ניתוח מתא בודד של Immunophenotype וייצור ציטוקין בדם כל הפריפריה באמצעות Cytometry המונית
Summary
כאן נתאר בגישה פרוטיאומיה מבנית תא בודד כדי להעריך את החיסון פנוטיפי ו פונקציונלי (ציטוקינים תאיים אינדוקציה) שינויים בדגימות דם היקפיים, נותחו באמצעות cytometry המוני.
Abstract
ציטוקינים לשחק תפקיד מרכזי בפתוגנזה של מחלות אוטואימוניות. לפיכך, מדידת רמות ציטוקינים כבר המוקד של מחקרים רבים בניסיון להבין את המנגנונים מדויק להוביל להתמוטטות של self-tolerance ושל הבאים מחלת חיסון עצמי. הגישות כה התבססו על המחקר של היבט מסוים אחד של המערכת החיסונית (יחיד או מספר סוגי תאים או ציטוקינים), ואת לא מציעים הערכה גלובלית של מחלה אוטואימונית מורכבת. בעוד מחקרים מבוססי סרה החולה היה להרשות לעצמו תובנות חשובות מחלת חיסון עצמי, הם אינם מספקים מקור סלולרית מסוימת ציטוקינים dysregulated זוהה. גישה בתא יחיד כוללת כדי להעריך את ייצור ציטוקינים קבוצות משנה מרובות תאים חיסוניים, בהקשר של “מהותי” פלזמה החולה הספציפי במחזור גורמים, מתואר כאן. גישה זו מאפשרת ניטור של פנוטיפ המערכת החיסונית החולה הספציפי (סמני פני השטח) פונקציה (ציטוקינים), או מקורי שלו “מהותי פתוגניים” מחלת המדינה, או הנוכחות של סוכני טיפולית (vivo בתוך או ex-vivo).
Introduction
מחלות אוטואימוניות הן הגורם העיקרי התחלואה והתמותה המשפיעים על 3-8% מכלל האוכלוסייה. בארצות הברית, הפרעות אוטואימוניות הם בין הגורמים המובילים. למוות אצל נשים בגיל העמידה, צעיר (גילאי < 65 שנה)1,2. הפרעות אוטואימוניות מאופיינים מצגת הטרוגניות קלינית ותהליכים אימונולוגי כבסיס מגוונות. הספקטרום של הטרוגניות מיוצגת היטב על פני הפרעות שונות, כגון משותפת במעורבות דלקת מפרקים שגרונית (RA), מחלה נוירולוגית ב טרשת נפוצה (MS). עם זאת, רמה זו של הטרוגניות היא גם ביטוי תוך הפרעה יחיד, כגון זאבת אדמנתית מערכתית (מירה כהן): חלק מהחולים יכול להציג עם הפתולוגיה הכליה, בעוד שאחרים סובלים מעורבות המטולוגיות או משותפת3.
השיגה הבסיסית הפרעות אוטואימוניות שיקוף של הטרוגניות קלינית, מעורבים, hyper-הפעלה אוטומטית של מספר קבוצות משנה תא החיסון מולדים, גמישים, וייצור dysregulated והמצוות ציטוקין. ואילו ציטוקינים לשחק תפקיד מרכזי בפתוגנזה של מחלת חיסון עצמי, הבנת תפקידם ספציפית את המנגנון של מחלת הוכיחה להיות מאתגרת. ציטוקינים מאופיינים פליאוטרופיה (ציטוקין אחד יכול להיות אפקטים מרובים על סוגי תאים שונים), יתירות (ציטוקינים מרובים יכול להיות אפקט זהה), דואליות (ציטוקין אחד יכול להיות פרו – או אנטי – inflammatory תופעות בתנאים שונים), הפלסטיות (ציטוקינים יכול להיות יצוק לתוך תפקיד שונה מכל אחד “מקורי”, בהתאם לסביבת)4,5,6. כתוצאה מכך, האוכלוסיה ברמת שיטות מבדילה הטרוגנית הסלולר התגובות לאותו “ציטוקין סביבה”. באופן דומה, לומדים עיצובים להתמקד בהיבט מסוים אחד של המערכת החיסונית (סוג של תא בודד או ציטוקינים), לא מציעים הערכה גלובלית של כל הגורמים המעורבים מחלות אוטואימוניות מורכבות. בעוד מחקרים מבוססי סרה החולה היה להרשות לעצמו תובנות חשובות מחלת חיסון עצמי, הם אינם מספקים מקור סלולרית מסוימת ציטוקינים dysregulated זוהה.
