHD-IGHJ gen omlegging. Reagens Volume (l) RB x 10 buffer 5 MgCl2 (50 mM) 3 dNTPs (10 mΜ) 2 Primer IGHV leider/FR1 mix (10 μM) 3 Primer IGHJ mix (10 μM) 3 H2O 31,5 Totaal volume 47,5 Tabel 2. Reagentia voor de PCR versterking van de clonotypic IGHV-IGHD-IGHJ gen omlegging. Temperatuur Duur Cyclus nummer Beschrijving 94 ° C 5 minuten 1 activering van de polymerase 94 ° C 1 minuut 39 denaturatie 59 ° C 1 minuut gloeien 72 ° C 1,5 minuut uitbreiding 72 ° C 10 minuten 1 laatste uitbreiding 18 ° C ∞ 1 behoud Tabel 3. Thermische fietsen voorwaarden voor de PCR versterking van de clonotypic IGHV-IGHD-IGHJ gen omlegging. Temperatuur Duur Cyclus nummer Beschrijving 94 ° C 5 minuten 1 activering van de polymerase 96 ° C 20 seconden 30 denaturatie 50 ° C 20 seconden gloeien 60 ° C 4 minuten uitbreiding 4 ° C ∞ 1 behoud Tabel 4. Thermische fietsen voorwaarden voor de IG gen sequencing reactie. Figuur 1. Schematische weergave van een gen-omlegging van IGHV-IGHD-IGHJ met verschillende primer gloeien locaties aangegeven. 5′ IGHV inleidingen ontharden aan de volgorde van de leider die ligt stroomopwaarts van de codering reeks van IGHV. De ontharden van de 5′ IGHV kader (FR) de inleidingen aan het begin van de FR1 regio, die zich bevindt binnen het herschikt IGHV gen, terwijl de 3′ IGHJ inleidingen aan het einde van het gen IGHJ herschikt ontharden. UTR: niet-vertaalde regio. Klik hier voor een grotere versie van dit cijfer. Figuur 2. PCR versterking van de IGHV-IGHD-IGHJ-gen omlegging in 7 patiënten monsters met behulp van 5′ IGHV leider inleidingen. De achtste lane vertegenwoordigt een positieve controle terwijl de negatieve controle voor de PCR is geladen in de negende rijstrook. Het verwachte PCR product is ongeveer 500 basenparen in grootte bij het gebruik van de IGHV leider inleidingen. Het sterretje in de laatste kolom van de gel geeft aan de 100 bp DNA-ladder. Klik hier voor een grotere versie van dit cijfer. Figuur 3. PCR versterking van de IGHV-IGHD-IGHJ-gen omlegging in 13 patiënten monsters met behulp van IGHV FR1 inleidingen. De veertiende lane bevat de positieve controle terwijl de negatieve controle was in de vijftiende lane geladen. Zoals blijkt uit lane 2, waarvoor DNA de grondstof was, worden verschillende PCR bands waargenomen, die moet worden weggesneden en sequenced apart. Monsters in rijstroken 5, 7 en 13 polyklonale resultaten (blijkt uit de uitstrijkjes in de gel) opgeleverd en dus de PCR-stap moet worden herhaald. Indien een tweede PCR niet versterken de herschikt IG gene(s) de analyse moet worden verricht op een nieuw monster (indien mogelijk) of met behulp van een verschillende primer. Het verwachte PCR product is ongeveer 350 basenparen in grootte bij het gebruik van IGHV FR1 primer mixen. Het sterretje in de laatste kolom van de gel geeft aan de 100 bp DNA-ladder. Klik hier voor een grotere versie van dit cijfer. Figuur 4. Beoordeling van tentiemechanismen met behulp van de genescan analyse. In genescan analyse geven monoclonal PCR producten aanleiding tot een dominante piek van fluorescerende producten van dezelfde grootte (bovenste deelvenster) Overwegende dat polyklonale PCR producten in een meer normale verdeling van product maten (lagere paneel resulteren). De rode sporen zijn pieken van een fluorescently-geëtiketteerden DNA-ladder die wordt geladen in de dezelfde capillaire injectie als de