تحليل خلية واحدة من إيمونوفينوتيبي وإنتاج سيتوكين في الدم كله الطرفية عبر الخلوي الشامل
Summary
هنا يصف لنا نهجاً البروتين وحيد الخلية لتقييم المناعة المظهرية والوظيفية (سيتوكين داخل الخلايا التعريفي) تعديلات في عينات الدم كله المحيطية، حلل عبر الخلوي الشامل.
Abstract
السيتوكينات تلعب دوراً محوريا في الآلية المرضية لأمراض المناعة الذاتية. ومن ثم تم قياس مستويات سيتوكين تركيز دراسات متعددة في محاولة لفهم آليات محددة تؤدي إلى انهيار سيلفتوليرانسي والمناعة الذاتية اللاحقة. النهج حتى الآن قد تم استناداً إلى دراسة جانب محدد من الجهاز المناعي (واحد أو بعض أنواع الخلايا أو السيتوكينات)، ولا توفر تقييما شاملا لأمراض المناعة الذاتية المعقدة. في حين أتاحت الدراسات المستندة إلى الأمصال المريض أفكاراً هامة في المناعة الذاتية، لا توفر مصدر السيتوكينات dysregulated الكشف عن الهاتف الخلوي محددة. اتباع نهج شامل في خلية واحدة لتقييم إنتاج سيتوكين في عدة مجموعات فرعية في الخلايا المناعية، في سياق “الجوهرية” الخاصة بالمريض البلازما تعميم العوامل، يرد هنا. هذا النهج يتيح رصد النمط الظاهري المناعي الخاصة بالمريض (علامات السطحية) والدالة (السيتوكينات)، أما لأن أصلي “الجوهرية المسببة للأمراض” مرض الدولة، أو في وجود العوامل العلاجية (في فيفو أو السابقين فيفو).
Introduction
أمراض المناعة الذاتية سببا رئيسيا للمراضة والوفيات التي تؤثر على 3-8 في المائة من السكان. في الولايات المتحدة، اضطرابات المناعة الذاتية من بين الأسباب الرئيسية للوفاة بين الشباب ومتوسطي العمر النساء (الإعمار < 65 سنة)1،2. اضطرابات المناعة الذاتية تتميز بعرض السريرية غير متجانسة والعمليات المناعية الأساسية المتنوعة. كذلك تمثل الطيف من عدم التجانس عبر الاضطرابات المختلفة، مثل مشاركة المشترك في التهاب المفاصل الرثياني (RA) والأمراض العصبية في التصلب المتعدد (MS). ومع ذلك، يتمثل هذا المستوى من عدم التجانس أيضا داخل اضطراب واحد، مثل الذئبة الحمامية الجهازية (SLE): يجوز تقديم بعض المرضى بأمراض الكلي، بينما يعاني الآخرون من مشاركة الدموية أو المشتركة3.
إيمونوباثوجينيسيس الكامنة في اضطرابات المناعة الذاتية مرايا التغايرية السريرية، التي تشمل وفرط-التنشيط التلقائي لعدة مجموعات فرعية الخلايا المناعية الفطرية والتكيف، وإنتاج سيتوكين dysregulated المصاحبة. بينما السيتوكينات تلعب دوراً محوريا في الآلية المرضية لأمراض المناعة الذاتية، فهم دورها المحدد في إليه المرض ثبت أن التحدي. تتميز السيتوكينات pleiotropy (سيتوكين واحد يمكن أن يكون آثار متعددة على أنواع مختلفة من الخلية)، التكرار (السيتوكينات متعددة يمكن أن يكون نفس التأثير)، وازدواجية (سيتوكين واحد يمكن أن يكون آثار برو أو مكافحة inflammatory تحت ظروف مختلفة)، واللدونه (يمكن أن يكون مصبوب السيتوكينات في دوراً مختلفاً عن واحدة “الأصلي”، اعتماداً على البيئة)4،،من56. ونتيجة لذلك، لا يميز أساليب السكان مستوى الاستجابات الخلوية غير المتجانسة لنفس “سيتوكين الوسط”. وبالمثل، لا تقدم تصاميم الدراسة التي تركز على جانب واحد من جوانب محددة في الجهاز المناعي (نوع وحيد الخلية أو سيتوكين)، تقييما شاملا لجميع العناصر المتورطة في أمراض المناعة الذاتية المعقدة. في حين أتاحت الدراسات المستندة إلى الأمصال المريض أفكاراً هامة في المناعة الذاتية، لا توفر مصدر السيتوكينات dysregulated الكشف عن الهاتف الخلوي محددة.