לאחרונה פיתחנו בגישה פרוטיאומיה מבנית תא בודד בו זמנית להעריך מספר סוגי תאים חיסוניים, לזהות חצרו של המטופל הספציפי “פתוגניים” פלזמה דם היקפיים במחזור גורמים לפליטת ציטוקינים שונים שלהם. זרימת העבודה המתוארת כאן מאופיין על ידי השימוש של דגימות דם היקפיים ללא פגע, לעומת תאי תאי דם היקפיים מבודד (PBMCs). דם היקפיים מייצג את הרכב הרלוונטיים ביותר מבחינה פיזיולוגית ללמוד מחלה מערכתית בתיווך החיסון, כולל 1) הלא-תאי תאי דם לעיתים קרובות מעורבים מחלות אוטואימוניות (קרי, נויטרופילים, טסיות דם), ו 2) פלזמה במחזור גורמים, כגון חומצות גרעין, מכלולים חיסוניים ציטוקינים, אשר יש תפקידים הפעלת מערכת החיסון. כדי ללכוד “מהותי פתוגניים” dysregulated ייצור ציטוקינים, דם היקפיים דגימות יעובדו מיד לאחר ההגרלה דם (T0, זמן אפס), ואחרי 6-אייץ ‘ של דגירה ב 37 מעלות צלזיוס (חום הגוף פיזיולוגיים) עם טרנספורט חלבון מעכב, בהעדר כל אקסוגניים מגרה תנאי (T6, הזמן 6 h), כדי לזהות ייצור ציטוקינים (הצטברות, T6-T0) המשקפים את מצב המחלה “מהותי” (איור 1). ללמוד תהליכים dysregulated המשקפים מעל או מתחת הפעלת איתות המעורבים בתגובות החיסון הרלוונטיים למחלה, בדגימת דם היקפיים שטופלו (6-אייץ ‘ הדגירה ב 37 ° C עם מעכב תחבורה חלבון) אקסוגני עירור מצב זה משקף בפתוגנזה של המחלה, כגון אגרה-כמו-קולטן (TLR) אגוניסטים במקרה של מירה כהן (T6 + R848, הזמן 6 h עם µg 1/mL R848), כדי לזהות ייצור ציטוקינים שתשקף בתגובה חומצות גרעין (השוואת T0 לעומת T6 לעומת T6 + R848, איור 1). ללמוד immunomodulatory ההשפעות של הרפוי זמין ex-vivo, ובארכיון לתהליכים מדויקים dysregulated המערכת החיסונית לחולים ספציפיים, דגימות דם היקפיים שטופלו JAK מעכב-הרלוונטי טיפולית ריכוז (כאן, 5 אום ruxolitinib; T6 + 5R, זמן 6 שעות עם 5 אום ruxolitinib), כדי לזהות שינויים במצב המחלה “מהותי”, בתגובה התרופה (T0 לעומת T6 לעומת T6 + 5R, איור 1). מעכב JAK נבחר במחקר זה כיוון JAK מעכבי הוכחו להיות מוצלח בטיפול של הפרעות אוטואימוניות כגון רה
להעריך בו זמנית את התהליכים dysregulated המתוארים לעיל מספר ערכות המשנה תא החיסון, דגימות דם היקפיים של מירה כהן החולים בקרות בריא היו כמתואר לעיל מעובדים נותחו על ידי cytometry המוני. המוני cytometry, הידוע גם בשם Cytometry-זמן-של-טיסה, מציע ניתוח מתא בודד של פרמטרים מעל 40 בלי בעיות של ספקטרלי חופפים7,8,9. טכניקה זו מנצל איזוטופים נדירים מתכת בצורת יונים מתכתיים מסיסים כמו תגיות מוכרחים נוגדנים, במקום fluorophores10. ניתן למצוא פרטים נוספים על הפלטפורמה הטכנולוגית cytometry המוני (קרי, כוונון, כיול, דוגמת רכישה). Leipold et al. , מקארתי. et al. 11 , 12 הגבוה–ממדיות של cytometry המונים מאפשר מדידה סימולטני של ציטוקינים מרובים לאורך קבוצות משנה תא החיסון מולדים, גמישים עם צפיפות בתא יחיד (טבלה של חומרים).