steekproef wordt geanalyseerd. De standaard grootte-fragmenten zijn onderworpen aan dezelfde elektroforetische kracht als het monster en daarom worden blootgesteld aan dezelfde voorwaarden injectie. De uniforme afstand van de grootte standaard fragmenten bevestigt precieze grootte roeping. De blauwe sporen vertegenwoordigen het monoklonaal (bovenste netdeel) of polyclonal (onderste paneel) aard van de monsters. Klik hier voor een grotere versie van dit cijfer. Figuur 5. Voorbeelden van het resultaat van een samenvattende tabellen geboden door IMGT/V-QUEST. (A) resultaat overzichtstabel voor een productieve IGHV-IGHD-IGHJ-gen-omlegging van (geen stop-codon(s) en een in-framereeks junction). Het V-gen en allel en de J-gen en geïdentificeerd in de volgorde van de gebruiker door IMGT/V-QUEST-allel in dit geval zijn IGHV4 – 34 * 01 en IGHJ6 * 02 (op basis van de hoogste evaluatie voor de score van de uitlijning). De percentage identiteit is 99.65% als gevolg van een enkele somatische mutatie. Het D-gen en de allel geïdentificeerd door IMGT/JunctionAnalysis is de IGHD3 – 3 * 01 in frame 1 lezen. De lengte van de 4 kader regio’s (FRs), alsmede de 3 complementariteit bepalende regio’s (CDR) worden aangegeven in vierkante haken. De volgorde van de aminozuur (AA) van het kruispunt IGHV-D-J is ook beschikbaar. In dit voorbeeld de kruising bestond uit 22 AAs. (B) resultaat overzichtstabel voor een IGHV-IGHD-IGHJ-omlegging gensequentie thats onproductieve als gevolg van een uit-van-frame-knooppunt. Een kruisje voor de lengte van de CDR3-IMGT geeft aan dat voor deze reeks de lengte niet kon worden vastgesteld. De tekenen van de ‘#’ waargenomen in de volgorde van de kruising AA geven een frameshift. (C) resultaat overzichtstabel waarschuwing voor lage V-regio identiteit (60.94%) en die aangeeft dat de ‘invoegingen en verwijderingen’ optie in de sectie ‘Geavanceerde parameters’ moet worden gebruikt. (D) resultaat de tabel Samenvatting voor het geval met lage percentage identiteit germline geïllustreerd in (C) na het herhalen van de sequentieanalyse met behulp van de optie ‘Zoeken naar ingevoegde en verwijderde items’. Het percentage van de juiste identiteit wordt weergegeven tussen vierkante haken en wordt berekend overweegt de invoeging als een enkele vogelgriepvirus gebeurtenis. Klik hier voor een grotere versie van dit cijfer. Figuur 6. Subset toewijzing verslag tabel gegenereerd door het hulpprogramma arrestatie/AssignSubsets. De FASTA IG-sequenties van 10 CLL patiënten (A1-A10) werden ingediend bij de arrestatie/AssignSubsets-tool. Geval A4 werd toegewezen aan CLL gestereotypeerd deelverzameling #2 (patiënten binnen deze groep is bekend dat er van een slechte prognose ongeacht SHM belasting) met hoge vertrouwen. Zeven van de andere gevallen/sequenties werden niet toegewezen aan een grote subset van stereotiepe en vandaar aangemerkt als niet-toegewezen. Twee van de ingediende sequenties (A7 en A8) kan niet worden gebruikt voor toewijzing van de deelverzameling en in plaats daarvan werden geclassificeerd als overgeslagen/ongezonde te wijten aan problemen met de volgorde, dat wil zeggen, als gevolg van een knooppunt uit-van-frame of de aanwezigheid van stop codonen. Een uitgebreide uitleg van de tabelkoppen en de tool is beschikbaar op de website van arrestatie/AssignSubsets32. Klik hier voor een grotere versie van dit cijfer.