مؤخرا، طورنا نهجاً البروتين وحيد الخلية تقييم أنواع الخلايا المناعية متعددة في وقت واحد، والكشف عن هذه الاضطرابات سيتوكين مختلف في الوسط المريض “الممرضة” بلازما الدم الطرفية يتناقل عوامل محددة. سير العمل الموضحة هنا يتسم باستخدام عينات الدم كله الطرفية سليمة، بدلاً من خلايا الدم المحيطية المنعزلة وحيدات النوى (ببمكس). الدم كله هامشية تمثل المركبة الأكثر فسيولوجيا ذات الصلة لدراسة المرض المناعي بوساطة النظامية، بما في ذلك خلايا الدم 1) غير-وحيدات النوى غالباً ما تشارك في أمراض المناعة الذاتية (أي، العَدلات، والصفائح الدموية)، و 2) البلازما تعميم العوامل، مثل الأحماض النووية ومجمعات محصنة السيتوكينات، التي لها أدوار تفعيل المناعة. للقبض “الجوهرية المسببة للأمراض” إنتاج سيتوكين dysregulated، الدم المحيطي معالجة العينات مباشرة بعد سحب الدم (T0، الساعة الصفر)، وبعد ح 6 من الحضانة عند 37 درجة مئوية (درجة حرارة الجسم الفسيولوجية) مع نقل بروتين المانع في غياب أي شرط تحفيز خارجية (T6، ح 6 الوقت)، للكشف عن إنتاج سيتوكين (تراكم، T6-T0) التي تعكس حالة المرض “الجوهرية” (الشكل 1). دراسة العمليات dysregulated التي تعكس مدى أو التنشيط الناقص من إشارات سبل المشاركة في الاستجابات المناعية ذات الصلة بالمرض، وعينات الدم المحيطي تعامل (ح 6 الحضانة عند 37 درجة مئوية مع مثبط نقل بروتين) مع خارجية حفز شرط أن يعكس منشأ المرض، مثل عدد القتلى-مثل-مستقبلات (TLR) يضع في حالة الذئبة الحمامية المجموعية (T6 + R848، الساعة 6 ح مع 1 ميكروغرام/مل R848)، للكشف عن إنتاج سيتوكين التي تعكس استجابة للأحماض النووية (مقارنة T0 مقابل T6 مقابل T6 + R848، الشكل 1). دراسة الآثار إيمونومودولاتوري للعلاجات المتاحة السابقين فيفو، كما أنها تتصل بالعمليات الدقيقة dysregulated المناعة للمرضى محددة، يتم التعامل مع عينات الدم المحيطي مع مثبط جاك في ذات الصلة تكون العلاجية تركيز (هنا، 5 أم روكسوليتينيب؛ T6 + 5R، الوقت ح 6 مع 5 أم روكسوليتينيب)، للكشف عن التغييرات في حالة المرض “الجوهرية” في الاستجابة للدواء (T0 مقابل T6 مقابل T6 + 5R، الشكل 1). وقد اختير مثبط جاك لهذه الدراسة لمثبطات جاك قد ثبت نجاحها في علاج أمراض المناعة الذاتية مثل رع.
في نفس الوقت تقييم dysregulated العمليات الوارد وصفها أعلاه في متعددة الخلايا المناعية مجموعات فرعية، عينات الدم المحيطي من الذئبة الحمامية المجموعية معالجتها كما هو موضح أعلاه وتحليلها بواسطة الخلوي الشامل المرضى وضوابط صحية. الشامل الخلوي، المعروف أيضا قياس الوقت-الطيران، يقدم التحليل خلية واحدة من المعلمات ما يزيد على 40 دون تداخل القضايا الطيفي7،،من89. ويستخدم هذا الأسلوب نظائر المعادن الأرضية النادرة في شكل أيونات المعادن القابلة للذوبان كعلامات ملزمة للأجسام المضادة، بدلاً من فلوروفوريس10. ويمكن الاطلاع على تفاصيل إضافية فيما يتعلق بمنصة تكنولوجية الخلوي الشامل (أي ضبط ومعايرة، والحصول على عينة) في Leipold et al. ومكارثي et al. 11 , 12 العالية-أبعاد للخلوي الشامل تمكن قياس السيتوكينات متعددة في جميع أنحاء الخلية المناعية الفطرية وتكيفية مجموعات فرعية متزامنة مع خلية واحدة الحبوبية (جدول المواد).