פרמטרים קליניים ומעבדתיים קונבנציונליים הנוכחי הם לעתים קרובות אינם רגישים או ספציפית מספיק לגילוי פעילות המחלה מתמשך או התגובה immunomodulators ספציפיים13, המשקף את הצורך כדאי ניסחו את החיסון הבסיסי שינויים כי הכונן התלקחויות. נתון את התפשטותו של ציטוקין dysregulation מחלת חיסון עצמי, יש שפע של גישות טיפול להשתמש נוגדנים או מעכבי מולקולרי קטן מיקוד ציטוקינים או איתות החלבונים המעורבים ברגולציה של ייצור ציטוקינים לאחרונה הופיע. בתבנית בסיסית שלו, הגישה האנליטית דם היקפיים המתוארים כאן מספק פלטפורמה כדי לזהות קבוצות משנה ספציפי לחולה dysregulated תא ייצורם ציטוקין חריגה במחלות אוטואימוניות עם ביטויים מערכתית. מתודולוגיה זו מאפשרת התאמה אישית של אפשרויות טיפוליות כמו ציטוקינים dysregulated ספציפי ניתן לזהות, טיפול מיוחד אפשרויות יכול להיות נבדק לשעבר vivo כדי להעריך את היכולת שלהם immunomodulate המחלה הספציפי המטופל תהליך.
Protocol
Representative Results
Discussion
כאן נתאר את הרומן, תא בודד, פרוטיאומיה מבנית גישה בו זמנית להעריך מספר סוגי תאים חיסוניים, לזהות חצרו של המטופל הספציפי “פתוגניים” פלזמה דם היקפיים במחזור גורמים לפליטת ציטוקינים שונים שלהם. שיטה זו מעסיקה דם היקפיים ‘ הרכב אנליטית, וכן cytometry המונית של הכלי על ההערכה של מערכת החיסון התאית חר?…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
ברצוננו להודות איימי ששחה-ברנרד שלה קלט רוחני והערות מועילות. עבודה זו נתמכה על ידי וארינג Boettcher קרן וב פרס המחקר הביו-רפואי ופרס שהמספר K23-1K23AR070897 מ- NIH אלנה W.Y. Hsieh. היא גם נתמך על ידי פרס מספר K12-HD000850 מן המכון הלאומי יוניס קנדי שרייבר בריאות הילד ואת ההתפתחות האנושית קרן ולוסיל פקארד בריאות לילדים, סטנפורד CTSA UL1 TR001085 של מחקר בריאות הילד אוניברסיטת המכון של סטנפורד.
Materials
| Ruxolitinib | Santa Cruz | SC-364729A | Stock Conc: 10 mM; Final Conc: 5 μM |
| R848 | Invivogen | tlrl-r848-5 | Stock Conc: 1 μg/μL; Final Conc: 1 μg/mL |
| LPS-EK | Invivogen | tlrl-eklps | Stock Conc: 1 μg/μL; Final Conc: 0.1 μg/mL |
| Sterile PBS | Lonza | 17-516F | |
| Lyse/Fix Buffer | BD biosciences | 558049 | Stock Conc: 5X; Final Conc: 1X (dilute in ddH2O) |
| BD Phosflow perm/wash buffer I | BD biosciences | 557885 | Stock Conc: 10X; Final Conc: 1:10 (dilute in ddH2O) |
| RPMI | Gibco | 21870-076 | |
| Sodium Azide (NaN3) | Sigma-Aldrich | S-8032 | Stock Conc: >99.9%; Final Conc: 0.0002 |
| Protein Transport Inhibitor (PTI) | eBiosciences | 00-4980-93 | Stock Conc: 500X; Final Conc: 1X |
| DNA Intercalator | Fluidigm | 201192B | Stock Conc: 500 μM; Final Conc: 0.1 μM |
| Cell Staining Media (CSM) | PBS + 0.5% BSA, 0.02% NaN3 | ||
| MaxPar Barcode Perm Buffer | Fluidigm | 201057 | Stock Conc: 10X; Final Conc: 1X |
| 20-plex Pd Barcode Set | Fluidigm | S0014 | Stock Conc: n/a; Final Conc: n/a |
| EQ TM Four Element Calibration Beads | Fluidigm | 201078 | Stock Conc: 10X; Final Conc: 1X |
| 16% MeOH-free Formaldehyde Solution | Thermo | 28908 | Stock Conc: 16% (w/v); Final Conc: 1.6% (w/v) |
| Sterile round bottom polystyrene tubes | VWR | 60818-496 | Stock Conc: n/a; Final Conc: n/a |
| Polypropylene cluster tubes | Light Labs | A-9001 | Stock Conc: n/a; Final Conc: n/a |
| Helios CyTOF instrument | Fluidigm | Helios | All solutions to be used in CyTOF analysis need to be free of metal contamination. ddH2O is used in the preparation of any solutions should have a resistivity of at least 18.0 MΩ.cm. ddH2O and any self-prepared solutions should be stored in new plastic or glass bottles that have never been autoclaved. |