Discussion

De studie van IG genen in CLL is essentieel, niet alleen voor het verstrekken van een beter inzicht in de ziekte pathobiology, maar ook voor de verbetering van de patiënt Risicostratificatie geweest. Daarom is het essentieel dat de scriptingregel procedure van IG gene sequentieanalyse en latere interpretatie van de reeks gegevens op een gestandaardiseerde wijze wordt uitgevoerd. De beschikbaarheid van geschikte en toereikende patiënt materiaal en de timing van de bemonstering moeten geen invloed hebben op de mogelijkheid om de IG gene vogelgriepvirus analyses uit te voeren, aangezien de test kan worden uitgevoerd op PB en op een monster met een hoge CLL tumor cel tellen. De scheiding van bloed mononucleaire cellen met behulp van de helling scheidingsmethoden routinematig wordt uitgevoerd in de diagnostische laboratoria, en zoals altijd, zorg moet worden genomen wanneer de bloed/RPMI-oplossing toe te voegen aan de buis met het verloop; deze taak moet worden uitgevoerd in een langzame, zachte manier dat niet wordt verstoord het verloop te voorkomen dat het verlies van cellen.

Na scheiding van de cel, nucleic zuren worden geëxtraheerd. Zowel gDNA en cDNA zijn geschikt voor SHM analyse van de IGH-omlegging van clonotypic, echter, er zijn voor- en nadelen voor het gebruik van een materiaal. De laboratorium-werkstroom verloopt sneller bij het gebruik van gDNA, aangezien geen omgekeerde transcriptie moet worden uitgevoerd vóór PCR versterking. Dat gezegd hebbende, gebruik van gDNA als het substraat voor PCR kan resulteren in de versterking van zowel productieve en onproductieve herschikkingen die op zijn beurt tot extra hands-on laboratoriumwerk, dat wil zeggen, zuivering of gel excisie van meerdere PCR producten leiden kan en individuele sequentiebepaling van alle herschikkingen. Bij het vergelijken van de gDNA en cDNA benaderingen, voor de laatste een omgekeerde transcriptie stap moet worden uitgevoerd voordat u verdergaat met PCR versterking. Echter, in dit geval voor de meeste gevallen, alleen productieve IG herschikkingen zal worden versterkt en vervolgens sequenced. Zo, zal slechts één PCR product worden gezuiverd en sequenced, terwijl de interpretatie van de resultaten eenvoudiger is.

De efficiëntie van versterking hangt grotendeels af van de kwaliteit van de gDNA/cDNA, die moet worden beoordeeld met behulp van een methode van gevoelige kwantificering en de inleidingen gebruikt. De inleidingen gebruikt zijn cruciaal voor het volledige analyseproces, omdat de nauwkeurige bepaling van het niveau van de SHM kan alleen worden bereikt door het versterken van de volledige sequentie van de herschikt IGHV gen. Een full-length omlegging kan slechts worden beoordeeld als 5′ IGHV leider inleidingen worden gebruikt, waardoor de recente aanbevelingen door ERIC voor het gebruik van leider inleidingen27te rechtvaardigen. Het gebruik van alternatieve primers, wat leidt tot de versterking van onvolledige IGHV-IGHD-IGHJ gen herschikkingen, is niet geschikt voor IGHV gen vogelgriepvirus analyse, en vandaar sterk ontraden. De enige uitzondering betreft gevallen die herhaaldelijk negatieve resultaten opleveren wanneer IGHV leider inleidingen worden gebruikt en analyse van nieuwe patiënt materiaal is niet mogelijk of ook doet geen resultaten opleveren. Als gebruik van een andere patiënt monster en/of materiaal (gDNA/cDNA) en verschillende grondlagen wordt nog steeds niet in slagen om het produceren van een PCR product ingesteld, mogelijke redenen zou kunnen zijn dat de lasten van de cel tumor te laag is of die lymphocytosis niet als gevolg van een kloon van CLL (in welk geval de immunophenotype moeten opnieuw worden geëvalueerd). Inleidingen gebruikt bij de analyse moeten altijd worden vermeld in het klinische verslag.

