Eencellige analyse van Immunophenotype en Cytokine productie in perifere bloed via massale Cytometry

Auto-immune ziekten zijn een belangrijke oorzaak van morbiditeit en mortaliteit 3-8% van de bevolking. In de Verenigde Staten, auto-immune aandoeningen behoren tot de belangrijkste doodsoorzaken onder jonge en middelbare leeftijd vrouwen (leeftijden < 65 jaar)^1,2. Auto-immune aandoeningen worden gekenmerkt door heterogene Vaatwandpathologie en diverse onderliggende immunologische processen. Het spectrum van heterogeniteit is goed vertegenwoordigd in verschillende aandoeningen, zoals gezamenlijke betrokkenheid bij reumatoïde artritis (RA) en neurologische ziekte bij multiple sclerose (MS). Echter, dit niveau van heterogeniteit ook binnen een enkele stoornis, zoals systemische lupus erythematosus (SLE) wordt geïllustreerd: sommige patiënten kunnen presenteren met Renale pathologie, terwijl anderen van hematologic of gezamenlijke betrokkenheid^{3 last}.

De onderliggende immunopathogenese in auto-immune aandoeningen komt overeen met de klinische heterogeniteit, met betrekking tot auto – en hyper-activering van meerdere aangeboren en adaptieve immuun cel subsets, en daarmee gepaard gaande dysregulated cytokine productie. Hoewel cytokines een centrale rol in de pathogenese van auto-immune ziekte spelen, heeft inzicht in hun specifieke rol in het mechanisme van de ziekte bewezen uitdagend. Cytokines worden gekenmerkt door Pleiotropie (een cytokine kan het hebben van meerdere effecten op verschillende soorten cellen), redundantie (meerdere cytokines kan hetzelfde effect hebben), dualiteit (een cytokine kan pro – of anti – inflammatory effecten onder verschillende omstandigheden hebben), en plasticiteit (cytokines kan worden gegoten in een rol die verschillend van de “originele”, afhankelijk van de omgeving)^4,5,6. Bijgevolg onderscheiden niet populatieniveau methoden heterogene cellulaire reacties op de dezelfde “cytokine milieu”. Studie ontwerpen die zich richten op een specifiek aspect van het immuunsysteem (één celtype of cytokine), bieden ook niet een algemene beoordeling van alle elementen die betrokken zijn bij complexe auto-immuunziekte. Terwijl de patiënt sera gebaseerde studies veroorloofd hebben belangrijke inzichten in autoimmuniteit, bieden ze niet de specifieke cellulaire bron van de dysregulated cytokines gedetecteerd.

