Einzellige Analyse der Immunophenotype und Produktion von Zytokinen im peripheren Blut über Masse Zytometrie

Autoimmunerkrankungen sind eine der Hauptursachen für Morbidität und Mortalität 3-8 % der Bevölkerung betroffen. In den Vereinigten Staaten, autoimmune-Erkrankungen gehören zu den führenden Todesursachen bei junge und Mittelalte Frauen (Alter < 65 Jahre)^1,2. Autoimmune-Erkrankungen zeichnen sich durch heterogene klinische Präsentation und unterschiedlichen zugrunde liegenden immunologische Prozesse. Das Spektrum der Heterogenität ist über verschiedene Störungen, wie gemeinsame Beteiligung bei der rheumatoiden Arthritis (RA) und neurologische Erkrankung bei multipler Sklerose (MS) vertreten. Dieses Maß an Heterogenität zeigt jedoch auch innerhalb einer einzelnen Störung, wie systemischer Lupus erythematodes (SLE): bei einigen Patienten können mit renal Pathologie präsentieren, während andere leiden an hämatologischen oder gemeinsame Beteiligung³.

Die zugrunde liegenden immunpathogenese in Autoimmun-Erkrankungen spiegelt die klinische Heterogenität, mit Auto – und hyper-Aktivierung von angeborenen und der adaptiven Immunzelle Teilmengen und damit einhergehende Dysregulated Produktion von Zytokinen. Während Zytokine eine zentrale Rolle in der Pathogenese von Autoimmunkrankheiten spielen, nachweislich verstehen ihre besondere Rolle in den Mechanismus der Krankheit eine Herausforderung sein. Zytokine sind geprägt von Pleiotropie (ein Zytokin kann mehrere Effekte auf verschiedene Zelltypen haben), Redundanz (mehrere Zytokine können die gleiche Wirkung haben), Dualität (ein Zytokin kann pro- und antiinflammatorische Effekte unter verschiedenen Bedingungen haben), und Plastizität (Zytokine können in eine Rolle unterscheidet sich von der “original”, je nach Umgebung geformt werden)^4,5,6. Folglich können nicht Populationsebene Methoden heterogene zelluläre Reaktionen auf die gleichen “Zytokin-Milieu” unterscheiden. In ähnlicher Weise bieten Studiendesigns, die sich auf einen spezifischen Aspekt des Immunsystems (eine einzelne Zellentyp oder Cytokine), keine Gesamtbewertung aller Elemente in komplexen Autoimmunkrankheit beteiligt. Während Sera-basierten Studien Patienten wichtige Erkenntnisse zur Autoimmunität geleistet haben, bieten sie nicht die spezifische zelluläre Quelle der Dysregulated Zytokine entdeckt.