CLL voortvloeit uit de accumulatie van monoclonal B-cellen, rekening houdend met de dezelfde gen-omlegging van IGHV-IGHD-IGHJ, voor de overgrote meerderheid van gevallen tentiemechanismen zal beoordeling onthullen een unieke monoclonal piek, dat wil zeggen, een één kloon. Bij zeldzame gelegenheden, kunnen dubbele herschikkingen of zelfs oligoclonale patronen worden waargenomen35. In dergelijke gevallen de gelelektroforese van het is niet de aangewezen techniek voor tentiemechanismen beoordeling en gevoeliger methoden zoals fragment analyse moeten worden toegepast. Zodra tentiemechanismen is bevestigd, de laatste stap vóór sequencing heeft betrekking op de zuivering van het PCR-product om ervoor te zorgen dat sequenties van hoge kwaliteit worden verkregen. Tot slot is de IMGT/V-QUEST-tool de resource aanbevolen voor IG sequentieanalyse door ERIC. Als de IMGT databases voortdurend bijgewerkt worden en verslag van de resultaten in een consistent en goed beschreven wijze, dit hulpprogramma zorgt voor een gestandaardiseerde analyse en vergemakkelijkt de vergelijkende analyse tussen verschillende klinische of academische faciliteiten.

Zo immunogenetic analyse in CLL heeft prognostic en, in het bijzonder, voorspellende implicaties, robuuste analyse van de gen-omlegging van IGHV-IGHD-IGHJ met inbegrip van de toewijzing aan grote CLL gestereotypeerd deelverzamelingen, is niet langer alleen wenselijk maar van essentieel belang. Dit is vooral duidelijk in dit tijdperk van de therapeutiek van de roman en het potentieel dat IG gene analyse moet begeleiden behandeling besluiten5,21,22,23,36,37 ,38, als officieel aangegeven door de recente update van de NCI-gesponsorde richtsnoeren van de International Workshop on CLL24. Dat zei, strenge normen zijn gerechtvaardigd, temeer daar de bepaling van de SHM-status van de clonotypic herschikt IGHV gen in CLL patiënten is niet een triviale zaak en omvat een proces van meerdere stappen. Nog belangrijker is, bepaalde experimentele stappen, met name de keuze van de primers, opbrengst superieure resultaten wanneer specifieke opties en/of benaderingen in acht worden genomen, andere technische aspecten zijn vatbaar voor een zekere mate van flexibiliteit, zoals materiaalkeuze of de methode voor de beoordeling van tentiemechanismen, wijten aan het feit dat ze leiden tot subtiele verschillen, in voorkomend geval, ten aanzien van de eindresultaten.

Het laatste decennium, heeft ERIC ter bevordering van de normalisatie en harmonisatie van de verschillende methoden die relevant zijn voor CLL diagnostiek en prognostication gestreefd. Dit wordt weerspiegeld in de gepubliceerde aanbevelingen en richtsnoeren voor immunogenetic analyse27,34, talrijke georganiseerde educatieve workshops en evenementen, de oprichting van een netwerk van IG, evenals een online forum van deskundigen te bespreken en bieden begeleiding over IG gene reeks interpretatie in CLL. Het algemene doel van ERIC door middel van deze acties is het bevorderen van optimale klinische behandeling en zorg voor patiënten. Ondanks intensieve inspanningen, deze taak is verre van compleet, en in feite heeft complexer als gevolg van de ontwikkeling van nieuwe high-throughput sequencing gericht immuun profilering. Niettemin, hoewel er uitdagingen bestaan, intensieve inspanningen voor de robuuste normalisatie van IG gene analyse in CLL blijven en zijn momenteel de focus van lopende activiteiten binnen ERIC.