معلمات السريرية والمختبرية التقليدية الحالية غالباً ليست حساسة أو محددة بما يكفي للكشف عن نشاط المرض الجارية أو الرد على إيمونومودولاتورس محددة13، مما يعكس الحاجة إلى ترسيم أفضل المناعة الكامنة التغييرات التي تدفع تفجر. نظراً لانتشار التقلبات سيتوكين في أمراض المناعة الذاتية، وقد حشدا نهج العلاج باستخدام الأجسام المضادة أو مثبطات الجزيئية صغيرة تستهدف السيتوكينات أو إشارات البروتينات المشاركة في تنظيم إنتاج سيتوكين ظهرت مؤخرا. في شكله الأساسي، النهج التحليلي الدم المحيطي الموصوفة هنا منبرا لتحديد مجموعات فرعية خلية dysregulated الخاصة بالمريض وإنتاج سيتوكين غير طبيعي في أمراض المناعة الذاتية مع مظاهر جهازية. تسمح هذه المنهجية لتخصيص الخيارات العلاجية كما يمكن التعرف على السيتوكينات dysregulated محددة، ومعاملة محددة يمكن أن تكون خيارات اختبار فيفو السابقين لتقييم قدرتها على إيمونومودولاتي المرض محددة المريض عملية.
Protocol
Representative Results
Discussion
هنا يصف لنا الرواية، خلية واحدة، نهج البروتين لتقييم أنواع الخلايا المناعية متعددة في وقت واحد، والكشف عن هذه الاضطرابات سيتوكين مختلف في الوسط المريض “الممرضة” بلازما الدم الطرفية يتناقل عوامل محددة. يستخدم هذا الأسلوب الدم كله الطرفية كأداة تحليلية، والخلوي الشامل كأداة لتقييم المناع?…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
نود أن نشكر إيمي بوغ برنار لها مساهمات فكرية وتعليقات مفيدة. وأيد هذا العمل ووارنج “بوتشير مؤسسة ويب جائزة البحوث الطبية الحيوية” عدد K23-1K23AR070897 من المعاهد الوطنية للصحة لايلينا W.Y. هسيه. كما أيدها عدد جائزة K12-HD000850 من يونيس كينيدي شرايفر المعهد الوطني لصحة الطفل والتنمية البشرية وولوسيل باكارد لصحة الأطفال، وجامعة ستانفورد كتسا UL1 TR001085، وأبحاث صحة الطفل جامعة معهد ستانفورد.
Materials
| Ruxolitinib | Santa Cruz | SC-364729A | Stock Conc: 10 mM; Final Conc: 5 μM |
| R848 | Invivogen | tlrl-r848-5 | Stock Conc: 1 μg/μL; Final Conc: 1 μg/mL |
| LPS-EK | Invivogen | tlrl-eklps | Stock Conc: 1 μg/μL; Final Conc: 0.1 μg/mL |
| Sterile PBS | Lonza | 17-516F | |
| Lyse/Fix Buffer | BD biosciences | 558049 | Stock Conc: 5X; Final Conc: 1X (dilute in ddH2O) |
| BD Phosflow perm/wash buffer I | BD biosciences | 557885 | Stock Conc: 10X; Final Conc: 1:10 (dilute in ddH2O) |
| RPMI | Gibco | 21870-076 | |
| Sodium Azide (NaN3) | Sigma-Aldrich | S-8032 | Stock Conc: >99.9%; Final Conc: 0.0002 |
| Protein Transport Inhibitor (PTI) | eBiosciences | 00-4980-93 | Stock Conc: 500X; Final Conc: 1X |
| DNA Intercalator | Fluidigm | 201192B | Stock Conc: 500 μM; Final Conc: 0.1 μM |
| Cell Staining Media (CSM) | PBS + 0.5% BSA, 0.02% NaN3 | ||
| MaxPar Barcode Perm Buffer | Fluidigm | 201057 | Stock Conc: 10X; Final Conc: 1X |
| 20-plex Pd Barcode Set | Fluidigm | S0014 | Stock Conc: n/a; Final Conc: n/a |
| EQ TM Four Element Calibration Beads | Fluidigm | 201078 | Stock Conc: 10X; Final Conc: 1X |
| 16% MeOH-free Formaldehyde Solution | Thermo | 28908 | Stock Conc: 16% (w/v); Final Conc: 1.6% (w/v) |
| Sterile round bottom polystyrene tubes | VWR | 60818-496 | Stock Conc: n/a; Final Conc: n/a |
| Polypropylene cluster tubes | Light Labs | A-9001 | Stock Conc: n/a; Final Conc: n/a |
| Helios CyTOF instrument | Fluidigm | Helios | All solutions to be used in CyTOF analysis need to be free of metal contamination. ddH2O is used in the preparation of any solutions should have a resistivity of at least 18.0 MΩ.cm. ddH2O and any self-prepared solutions should be stored in new plastic or glass bottles that have never been autoclaved. |