Vor kurzem haben wir einen einzelligen Proteomic Ansatz zur Bewertung gleichzeitig mehrere Arten von Immunzellen und ihre verschiedenen Zytokin-Störungen im Umfeld des Patienten spezifische “pathogenen” peripheren Blutplasma zirkulierende Faktoren zu erkennen. Die hier beschriebene Workflow zeichnet sich durch die Verwendung von intakten peripheren Vollblut-Proben, im Gegensatz zu isolierten peripheren mononukleären Blutzellen (PBMCs). Peripheren Blut stellt die meisten physiologisch relevante Fahrzeug immun-vermittelte systemerkrankung, einschließlich 1) nicht-mononukleären Blutzellen oft eingebunden in Autoimmunerkrankung (d.h., Neutrophilen Granulozyten und Thrombozyten) und Plasma (2) studieren zirkulierenden Faktoren wie Nukleinsäuren, Immunkomplexe und Zytokine, haben die immun aktivierende Rollen. Erfassen der “inneren pathogenen” Dysregulated Produktion von Zytokinen, peripherem Blut Proben unmittelbar nach der Blutentnahme (T0, Stunde Null), und nach 6 h Inkubation bei 37 ° C (physiologische Körpertemperatur) mit einem Protein-Transport erfolgt Inhibitor bei fehlender exogene anregende Zustand (T6, Zeit 6 h), Produktion von Zytokinen (Akkumulation, T6-T0) erkennen, die die “intrinsische” Krankheitszustandes (Abbildung 1) widerspiegeln würde. Dysregulated Prozesse, die über widerspiegeln oder unter Aktivierung der Signalwege in Immunreaktionen relevant für die Krankheit, periphere Blutproben sind zu studieren (6 h Inkubation bei 37 ° C mit einem Protein-Transport-Inhibitor) mit einer exogenen behandelt Bedingung, die Pathogenese der Krankheit, wie Toll-Like-Rezeptor (TLR) Agonisten bei SLE (T6 + R848, mal 6 h mit 1 µg/mL R848), um die Produktion von Zytokinen zu erkennen, die eine Reaktion auf Nukleinsäuren widerspiegeln würde reflektiert anregend (Vergleich T0 vs. T6 vs. T6 + R848, Abbildung 1). Um immunmodulatorische Effekte von verfügbaren Therapeutika ex Vivo, studieren, wie sie die präzise immun Dysregulated Prozesse für bestimmte Patienten betreffen, werden mit einem JAK Inhibitor bei den relevanten therapeutischen peripherem Blutproben behandelt. Konzentration (hier 5 Umm Ruxolitinib; T6 + 5R, mal 6 h mit 5 Umm Ruxolitinib), zum Erkennen von Änderungen in “intrinsische” Krankheit Staat als Reaktion auf das Medikament (T0 vs. T6 vs. T6 + 5R, Abbildung 1). Ein JAK Inhibitor wurde für diese Studie ausgewählt, weil JAK-Hemmer nachweislich erfolgreich bei der Behandlung von Autoimmun-Krankheiten wie RA

Um gleichzeitig in mehreren Immunzelle Teilmengen, periphere Blutproben von SLE beschriebenen Dysregulated-Prozesse bewerten wurden Patienten und gesunden Kontrollpersonen verarbeitet, wie oben beschrieben und analysiert durch Masse zytometrie. Masse zytometrie, auch bekannt als Zytometrie-Time-Of-Flight, bietet einzellige Analyse von über 40 Parametern ohne Probleme der spektralen^7,8,9überlappen. Diese Technik nutzt seltene Erden Metall-Isotope in Form von löslichen Metall-Ionen als Tags an Antikörpern, statt Fluorophore¹⁰gebunden. Zusätzliche Details bezüglich der Masse zytometrie technological Platform (d.h., tuning und Kalibrierung, Probe Erwerb) finden Sie im Leipold Et Al. und McCarthy Et al. ^{11 , 12} High-Dimensionalität der Masse zytometrie ermöglicht gleichzeitige Messung mehrerer Zytokine in angeborene und adaptive Immunzellen Teilmengen mit einzelligen Granularität (Table of Materials).

Aktuelle konventionellen klinischen und Labor-Parameter sind oft nicht empfindlich oder spezifisch genug, zur Erkennung von laufenden Krankheitsaktivität oder die Reaktion auf bestimmte Immunmodulatoren¹³, reflektieren die Notwendigkeit, das zugrunde liegende Immunsystem besser abzugrenzen Änderungen, die Schübe zu fahren. Angesichts die Allgegenwart der Cytokine Dysregulation bei Autoimmunerkrankung, haben eine Vielzahl von Behandlungsansätzen, die Antikörper oder kleine Molekulare Inhibitoren targeting Zytokine oder signalproteinen beteiligt bei der Regulierung der Produktion von Zytokinen verwenden vor kurzem entstanden. In ihrer grundlegenden Form bietet der hier beschriebene peripherem Blut analytische Ansatz eine Plattform um patientenspezifische Dysregulated Zelle Teilmengen und ihre abnorme Zytokin-Produktion in Autoimmunerkrankung mit systemischen Manifestationen zu identifizieren. Diese Methodik ermöglicht die Personalisierung von therapeutischen Möglichkeiten wie spezifische Dysregulated Zytokine identifiziert werden können, und eine spezifische Behandlung, die Optionen Ex Vivo getestet zu ihrer Fähigkeit, Immunomodulate zu beurteilen Patienten spezifische Krankheit Prozesses.