Disclosures

The authors have nothing to disclose.

Acknowledgements

Wij danken de huidige en vroegere leden van onze onderzoeksgroepen, de IgCLL groep en ERIC, voor hun inzet en enthousiasme bij het bestuderen van Immunogenetica in CLL. Wij willen ook de vertrouwensvolle samenwerking van alle leden van het IMGT/CLL-DB-initiatief en in het bijzonder, Professor Marie-Paule Lefranc en Dr. Veronique Giudicelli, Laboratoire d’Immunogenetique Molecular, LIGM, FR Universite erkennen II van Montpellier, Montpellier, Frankrijk, en IMGT, het internationale Immunogenetica informatiesysteem, voor hun enorme ondersteuning en helpen met IG gene sequentieanalyse. Dit werk werd gedeeltelijk ondersteund door subsidies van TRANSCAN-179 roman JTC 2016; Associazione Italiana per la Ricerca sul Cancro AIRC (onderzoeker Grant #20246 en speciale programma moleculaire klinische oncologie-5 promille #9965), Milano, Italië; Progetti di Rilevante Interesse Nazionale (PRIN) #2015ZMRFEA, MIUR, Rome, Italië; De Zweedse Cancer Society, de Zweedse Onderzoeksraad, Knut en Alice Wallenberg Foundation, Karolinska Institutet, Universiteit van Uppsala, Uppsala Universiteitsziekenhuis en de Lion’s Cancer Research Foundation, Uppsala; ODYSSEUS-programma, ten uitvoer gelegd onder de “actie voor de strategische ontwikkeling over the onderzoek en technologische Sector”, gefinancierd door het operationeleprogramma “Concurrentievermogen, ondernemerschap en innovatie” (NSRK 2014-2020) en medegefinancierd door Griekenland en de Europese Unie (Europees Regionaal Ontwikkelingsfonds).

