Определение маркеров вирулентность микобактерий abscessus для внутриклеточного репликации в фагоцитов
Summary
Здесь мы представляем два протокола для изучения фагоцитарной –Mycobacterium abscessus взаимодействий: скрининга мутантов библиотеки transposon для бактериальных внутриклеточный дефицит и определение бактериальной внутриклеточных транскриптом от РНК последовательности. Оба подхода обеспечивают проницательность в геномной преимущества и транскриптомики приспособления, повышения фитнес внутриклеточных бактерий.
Abstract
Что отличает от других сапрофитные микобактерий Mycobacterium abscessus является способность противостоять фагоцитоза макрофагами, человека и способность размножаться внутри таких клеток. Эти черты вирулентности оказывают м. abscessus патогенных, особенно в уязвимых хостов с базовых структурных легочных заболеваний, таких, как муковисцидоз, бронхоэктатическая болезнь или туберкулезом. Остается неясным, как больных инфицируются м. abscessus . В отличие от многих микобактерий м. abscessus не найдены в среде, но могут находиться внутри амёб, экологические фагоцитов, которые представляют потенциальный резервуар для м. abscessus. Действительно м. abscessus устойчив к amoebal фагоцитоза и интра амебы жизни, как представляется, повышение вирулентности м. abscessus в экспериментальной модели инфекции. Однако мало что известно о . м. abscessus вирулентности само по себе. Чтобы расшифровать гены, присвоении преимущество внутриклеточных жизни м. abscessus , была разработана скрининга мутантов библиотеки м. abscessus transposon. Параллельно был разработан метод добычи РНК из внутриклеточные микобактерии после совместного культуры с амебы. Этот метод был проверен и позволило последовательность всего abscessus м. transcriptomes внутри клетки; предоставление, в первый раз, глобальное представление о . м. abscessus адаптации к внутриклеточной жизни. Оба подхода дают нам представление о . м. abscessus Факторы вирулентности, которые позволяют м. abscessus колонизировать airways в людей.
Introduction
Род Mycobacterium включает видов, начиная от безвредные сапрофитных организмов до крупных патогенов человека. Хорошо известные патогенных видов, таких как туберкулез микобактерии, Mycobacterium marinum и микоз здравоохранения принадлежат к подгруппе медленно растущих микобактерий (СГМ). В отличие от подгруппы быстро-растущих микобактерий (АГР) характеризуется их способность образовывать видимые колонии в менее чем за 7 дней на носителе агар. RGM группа состоит из более чем 180 видов, главным образом не патогенные сапрофитные микобактерий. Исследования по АГР взаимодействия с их хозяевами были главным образом сосредоточены на микобактерии smegmatis и продемонстрировать, что эти микобактерий быстро устраняется бактерицидность макрофагов.
Микобактерии abscessus является одним из редких АГР, патогенных для человека и отвечает за широкий спектр инфекций, начиная от инфекции кожи и мягких тканей легких и распространение инфекции. М. abscessus считается, наряду с Mycobacterium avium, главный микобактериальной возбудителя в больных муковисцидозом1.
Различных исследований, выполненных на м. abscessus указывают, что этот микобактерии ведет себя как внутриклеточных патогенов, способные выживать бактерицидной реакция макрофагов и фибробластов в легких и кожи, которая обычно не наблюдается в RGM 2 , 3 , 4. м. abscessus анализ генома определил метаболические пути, обычно встречаются в экологических микроорганизмов при контакте с почвы, растений и водных средах, где бесплатно амёбы зачастую присутствует5. Они также продемонстрировали, что м. abscessus наделен нескольких генов вирулентности, не найден в сапрофитные и непатогенные АГР, вероятно приобретена горизонтальный перенос генов в нише, благоприятные для генетического обмена, который может собрать различные амебы резистентных бактерий.
Экспериментально один из первых поразительных результатов был наблюдения внутриклеточных рост м. abscessus в макрофагах, а что касается микобактерий туберкулеза6. М. abscessus также сопротивляется подкисление фагосомы, апоптоз и autophagy, трех основных механизмов клеточного устойчивость к инфекции2. Даже было показано, что м. abscessus удалось установить непосредственной связи между фагосомы и цитозоле, более питательные среды, которая может пользу бактериальных умножения2. Очень мало известно о геномной преимущества, которые м. abscessus обладает или приобрела возможность выживания в внутриклеточной среды. Амеба coculture является эффективным методом, который позволил изоляции многих новых амебы резистентных бактерий как Mycobacterium massiliense7,8. Способность размножаться в течение амёбы было отмечено, в модели аэрозолизации м. abscessus в мышах, которые могут наделять повышенной вирулентности до4 м. abscessus. Одна из гипотез является, что м. abscessus разработал генетических признаков, возникающих в рамках этой среды, чтобы выжить в фагоцитирующих клеток, которые отличаются от других непатогенных АГР. Эти приобретения может пользу возможность распространения и ее вирулентности в человека-хозяина.