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Antibodies used for Mass Cytometry | |||
| Surface markers | |||
| CD1c | Biolegend | L161 | Mass: 161 |
| CD3 | BD | UCHT1 | Mass: 144 |
| CD4 | Biolegend | SK3 | Mass: 174 |
| CD7 | BD | M-T701 | Mass: 149 |
| CD8 | Biolegend | SK1 | Mass: 142 |
| CD11b | Fluidigm | ICRF44 | Mass: 209 |
| CD11c | BD | B-ly6 | Mass: 152 |
| CD15 | BD | HI98 | Mass: 115 |
| CD14 | Biolegend | M5E2 | Mass: 154 |
| CD16 | eBioscience/Thermo | B73.1 | Mass: 165 |
| CD19 | Santa Cruz | SJ25C1 | Mass: 163 |
| CD21 | Biolegend | Bu32 | Mass: 141 |
| CD27 | BD | L128 | Mass: 155 |
| CD38 | Fluidigm | HIT2 | Mass: 172 |
| CD45 total | Biolegend | HI30 | Mass: 89 |
| CD45RA | Biolegend | HI100 | Mass: 153 |
| CD56 | Miltenyi | REA196 | Mass: 168 |
| CD66 | BD | B1.1/CD66 | Mass: 113 |
| CD86 | Fluidigm | IT2.2 | Mass: 150 |
| CD123 | Fluidigm | 6H6 | Mass: 143 |
| CD278/ICOS | Biolegend | C398.4A | Mass: 156 |
| CD179/PD1 | Biolegend | EH12.2H7 | Mass: 162 |
| IgD | Biolegend | IA6-2 | Mass: 146 |
| IgM | Biolegend | MHM-88 | Mass: 151 |
| CXCR5 | BD | RF8B2 | Mass: 173 |
| HLADR | Biolegend | L243 | Mass: 167 |
| Cytokines | |||
| IL-1α | Biolegend | 364-3B3-14 | Mass: 147 |
| IL-1β | Biolegend | H1b-98 | Mass: 169 |
| IL-1RA | Santa Cruz | AS17 | Mass: 157 |
| IL-6 | Biolegend | MQ2-13A5 | Mass: 164 |
| IL-8 | BD | E8N1 | Mass: 160 |
| IL-12/IL-23p40 | Biolegend | C8.6 | Mass: 171 |
| IL-17A | Biolegend | BL168 | Mass: 148 |
| IL23p19 | eBioscience/Thermo | 23dcdp | Mass: 176 |
| MIP1β | BD | D21-1351 | Mass: 158 |
| MCP1 | BD | 5D3-F7 | Mass: 170 |
| IFNα | Miltenyi | LT27:295 | Mass: 175 |
| IFNγ | Biolegend | 4S.B3 | Mass: 165 |
| PTEN | BD | A2B1 | Mass: 159 |
| TNFα | Biolegend | Mab11 | Mass: 166 |
| Note: If the manufacturer is stated as Fluidigm, this antibody was purchased from Fluidigm with metal pre-conjugated. If the manufacturer is stated as other than Fluidigm, this antibody was self-conjugated using the MaxPar Multi-Metal Labeling Kit (Fluidigm Cat: 201300) according to manufacturer protocol. |
References
- Walsh, S. J., Rau, L. M. Autoimmune diseases: a leading cause of death among young and middle-aged women in the United States. American journal of public health. 90 (9), 1463-1466 (2000).
- Mak, A., Cheung, M. W. -. L., Chiew, H. J., Liu, Y., Ho, R. C. -. M. Global trend of survival and damage of systemic lupus erythematosus: meta-analysis and meta-regression of observational studies from the 1950s to 2000s. Seminars in arthritis and rheumatism. 41 (6), 830-839 (2012).
- Kaul, A., Gordon, C., et al. Systemic lupus erythematosus. Nature reviews. Disease primers. 2, 16039 (2016).
- Annunziato, F., Romagnani, S. Heterogeneity of human effector CD4+ T cells. Arthritis Research & Therapy. 11 (6), 257 (2009).
- Peck, A., Mellins, E. D. Plasticity of T-cell phenotype and function: the T helper type 17 example. Immunology. 129 (2), 147-153 (2010).
- Basso, A. S., Cheroutre, H., Mucida, D. More stories on Th17 cells. Cell research. 19 (4), 399-411 (2009).
- Ornatsky, O., Bandura, D., Baranov, V., Nitz, M., Winnik, M. A., Tanner, S. Highly multiparametric analysis by mass cytometry. Journal of Immunological Methods. 361 (1-2), 1-20 (2010).