Materials

BD Vacutainer Plastic Blood Collection Tubes with K2EDTA: Tube Stopper ThermoFisher scientific 02-689-4 material storage
BD Vacutainer CPT Mononuclear Cell Preparation Tube – Sodium Heparin Becton Dickinson 362753 material storage
BD Vacutainer Heparin Blood Collection Tubes FAQ Daigger Scientific 366480 material storage
UltraPure 0.5 M EDTA pH 8.0 Invitrogen 15575038 cell processing
Centrifuge tubes 15 mL CS500 Corning 352096 cell processing
Centrifuge tubes PP 50 mL CS500 Corning 352070 cell processing
RPMI Medium 1640 (1X) liquid Invitrogen 21875-091 cell processing
Ficoll-Paque PLUS, 6 x 100 mL STEMCELL Technologies 17-1440-02 cell processing
Serological pipettes 5 mL Sarstedt 861,253,001 cell processing
Serological pipettes 10 mL Sarstedt 861,254,001 cell processing
Serological pipettes 25 mL Sarstedt 861,685,001 cell processing
Dulbecco's Phosphate-Buffered Saline (D-PBS) (1X) Invitrogen 14190250 cell processing
Neubauer plate Marienfeld-Superior 640010 cell processing
Tuerk solution Sigma-Aldrich 93770 cell processing
PureLink Genomic DNA Mini Kit Invitrogen K1820-01 DNA extraction
QIAamp RNA Blood Mini Kit Qiagen 52304 RNA extraction
AllPrep DNA/RNA Mini Kit Qiagen 80204 DNA/RNA extraction
5X first-strand buffer Invitrogen P/N Y02321 cDNA synthesis
Random Primers, 20 µg Promega C1181 cDNA synthesis
RNaseOUT&trade;  Recombinant Ribonuclease Inhibitor Invitrogen 10777019 cDNA synthesis
DTT Invitrogen P/N Y00147 cDNA synthesis
SuperScript II Reverse Transcriptase Invitrogen 18064-014 cDNA synthesis
10 mM dNTP Mix Invitrogen 18427013 cDNA synthesis, PCR
PCR Buffer Invitrogen O00065 PCR
MgCl2 (magnesium chloride) (25 mM) ThermoFisher scientific AB0359 PCR
Taq DNA Polymerase, recombinant Invitrogen 10342-020 PCR
Applied Biosystems 5′ Labeled Primers ThermoFisher scientific – PCR/Clonality assessment
Agilent High Sensitivity DNA Kit Agilent Technologies 5067-4626 PCR product quantification
UltraPure TBE Buffer, 10X ThermoFisher scientific 15581044 gel electrophoresis
UltraPure Ethidium Bromide, 10 mg/mL ThermoFisher scientific 15585011 gel electrophoresis
SYBR Safe DNA Gel Stain ThermoFisher scientific S33102 gel electrophoresis
10X BlueJuice Gel Loading Buffer Invitrogen 16500100 gel electrophoresis
DNA Ladder 1000 bp/1 kb ladder BLUE ready-to-use Geneon 305-105 gel electrophoresis
UltraPure Agarose ThermoFisher scientific 16500500 gel electrophoresis
Agarose low gelling temperature Sigma-Aldrich A9414-250G gel electrophoresis
Novex TBE Gels, 10%, 10 well ThermoFisher scientific EC6275BOX gel electrophoresis
ExoSAP-IT PCR Product Cleanup Reagent ThermoFisher scientific 78201.1.mL PCR product clean-up
QIAquick Gel Extraction Kit (50) Qiagen 28704 PCR product clean-up
GenomeLab DTCS Quick Start Kit Beckman Coulter 608120 Sanger sequencing
Sodium Acetate Solution (3 M), pH 5.2 ThermoFisher scientific R1181 Sanger sequencing
Glycogen, molecular biology grade ThermoFisher scientific R0561 Sanger sequencing
Ethanol absolute EMD Millipore 1024282500 Sanger sequencing
SafeSeal tube 1.5 mL Sarstedt 72,706 general use
Multiply-Pro cup 0.2 mL, PP Sarstedt 72,737,002 general use
Centrifuge equipment
PCR machine equipment
Bioanalyzer Agilent Technologies equipment
DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Swerdlow, S. H., et al. . WHO classification of tumors of haematopoietic and lymphoid tissues. 2, (2017).
  2. Baliakas, P., Mattsson, M., Stamatopoulos, K., Rosenquist, R. Prognostic indices in chronic lymphocytic leukaemia: where do we stand how do we proceed?. Journal of Internal Medicine. 279 (4), 347-357 (2016).
  3. Sutton, L. A., Rosenquist, R. The complex interplay between cell-intrinsic and cell-extrinsic factors driving the evolution of chronic lymphocytic leukemia. Seminars in Cancer Biology. , (2015).