В настоящем докладе описываются инструменты и методы для выделения геномной преимущества, м. abscessus , чтобы выжить в среде амёб, предоставленного. Для этой цели скрининга мутантов transposon м. abscessus впервые описана на штамм Acanthamoeba castellanii типа, которая позволяет идентифицировать мутант дефектных внутриклеточных роста. Также сообщается, второй скрининг в макрофагах, чтобы подтвердить, если этот дефект сохраняется в человека-хозяина. Во-вторых понять, какие механизмы использовались в . м. abscessus адаптироваться к жизни в фагоцитирующих клеток и увеличить свою вирулентность в узле животных, специально адаптированных для м. abscessus метод был разработан, после совместного культуры присутствии амёб, что позволило извлечения всего РНК из интра amoebal бактерий. Как следствие было разработано всеобъемлющее представление о . м. abscessus генов, которые требуются для внутриклеточного жизни.
Protocol
Representative Results
Discussion
Поведение м. abscessus гораздо более похож на поведение патогенных SGM таких микобактерий туберкулеза , чем любой другой микобактерий, принадлежащие РГМ2. Ключевым элементом в патогенности SGM является их способность выжить или даже размножаться внутри антиген представ…
Acknowledgements
Мы признаем значительно Pr. Эрл Рубин (Гарвардской медицинской школы, Бостон, США) за драгоценный подарок мутант библиотека и д-р Бен Маршалл (факультет медицины, Университет Саутгемптона, Великобритания) для исправления рукописи. Мы признаем значительно французской ассоциации пациента муковисцидоз «Вэнкр la Mucoviscidose» и «L’Association Грегори Лемаршалем» для их финансовой поддержки (RF20150501377). Мы также благодарим Национальное агентство для научных исследований (программа DIMIVYR (АНР-13-BSV3-0007-01) НРУ) и округов Иль (Domaine d’Intérêt мажорных Maladies Infectieuses et Emergentes) для финансирования докторантура стипендий V.L-м. Л. л является докторской диссертации от «высшего образования Ministère де et де ла исследований».
Materials
| Name of Material/ Equipment | |||
| 24-well plates | Thermofisher | 11874235 | |
| 96-well plates | Thermofisher | 10687551 | |
| Beadbeater | Bertin | Precellys 24 | |
| Bioanalyzer | Agilent | ||
| Genepulser Xcell | Biorad | ||
| Nanodrop spectrophotometer 2000 | Thermofisher | ||
| QuBit fluorometer | Thermofisher | Q33226 | |
| zirconium beads/silica beads | Biospec products | 11079101Z | Beads |
| Name of reagent/cells | |||
| Acanthamoeba castellanii | ATCC | 30010 | strain |
| Amikacin | Mylan | 150927-A | powder |
| B-mercaptoethanol | Sigma-Aldrich | M6250 | solution |
| CaCl2 | Sigma-Aldrich | C1016 | >93% granular anhydrous |
| Chloroform | Fluka | 25666 | solution |
| ClaI enzyme | New England Biolabs | R0197S | enzyme |
| Columbia agar | Biomerieux | 43041 | 90 mm |
| D-Glucose | Sigma-Aldrich | G8270 | powder |
| DMEM | Thermofisher | 11500596 | medium |
| DNase and RNase free water | Invitrogen | 10977-035 | solution |
| E. coli electrocompetent | Thermofisher | 18265017 | bacteria |
| EDTA | Sigma-Aldrich | E4884 | powder |
| Escherichia coli | Clinical isolate | personal stock | bacteria |
| Fe(NH4)2(SO4)-6H20 | EMS | 15505-40 | sulfate solution 4% aqueous |
| Fetal Calf Serum | Gibco | 10270 | serum |
| Glycerol | Sigma-Aldrich | G5516 | solution |
| Guanidium thiocyanate | Euromedex | EU0046-D | powder |
| Isopropanol | Sigma-Aldrich | I9516 | solution |
| J774.2 macrophages | Sigma-Aldrich | J774.2 | Strain |
| kanamycin | Sigma-Aldrich | 60615 | powder |
| KH2PO4 | Sigma-Aldrich | P0662 | Monobasic, anhydrous |
| LB liquid medium | Invitrogen | 12795-027 | powder |