- Ornatsky, O., Baranov, V. I., Bandura, D. R., Tanner, S. D., Dick, J. Multiple cellular antigen detection by ICP-MS. Journal of Immunological Methods. 308 (1-2), 68-76 (2006).
- Bendall, S. C., Simonds, E. F., et al. Single-Cell Mass Cytometry of Differential Immune and Drug Responses Across a Human Hematopoietic Continuum. Science. 332 (6030), 687-696 (2011).
- Bandura, D. R., Baranov, V. I., et al. Mass Cytometry: Technique for Real Time Single Cell Multitarget Immunoassay Based on Inductively Coupled Plasma Time-of-Flight Mass Spectrometry. Analytical Chemistry. 81 (16), 6813-6822 (2009).
- Leipold, M. D., Maecker, H. T. Mass cytometry: protocol for daily tuning and running cell samples on a CyTOF mass cytometer. Journal of visualized experiments : JoVE. (69), e4398 (2012).
- McCarthy, R. L., Duncan, A. D., Barton, M. C. Sample Preparation for Mass Cytometry Analysis. Journal of visualized experiments : JoVE. (122), (2017).
- Rahman, A., Isenberg, D. A. Systemic lupus erythematosus. The New England journal of medicine. 358 (9), 929-939 (2008).
- O’Gorman, W. E., Hsieh, E. W. Y., et al. Single-cell systems-level analysis of human Toll-like receptor activation defines a chemokine signature in patients with systemic lupus erythematosus. The Journal of allergy and clinical immunology. 136 (5), 1326-1336 (2015).
- O’Gorman, W. E., Kong, D. S., et al. Mass cytometry identifies a distinct monocyte cytokine signature shared by clinically heterogeneous pediatric SLE patients. Journal of Autoimmunity. 81, 74-89 (2017).
- Simonds, E. F., Bendall, S. C., et al. Extracting a cellular hierarchy from high-dimensional cytometry data with SPADE. Nature Biotechnology. , 1-8 (2011).
- Amir, E. -. A. D., Davis, K. L., et al. viSNE enables visualization of high dimensional single-cell data and reveals phenotypic heterogeneity of leukemia. Nature Biotechnology. 31 (6), 545-552 (2013).
- Bruggner, R. V., Bodenmiller, B., Dill, D. L., Tibshirani, R. J., Nolan, G. P. Automated identification of stratifying signatures in cellular subpopulations. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 111 (26), E2770-E2777 (2014).
- Levine, J. H., Simonds, E. F., et al. Data-Driven Phenotypic Dissection of AML Reveals Progenitor-like Cells that Correlate with Prognosis. Cell. 162 (1), 184-197 (2015).
- Samusik, N., Good, Z., Spitzer, M. H., Davis, K. L., Nolan, G. P. Automated mapping of phenotype space with single-cell data. Nature Publishing Group. 13 (6), 493-496 (2016).
- Spitzer, M. H., Gherardini, P. F., et al. IMMUNOLOGY. An interactive reference framework for modeling a dynamic immune system. Science. 349 (6244), 1259425 (2015).
- Fienberg, H. G., Simonds, E. F., Fantl, W. J., Nolan, G. P., Bodenmiller, B. A platinum-based covalent viability reagent for single-cell mass cytometry. Cytometry Part A. 81 (6), 467-475 (2012).
- Jansen, K., Blimkie, D., et al. Polychromatic flow cytometric high-throughput assay to analyze the innate immune response to Toll-like receptor stimulation. Journal of Immunological Methods. 336 (2), 183-192 (2008).
- Zunder, E. R., Finck, R., et al. Palladium-based mass tag cell barcoding with a doublet-filtering scheme and single-cell deconvolution algorithm. Nature Protocols. 10 (2), 316-333 (2015).
- Lai, L., Ong, R., Li, J., Albani, S. A CD45-based barcoding approach to multiplex mass-cytometry (CyTOF). Cytometry Part A. , (2015).
- Mei, H. E., Leipold, M. D., Schulz, A. R., Chester, C., Maecker, H. T. Barcoding of live human peripheral blood mononuclear cells for multiplexed mass cytometry. The Journal of Immunology. 194 (4), 2022-2031 (2015).
- Finck, R., Simonds, E. F., et al. Normalization of mass cytometry data with bead standards. Cytometry Part A. 83 (5), 483-494 (2013).
- Takahashi, C., Au-Yeung, A., et al. Mass cytometry panel optimization through the designed distribution of signal interference. Cytometry. Part A : the journal of the International Society for Analytical Cytology. 91 (1), 39-47 (2017).