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Antibodies used for Mass Cytometry | |||
| Surface markers | |||
| CD1c | Biolegend | L161 | Mass: 161 |
| CD3 | BD | UCHT1 | Mass: 144 |
| CD4 | Biolegend | SK3 | Mass: 174 |
| CD7 | BD | M-T701 | Mass: 149 |
| CD8 | Biolegend | SK1 | Mass: 142 |
| CD11b | Fluidigm | ICRF44 | Mass: 209 |
| CD11c | BD | B-ly6 | Mass: 152 |
| CD15 | BD | HI98 | Mass: 115 |
| CD14 | Biolegend | M5E2 | Mass: 154 |
| CD16 | eBioscience/Thermo | B73.1 | Mass: 165 |
| CD19 | Santa Cruz | SJ25C1 | Mass: 163 |
| CD21 | Biolegend | Bu32 | Mass: 141 |
| CD27 | BD | L128 | Mass: 155 |
| CD38 | Fluidigm | HIT2 | Mass: 172 |
| CD45 total | Biolegend | HI30 | Mass: 89 |
| CD45RA | Biolegend | HI100 | Mass: 153 |
| CD56 | Miltenyi | REA196 | Mass: 168 |
| CD66 | BD | B1.1/CD66 | Mass: 113 |
| CD86 | Fluidigm | IT2.2 | Mass: 150 |
| CD123 | Fluidigm | 6H6 | Mass: 143 |
| CD278/ICOS | Biolegend | C398.4A | Mass: 156 |
| CD179/PD1 | Biolegend | EH12.2H7 | Mass: 162 |
| IgD | Biolegend | IA6-2 | Mass: 146 |
| IgM | Biolegend | MHM-88 | Mass: 151 |
| CXCR5 | BD | RF8B2 | Mass: 173 |
| HLADR | Biolegend | L243 | Mass: 167 |
| Cytokines | |||
| IL-1α | Biolegend | 364-3B3-14 | Mass: 147 |
| IL-1β | Biolegend | H1b-98 | Mass: 169 |
| IL-1RA | Santa Cruz | AS17 | Mass: 157 |
| IL-6 | Biolegend | MQ2-13A5 | Mass: 164 |
| IL-8 | BD | E8N1 | Mass: 160 |
| IL-12/IL-23p40 | Biolegend | C8.6 | Mass: 171 |
| IL-17A | Biolegend | BL168 | Mass: 148 |
| IL23p19 | eBioscience/Thermo | 23dcdp | Mass: 176 |
| MIP1β | BD | D21-1351 | Mass: 158 |
| MCP1 | BD | 5D3-F7 | Mass: 170 |
| IFNα | Miltenyi | LT27:295 | Mass: 175 |
| IFNγ | Biolegend | 4S.B3 | Mass: 165 |
| PTEN | BD | A2B1 | Mass: 159 |
| TNFα | Biolegend | Mab11 | Mass: 166 |
| Note: If the manufacturer is stated as Fluidigm, this antibody was purchased from Fluidigm with metal pre-conjugated. If the manufacturer is stated as other than Fluidigm, this antibody was self-conjugated using the MaxPar Multi-Metal Labeling Kit (Fluidigm Cat: 201300) according to manufacturer protocol. |
References
- Walsh, S. J., Rau, L. M. Autoimmune diseases: a leading cause of death among young and middle-aged women in the United States. American journal of public health. 90 (9), 1463-1466 (2000).
- Mak, A., Cheung, M. W. -. L., Chiew, H. J., Liu, Y., Ho, R. C. -. M. Global trend of survival and damage of systemic lupus erythematosus: meta-analysis and meta-regression of observational studies from the 1950s to 2000s. Seminars in arthritis and rheumatism. 41 (6), 830-839 (2012).
- Kaul, A., Gordon, C., et al. Systemic lupus erythematosus. Nature reviews. Disease primers. 2, 16039 (2016).
- Annunziato, F., Romagnani, S. Heterogeneity of human effector CD4+ T cells. Arthritis Research & Therapy. 11 (6), 257 (2009).
- Peck, A., Mellins, E. D. Plasticity of T-cell phenotype and function: the T helper type 17 example. Immunology. 129 (2), 147-153 (2010).
- Basso, A. S., Cheroutre, H., Mucida, D. More stories on Th17 cells. Cell research. 19 (4), 399-411 (2009).
- Ornatsky, O., Bandura, D., Baranov, V., Nitz, M., Winnik, M. A., Tanner, S. Highly multiparametric analysis by mass cytometry. Journal of Immunological Methods. 361 (1-2), 1-20 (2010).