  4. Mina, A., et al. Using prognostic models in CLL to personalize approach to clinical care: Are we there yet?. Blood Reviews. , (2017).
  5. Sutton, L. A., et al. Immunoglobulin genes in chronic lymphocytic leukemia: Key to understanding the disease and improving risk stratification. Haematologica. 102 (6), 968-971 (2017).
  6. Damle, R. N., et al. Ig V gene mutation status and CD38 expression as novel prognostic indicators in chronic lymphocytic leukemia. Blood. 94 (6), 1840-1847 (1999).
  7. Hamblin, T. J., Davis, Z., Gardiner, A., Oscier, D. G., Stevenson, F. K. Unmutated Ig V(H) genes are associated with a more aggressive form of chronic lymphocytic leukemia. Blood. 94 (6), 1848-1854 (1999).
  8. Burger, J. A., Chiorazzi, N. B cell receptor signaling in chronic lymphocytic leukemia. Trends in Immunology. 34 (12), 592-601 (2013).
  9. Packham, G., et al. The outcome of B-cell receptor signaling in chronic lymphocytic leukemia: proliferation or anergy. Haematologica. 99 (7), 1138-1148 (2014).
  10. Messmer, B. T., et al. Multiple distinct sets of stereotyped antigen receptors indicate a role for antigen in promoting chronic lymphocytic leukemia. The Journal of Experimental Medicine. 200 (4), 519-525 (2004).
  11. Stamatopoulos, K., et al. Over 20% of patients with chronic lymphocytic leukemia carry stereotyped receptors: Pathogenetic implications and clinical correlations. Blood. 109 (1), 259-270 (2007).
  12. Agathangelidis, A., et al. Stereotyped B-cell receptors in one-third of chronic lymphocytic leukemia: a molecular classification with implications for targeted therapies. Blood. 119 (19), 4467-4475 (2012).
  13. Stamatopoulos, K., Agathangelidis, A., Rosenquist, R., Ghia, P. Antigen receptor stereotypy in chronic lymphocytic leukemia. Leukemia. 31 (2), 282-291 (2017).
  14. Baliakas, P., et al. Clinical effect of stereotyped B-cell receptor immunoglobulins in chronic lymphocytic leukaemia: A retrospective multicentre study. The Lancet Haematology. 1 (2), 74-84 (2014).
  15. Gounari, M., et al. Excessive antigen reactivity may underlie, the clinical aggressiveness of chronic lymphocytic leukemia stereotyped subset #8. Blood. 125 (23), 3580-3587 (2015).
  16. Ntoufa, S., et al. B cell anergy modulated by TLR1/2 and the miR-17 approximately 92 cluster underlies the indolent clinical course of chronic lymphocytic leukemia stereotyped subset #4. Journal of Immunology. 196 (10), 4410-4417 (2016).
  17. Mansouri, L., et al. Functional loss of IkappaBepsilon leads to NF-kappaB deregulation in aggressive chronic lymphocytic leukemia. The Journal of Experimental Medicine. 212 (6), 833-843 (2015).
  18. Navrkalova, V., et al. ATM mutations in major stereotyped subsets of chronic lymphocytic leukemia: enrichment in subset #2 is associated with markedly short telomeres. Haematologica. 101 (9), e369-e373 (2016).
  19. Rossi, D., et al. Association between molecular lesions and specific B-cell receptor subsets in chronic lymphocytic leukemia. Blood. 121 (24), 4902-4905 (2013).
  20. Sutton, L. A., et al. Different spectra of recurrent gene mutations in subsets of chronic lymphocytic leukemia harboring stereotyped B-cell receptors. Haematologica. 101 (8), 959-967 (2016).
  21. Fischer, K., et al. Long-term remissions after FCR chemoimmunotherapy in previously untreated patients with CLL: Updated results of the CLL8 trial. Blood. 127 (2), 208-215 (2016).
  22. Rossi, D., et al. Molecular prediction of durable remission after first-line fludarabine-cyclophosphamide-rituximab in chronic lymphocytic leukemia. Blood. 126 (16), 1921-1924 (2015).
  23. Thompson, P. A., et al. Fludarabine, cyclophosphamide, and rituximab treatment achieves long-term disease-free survival in IGHV-mutated chronic lymphocytic leukemia. Blood. 127 (3), 303-309 (2016).
