Analyse unicellulaires lymphoblastiques et Production de cytokines dans le sang périphérique par cytométrie de flux massique

Les maladies auto-immunes sont une cause majeure de morbidité et de mortalité touchant 3-8 % de la population. Aux États-Unis, les maladies auto-immunes sont parmi les principales causes de décès chez les femmes jeunes et d’âge moyen (âges < 65 ans)^1,2. Maladies auto-immunes sont caractérisées par une présentation clinique hétérogène et divers processus immunologiques sous-jacents. Le spectre de l’hétérogénéité est bien représenté à travers différents troubles, comme articulaire dans la polyarthrite rhumatoïde (PR) et les maladies neurologiques dans la sclérose en plaques (MS). Toutefois, ce niveau d’hétérogénéité est également illustré dans un trouble unique, comme le lupus érythémateux systémique (les) : certains patients peuvent présenter des pathologie rénale, alors que d’autres souffrent de participation hématologique ou mixte³.

L’immunopathogenèse sous-jacente dans les maladies auto-immunes reflète l’hétérogénéité clinique, impliquant et hyper-activation automatique de plusieurs sous-ensembles de cellules immunitaires innée et adaptative et la production de cytokines dysrégulation concomitante. Alors que les cytokines jouent un rôle essentiel dans la pathogenèse de la maladie auto-immune, comprendre leur rôle spécifique dans le mécanisme de la maladie s’est avéré difficile. Cytokines sont caractérisés par la pléiotropie (une cytokine peut avoir des effets multiples sur différents types de cellules), redondance (cytokines multiples peuvent avoir le même effet), la dualité (une cytokine peut avoir des effets pro – ou anti-inflammatoires, dans des conditions différentes), et la plasticité (cytokines peut être moulé dans un rôle différent de son « original », selon l’environnement)^4,5,6. Par conséquent, méthodes l’échelle de la population ne peut pas distinguer les réponses cellulaires hétérogènes à la même « milieu de cytokine ». De même, les plans d’études qui mettent l’accent sur un aspect spécifique du système immunitaire (cellules du même type ou cytokine), n’offrent pas une évaluation globale de tous les éléments impliqués dans des maladies auto-immunes complexes. Alors que des études axées sur les sérums patients ont donné des renseignements importants sur l’auto-immunité, ils ne fournissent pas la source cellulaire spécifique des cytokines dysrégulation détectés.

Récemment, nous avons développé une approche protéomique monocellulaires pour évaluer simultanément plusieurs types de cellules immunitaires et détecter leurs diverses perturbations de cytokine dans le milieu du patient spécifiques « pathogènes » plasma sanguin périphérique facteurs circulants. Le workflow décrit ici est caractérisé par l’utilisation d’échantillons de sang périphérique intacte, par opposition aux cellules mononucléaires isolées du sang périphérique (PBMC). Sang périphérique représente le véhicule plus physiologiquement pertinent pour étudier la maladie auto-immune systémique, incluant 1) non-sang des mononucléaires souvent impliqués dans les maladies auto-immunes (p. ex., neutrophiles, plaquettes) et le plasma 2) circulant de facteurs, tels que les acides nucléiques, complexes immuns et cytokines, qui ont un rôle activateur immunitaire. Pour capturer le « intrinsèque pathogènes » dysrégulation la production de cytokines, les échantillons sont traités immédiatement après le tirage de sang (T0, temps zéro) et après 6 h d’incubation à 37 ° C (température du corps physiologique) avec un transport des protéines du sang périphérique inhibiteur en l’absence de toute condition de stimulation exogène (T6, durée 6 h), pour détecter la production de cytokines (accumulation, T6-T0) qui reflète l’état de la maladie « intrinsèque » (Figure 1). Pour étudier les processus de dysrégulation qui reflètent plus ou moins activation des voies de signalisation impliquées dans les réponses immunitaires pertinents à la maladie, des échantillons de sang périphérique sont traités (6 h d’incubation à 37 ° C avec un inhibiteur de transport de protéine) avec une exogène stimuler la condition qui reflète la pathogenèse de la maladie, tels que les agonistes des récepteurs Toll-Like (TLR) dans le cas de SLE (T6 + R848, temps de 6 h avec 1 µg/mL R848), pour détecter la production de cytokines qui refléterait une réponse aux acides nucléiques (comparant T0 vs T6 vs T6 + R848, Figure 1). Afin d’étudier les effets immunomodulateurs de thérapeutique disponible ex vivo, en ce qui concerne les processus précis dysrégulation immunitaire des patients spécifiques, des échantillons de sang périphérique sont traitées par un inhibiteur JAK à la thérapeutique concentration (ici, 5 uM ruxolitinib ; T6 + 5R, temps de 6 h avec 5 uM ruxolitinib), pour détecter des changements dans l’état de la maladie « intrinsèque » en réponse à la drogue (T0 vs T6 vs T6 + 5R, Figure 1). Un inhibiteur JAK a été choisi pour cette étude parce que les inhibiteurs de JAK auraient dû être divulgués pour réussir dans le traitement de maladies auto-immunes telles que RA

Evaluer simultanément les dysrégulation des processus décrits ci-dessus en plusieurs sous-ensembles de cellules immunitaires, des échantillons de sang périphérique de SLE patients et témoins sains ont été traitées comme décrit ci-dessus et analysés par cytométrie de flux massique. Cytométrie en masse, également connu sous le nom Cytometry-Time-Of-Flight, offre une analyse unicellulaires de plus de 40 paramètres sans problèmes de spectral chevauchent^7,8,9. Cette technique utilise des isotopes métalliques de terres rares sous forme d’ions métalliques solubles sous forme de balises liés aux anticorps, au lieu de fluorophores¹⁰. Des détails supplémentaires au sujet de la plateforme technologique de cytométrie de flux massique (c.-à-d., tuning et étalonnage, l’acquisition de l’échantillon) se trouvent dans Leipold et coll. et McCarthy et al. ^{11 , 12} la haute-dimensionnalité de cytométrie de flux massique permet mesure simultanée de plusieurs cytokines dans l’ensemble des sous-ensembles de cellules immunitaires innée et adaptative avec granularité unicellulaires (Table des matières).

Les paramètres cliniques et de laboratoire classiques actuels ne sont souvent pas sensibles ou suffisamment précis pour détecter l’activité en cours de la maladie ou la réponse aux immunomodulateurs spécifiques¹³, reflétant la nécessité de mieux délimiter le système immunitaire sous-jacent changements qui animent les poussées. Compte tenu de l’omniprésence de dérèglement de cytokine dans une maladie auto-immune, une multitude de méthodes de traitement qui utilisent des anticorps ou des petits inhibiteurs moléculaires ciblant les cytokines ou la signalisation des protéines impliquées dans la régulation de la production de cytokines ont récemment vu le jour. Dans son format de base, l’approche analytique de sang périphérique décrite ici fournit une plate-forme pour identifier les sous-ensembles de cellules spécifiques au patient dysrégulation et leur production de cytokines anormale dans une maladie auto-immune avec des manifestations systémiques. Cette méthodologie permet la personnalisation des choix thérapeutiques comme dysrégulation spécifique cytokines peuvent être identifiés, et un traitement spécifique peut être testé ex vivo pour évaluer leur capacité à immunomodulate la patiente maladie spécifique processus.