Onlangs, we een eencellige proteomic benadering om gelijktijdig controleren meerdere immuun celtypes, en sporen van hun verschillende cytokine verstoringen in de omgeving van de patiënt specifieke “pathogene” perifere bloed plasma circulerende factoren ontwikkeld. De hier beschreven werkstroom wordt gekenmerkt door het gebruik van intact perifere bloedmonsters, in tegenstelling tot geïsoleerde perifere bloed mononucleaire cellen (PBMCs). Perifere bloed vertegenwoordigt het meest fysiologisch desbetreffende voertuig te bestuderen van systemische immuun-gemedieerde ziekte, met inbegrip van 1) niet-mononucleaire bloedcellen vaak betrokken in de auto-immune ziekte (d.w.z., neutrofielen, bloedplaatjes), en 2) plasma factoren, zoals nucleïnezuren, immuuncomplexen en cytokines, circuleren die immuun activerend rollen hebben. Te vangen de “intrinsieke pathogene” dysregulated cytokine productie, perifeer bloed monsters worden verwerkt onmiddellijk na de loting van het bloed (T0, tijd nul), en na 6 uur incubatie bij 37 ° C (fysiologische lichaamstemperatuur) met een eiwit transport de Inhibitor van de omwenteling in het ontbreken van een exogene stimulerende aandoening (T6, tijd 6 h), om op te sporen van cytokine productie (accumulatie, T6-T0) dat bij de status van “intrinsieke” ziekte (Figuur 1 aansluiten zou). Om te studeren van dysregulated processen die weerspiegelen over of onder activering van signalering trajecten die betrokken zijn bij de immuunrespons die relevant zijn voor de ziekte, perifeer bloedmonsters zijn behandeld (6 uur incubatie bij 37 ° C met een eiwit vervoer-remmer) een exogene stimuleren van de voorwaarde dat weerspiegelt de pathogenese van de ziekte, zoals Toll-Like-Receptor (TLR) agonisten in het geval van SLE (T6 + R848, tijd 6 h met 1 µg/mL R848), op te sporen van cytokine productie die bij een reactie op nucleic zuren aansluiten zou (T0 vs. T6 vs. T6 vergelijken + R848, Figuur 1). Studeren immunomodulerende effecten van beschikbare therapeutics ex vivo, aangezien ze betrekking op de precieze immuun dysregulated processen voor specifieke patiënten hebben, worden perifeer bloedmonsters behandeld met een JAK-remmer bij de relevante therapeutische concentratie (hier, 5 uM ruxolitinib; T6 + 5R, tijd 6 h met 5 uM ruxolitinib), aan de opsporing van wijzigingen in “intrinsieke” ziekte staat naar aanleiding van de drug (T0 vs. T6 vs. T6 + 5R, Figuur 1). Een JAK-remmer werd gekozen voor deze studie omdat JAK-remmers is gebleken dat succesvol te zijn in de behandeling van auto-immune aandoeningen zoals RA.

Om tegelijkertijd het evalueren van de processen van de dysregulated in meerdere immuun cel subsets perifeer bloedmonsters van SLE hierboven beschreven werden patiënten en gezonde controles verwerkt zoals hierboven beschreven en geanalyseerd door massale cytometry. Massa cytometry, ook bekend als Cytometry-Time-Of-Flight, biedt eencellige analyse van meer dan 40 parameters zonder problemen van spectrale overlap^7,8,9. Deze techniek maakt gebruik van zeldzame aarden metalen isotopen in de vorm van oplosbare metaalionen als tags gebonden aan antilichamen, in plaats van fluorophores¹⁰. Aanvullende gegevens met betrekking tot de massa cytometry technologische platform (dat wil zeggen, tuning en kalibratie, monster overname) kunnen worden gevonden in Leipold et al. en McCarthy et al. ^{11 , 12} de hoge-dimensionaliteit van massale cytometry waardoor gelijktijdige meting van meerdere cytokines in aangeboren en adaptieve immuun cel subsets met eencellige granulariteit (Tabel van materialen).

Huidige conventionele klinische en laboratorium parameters zijn vaak niet gevoelige of specifiek genoeg is voor het opsporen van voortdurende ziekte-activiteit of het antwoord op de specifieke immunomodulators¹³, als gevolg van de noodzaak om het beter af te bakenen de onderliggende immuun wijzigingen die flare-ups rijden. Gezien de alomtegenwoordigheid van cytokine disregulatie in auto-immuunziekte, een overvloed aan behandeling benaderingen die gebruikmaken van antilichamen of kleine moleculaire remmers targeting cytokines of signalering eiwitten die betrokken zijn in de regulatie van cytokine productie hebben onlangs naar voren gekomen. In zijn elementaire vorm biedt de hier beschreven perifeer bloed analytische aanpak een platform om patiënt-specifieke dysregulated cel subsets en hun abnormale cytokine productie in auto-immune ziekten met systemische weerslag te identificeren. Deze methode zorgt voor de personalisatie van therapeutische keuzes, zoals specifieke dysregulated cytokines kunnen worden geïdentificeerd, en specifieke behandeling opties kunnen ex vivo getest te beoordelen van hun vermogen om te immunomodulate de patiënt specifieke ziekte proces.