  24. Hallek, M., et al. Guidelines for diagnosis, indications for treatment, response assessment and supportive management of chronic lymphocytic leukemia. Blood. , (2018).
  25. van Dongen, J. J., et al. Design and standardization of PCR primers and protocols for detection of clonal immunoglobulin and T-cell receptor gene recombinations in suspect lymphoproliferations: report of the BIOMED-2 Concerted Action BMH4-CT98-3936. Leukemia. 17 (12), 2257-2317 (2003).
  26. Campbell, M. J., Zelenetz, A. D., Levy, S., Levy, R. Use of family specific leader region primers for PCR amplification of the human heavy chain variable region gene repertoire. Molecular Immunology. 29 (2), 193-203 (1992).
  27. Rosenquist, R., et al. Immunoglobulin gene sequence analysis in chronic lymphocytic leukemia: updated ERIC recommendations. Leukemia. 31 (7), 1477-1481 (2017).
  28. Linke, B., et al. Automated high resolution PCR fragment analysis for identification of clonally rearranged immunoglobulin heavy chain genes. Leukemia. 11 (7), 1055-1062 (1997).
  29. Gonzalez, M., et al. Heteroduplex analysis of VDJ amplified segments from rearranged IgH genes for clonality assessments in B-cell non-Hodgkin’s lymphoma. A comparison between different strategies. Haematologica. 84 (9), 779-784 (1999).
  30. Brochet, X., Lefranc, M. P., Giudicelli, V. IMGT/V-QUEST: The highly customized and integrated system for IG and TR standardized V-J and V-D-J sequence analysis. Nucleic Acids Research. 36 (Web Server issue), W503-W508 (2008).
  31. Yousfi Monod, M., Giudicelli, V., Chaume, D., Lefranc, M. P. IMGT/JunctionAnalysis: The first tool for the analysis of the immunoglobulin and T cell receptor complex V-J and V-D-J JUNCTIONs. Bioinformatics. 20, i379-i385 (2004).
  32. Bystry, V., et al. ARResT/AssignSubsets: A novel application for robust subclassification of chronic lymphocytic leukemia based on B cell receptor IG stereotypy. Bioinformatics. 31 (23), 3844-3846 (2015).
  33. Belessi, C. J., et al. IGHV gene insertions and deletions in chronic lymphocytic leukemia: "CLL-biased" deletions in a subset of cases with stereotyped receptors. European Journal of Immunology. 36 (7), 1963-1974 (2006).
  34. Langerak, A. W., et al. Immunoglobulin sequence analysis and prognostication in CLL: guidelines from the ERIC review board for reliable interpretation of problematic cases. Leukemia. 25 (6), 979-984 (2011).
  35. Heyman, B., Volkheimer, A. D., Weinberg, J. B. Double IGHV DNA gene rearrangements in CLL: Influence of mixed-mutated and -unmutated rearrangements on outcomes in CLL. Blood Cancer Journal. 6 (7), e440 (2016).
  36. Farooqui, M. Z., et al. Ibrutinib for previously untreated and relapsed or refractory chronic lymphocytic leukaemia with TP53 aberrations: A phase 2, single-arm trial. The Lancet Oncology. 16 (2), 169-176 (2015).
  37. Furman, R. R., et al. Idelalisib and rituximab in relapsed chronic lymphocytic leukemia. The New England Journal of Medicine. 370 (11), 997-1007 (2014).
  38. Burger, J. A., et al. Ibrutinib as initial therapy for patients with chronic lymphocytic leukemia. The New England Journal of Medicine. 373 (25), 2425-2437 (2015).

Tags

Immunoglobulin Gene Sequence AnalysisChronic Lymphocytic LeukemiaPrognosisPCRDensity GradientMononuclear CellsCell CountPrimer MixPCR Reagents

Play Video
PDF
DOI
DOWNLOAD MATERIALS LIST
Cite This Article
Agathangelidis, A., Sutton, L. A., Hadzidimitriou, A., Tresoldi, C., Langerak, A. W., Belessi, C., Davi, F., Rosenquist, R., Stamatopoulos, K., Ghia, P. Immunoglobulin Gene Sequence Analysis In Chronic Lymphocytic Leukemia: From Patient Material To Sequence Interpretation. J. Vis. Exp. (141), e57787, doi:10.3791/57787 (2018).
Download Citation
Reprints and Permissions

View Video

✖

To prove you're not a robot, please enter the text in the image below

CAPTCHA Image
Play CAPTCHA Audio
Refresh Image