| Lysozyme | Roche | 10837059001 | powder |
| MgSO4 | Labosi | M275 | pur |
| Microbank TM (cryotubes with beads) | Pro-Lab Diagnostic | PL.170/M | |
| Middlebrook 7H11 medium | Sigma-Aldrich | M0428 | powder |
| Middlebrook 7H9 medium | Thermofisher | 11753473 | powder |
| Müller-Hinton agar | Biorad | 3563901 | powder |
| N-Lauryl-sarcosine | Merck | S37700 416 | powder |
| Na2HPO4-7H2O | Sigma-Aldrich | S9390 | 98-102% |
| Phenol/chloroforme | Sigma-Aldrich | 77617 | solution |
| Proteinase K | Thermofisher | EO0491 | powder |
| proteose peptone | BD | 211684 | enzymatic digest of animal tissue |
| pUC19 plasmid | New England Biolabs | 54357 | plasmid |
| SDS 20% | Biorad | 1610418 | solution |
| Sodium citrate | Calbiochem | 567446 | powder |
| Thiourea | Sigma-Aldrich | 88810 | powder |
| Tris | Sigma-Aldrich | 154563 | powder |
| Trizol | Thermofisher | 12044977 | solution |
| Tween 80 | Sigma-Aldrich | P1754 | solution |
| Yeast extract | BD | 212750 | |
| Kit | |||
| AMBION DNase kit | Thermofisher | 10792877 | kit |
| DNA Agilent Chip | Agilent | 5067-1504 | kit |
| GeneJET Plasmid Miniprep kit | Thermofisher | K0503 | kit |
| PureLink PCR Purification kit | Invitrogen | K310001 | kit |
| Quant-It" assays kit | Thermofisher | Q33140/Q32884 | kit |
| T4 DNA ligase | Invitrogen | Y90001 | kit |
| TruSeq Stranded RNA LT prep kit | Illumina | 15032611 | kit |
References
- Qvist, T., et al. Comparing the harmful effects of nontuberculous mycobacteria and Gram negative bacteria on lung function in patients with cystic fibrosis. Journal of Cystic Fibrosis. 15 (3), 380-385 (2016).
- Roux, A. -. L., et al. The distinct fate of smooth and rough Mycobacterium abscessus variants inside macrophages. Open Biology. 6 (11), 160185 (2016).
- Castañeda-Sánchez, J., et al. Defensin Production by Human Limbo-Corneal Fibroblasts Infected with Mycobacteria. Pathogens. 2 (4), 13-32 (2013).
- Bakala N’Goma, J. C., et al. Mycobacterium abscessus phospholipase C expression is induced during coculture within amoebae and enhances M. abscessus virulence in mice. Infection and Immunity. 83 (2), 780-791 (2015).
- Ripoll, F., et al. Non mycobacterial virulence genes in the genome of the emerging pathogen Mycobacterium abscessus. Public Library of Science One. 4 (6), 5660 (2009).
- Tailleux, L., et al. Constrained intracellular survival of Mycobacterium tuberculosis in human dendritic cells. Journal of Immunology. 170 (4), 1939-1948 (2003).
- Jacquier, N., Aeby, S., Lienard, J., Greub, G. Discovery of new intracellular pathogens by amoebal coculture and amoebal enrichment approaches. Journal of Visualized Experiments. (80), e51055 (2013).
- Adékambi, T., et al. Amoebal coculture of “Mycobacterium massiliense” sp. nov. from the sputum of a patient with hemoptoic pneumonia. Journal of Clinical Microbiology. 42 (12), (2004).
- Rubin, E. J., et al. In vivo transposition of mariner-based elements in enteric bacteria and mycobacteria. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 96 (4), 1645-1650 (1999).
- Laencina, L., et al. Identification of genes required for Mycobacterium abscessus growth in vivo with a prominent role of the ESX-4 locus. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 115 (5), 1002-1011 (2018).
- Rowbotham, T. J. Isolation of Legionella pneumophila from clinical specimens via amoebae, and the interaction of those and other isolates with amoebae. Journal of Clinical Pathology. 36 (9), 978-986 (1983).
- Moffat, J. F., Tompkins, L. S. A quantitative model of intracellular growth of Legionella pneumophila in Acanthamoeba castellanii. Infection and Immunity. 60 (1), 296-301 (1992).