- Ornatsky, O., Baranov, V. I., Bandura, D. R., Tanner, S. D., Dick, J. Multiple cellular antigen detection by ICP-MS. Journal of Immunological Methods. 308 (1-2), 68-76 (2006).
- Bendall, S. C., Simonds, E. F., et al. Single-Cell Mass Cytometry of Differential Immune and Drug Responses Across a Human Hematopoietic Continuum. Science. 332 (6030), 687-696 (2011).
- Bandura, D. R., Baranov, V. I., et al. Mass Cytometry: Technique for Real Time Single Cell Multitarget Immunoassay Based on Inductively Coupled Plasma Time-of-Flight Mass Spectrometry. Analytical Chemistry. 81 (16), 6813-6822 (2009).
- Leipold, M. D., Maecker, H. T. Mass cytometry: protocol for daily tuning and running cell samples on a CyTOF mass cytometer. Journal of visualized experiments : JoVE. (69), e4398 (2012).
- McCarthy, R. L., Duncan, A. D., Barton, M. C. Sample Preparation for Mass Cytometry Analysis. Journal of visualized experiments : JoVE. (122), (2017).
- Rahman, A., Isenberg, D. A. Systemic lupus erythematosus. The New England journal of medicine. 358 (9), 929-939 (2008).
- O’Gorman, W. E., Hsieh, E. W. Y., et al. Single-cell systems-level analysis of human Toll-like receptor activation defines a chemokine signature in patients with systemic lupus erythematosus. The Journal of allergy and clinical immunology. 136 (5), 1326-1336 (2015).
- O’Gorman, W. E., Kong, D. S., et al. Mass cytometry identifies a distinct monocyte cytokine signature shared by clinically heterogeneous pediatric SLE patients. Journal of Autoimmunity. 81, 74-89 (2017).
- Simonds, E. F., Bendall, S. C., et al. Extracting a cellular hierarchy from high-dimensional cytometry data with SPADE. Nature Biotechnology. , 1-8 (2011).
- Amir, E. -. A. D., Davis, K. L., et al. viSNE enables visualization of high dimensional single-cell data and reveals phenotypic heterogeneity of leukemia. Nature Biotechnology. 31 (6), 545-552 (2013).
- Bruggner, R. V., Bodenmiller, B., Dill, D. L., Tibshirani, R. J., Nolan, G. P. Automated identification of stratifying signatures in cellular subpopulations. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 111 (26), E2770-E2777 (2014).
- Levine, J. H., Simonds, E. F., et al. Data-Driven Phenotypic Dissection of AML Reveals Progenitor-like Cells that Correlate with Prognosis. Cell. 162 (1), 184-197 (2015).
- Samusik, N., Good, Z., Spitzer, M. H., Davis, K. L., Nolan, G. P. Automated mapping of phenotype space with single-cell data. Nature Publishing Group. 13 (6), 493-496 (2016).
- Spitzer, M. H., Gherardini, P. F., et al. IMMUNOLOGY. An interactive reference framework for modeling a dynamic immune system. Science. 349 (6244), 1259425 (2015).
- Fienberg, H. G., Simonds, E. F., Fantl, W. J., Nolan, G. P., Bodenmiller, B. A platinum-based covalent viability reagent for single-cell mass cytometry. Cytometry Part A. 81 (6), 467-475 (2012).
- Jansen, K., Blimkie, D., et al. Polychromatic flow cytometric high-throughput assay to analyze the innate immune response to Toll-like receptor stimulation. Journal of Immunological Methods. 336 (2), 183-192 (2008).
- Zunder, E. R., Finck, R., et al. Palladium-based mass tag cell barcoding with a doublet-filtering scheme and single-cell deconvolution algorithm. Nature Protocols. 10 (2), 316-333 (2015).
- Lai, L., Ong, R., Li, J., Albani, S. A CD45-based barcoding approach to multiplex mass-cytometry (CyTOF). Cytometry Part A. , (2015).
- Mei, H. E., Leipold, M. D., Schulz, A. R., Chester, C., Maecker, H. T. Barcoding of live human peripheral blood mononuclear cells for multiplexed mass cytometry. The Journal of Immunology. 194 (4), 2022-2031 (2015).
- Finck, R., Simonds, E. F., et al. Normalization of mass cytometry data with bead standards. Cytometry Part A. 83 (5), 483-494 (2013).
- Takahashi, C., Au-Yeung, A., et al. Mass cytometry panel optimization through the designed distribution of signal interference. Cytometry. Part A : the journal of the International Society for Analytical Cytology. 91 (1), 39-47 (2017).