- Ripoll, F., et al. Non mycobacterial virulence genes in the genome of the emerging pathogen Mycobacterium abscessus. Public Library of Science One. 4 (6), 5660 (2009).
- Choo, S. W., et al. Genomic reconnaissance of clinical isolates of emerging human pathogen Mycobacterium abscessus reveals high evolutionary potential. Science Reports. 4, (2015).
- Greub, G., Raoult, D. Microorganisms Resistant to Free-Living Amoebae. Clinical Microbiology Reviews. 17 (2), 413-433 (2004).
- Kicka, S., et al. Establishment and Validation of Whole-Cell Based Fluorescence Assays to Identify Anti-Mycobacterial Compounds Using the Acanthamoeba castellanii – Mycobacterium marinum Host-Pathogen System. Public Library of Science One. 9 (1), 87834 (2014).
- Thomas, V., Loret, J. -. F., Jousset, M., Greub, G. Biodiversity of amoebae and amoebae-resisting bacteria in a drinking water treatment plant. Environmental Microbiology. 10 (10), 2728-2745 (2008).
- Lamrabet, O., Medie, F. M., Drancourt, M. Acanthamoeba polyphaga-enhanced growth of mycobacterium smegmatis. Public Library of Science One. 7 (1), (2012).
- Cosson, P., Soldati, T. Eat, kill or die: when amoeba meets bacteria. Current Opinion in Microbiology. 11 (3), 271-276 (2008).
- Lelong, E., et al. Role of magnesium and a phagosomal P-type ATPase in intracellular bacterial killing. Cellular microbiology. 13, 246-258 (2011).
- Ouertatani-Sakouhi, H., et al. Inhibitors of Mycobacterium marinum virulence identified in a Dictyostelium discoideum host model. Public Library of Science One. 12 (7), 0181121 (2017).
- Trofimov, V., et al. Antimycobacterial drug discovery using Mycobacteria-infected amoebae identifies anti-infectives and new molecular targets. Science Reports. 8 (1), 3939 (2018).
- Cardenal-Muñoz, E., Barisch, C., Lefrançois, L. H., López-Jiménez, A. T., Soldati, T. When Dicty Met Myco, a (Not So) Romantic Story about One Amoeba and Its Intracellular Pathogen. Frontiers in Cellular and Infection Microbiology. 7, 529 (2017).
- Delafont, V., et al. First evidence of amoebae-mycobacteria association in drinking water network. Environmental Science & Technology. 48 (20), (2014).
- Cirillo, J. D., Falkow, S., Tompkins, L. S., Bermudez, L. E. Interaction of Mycobacterium avium with environmental amoebae enhances virulence. Infection and Immunity. 65 (9), (1997).
- Stamm, L. M., et al. Mycobacterium marinum escapes from phagosomes and is propelled by actin-based motility. Journal of Experimental Medicine. 198 (9), 1361-1368 (2003).
- Groschel, M. I., Sayes, F., Simeone, R., Majlessi, L., Brosch, R. ESX secretion systems: mycobacterial evolution to counter host immunity. Nature Reviews Microbiology. 14 (11), 677-691 (2016).
- Pym, A. S., et al. Recombinant BCG exporting ESAT-6 confers enhanced protection against tuberculosis. Nature Medicine. 9 (5), 533-539 (2003).
- Hsu, T., et al. The primary mechanism of attenuation of bacillus Calmette-Guerin is a loss of secreted lytic function required for invasion of lung interstitial tissue. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 100 (21), 12420-12425 (2003).
- Smith, J., et al. Evidence for pore formation in host cell membranes by ESX-1-secreted ESAT-6 and its role in Mycobacterium marinum escape from the vacuole. Infection and Immunity. 76 (12), 5478-5487 (2008).
- Schnappinger, D., et al. Transcriptional Adaptation of Mycobacterium tuberculosis. within Macrophages. Journal of Experimental Medicine. 198 (5), 693-704 (2003).
- Fontan, P., Aris, V., Ghanny, S., Soteropoulos, P., Smith, I. Global Transcriptional Profile of Mycobacterium tuberculosis during THP-1 Human Macrophage Infection. Infection and Immunity. 76 (2), 717-725 (2008).
- Miranda-CasoLuengo, A. A., Staunton, P. M., Dinan, A. M., Lohan, A. J., Loftus, B. J. Functional characterization of the Mycobacterium abscessus genome coupled with condition specific transcriptomics reveals conserved molecular strategies for host adaptation and persistence. BMC Genomics. 17 (1), 553 (2016).
