FM sinaps Bisiklete binme boya: yüksek potasyum depolarizasyon, elektrik ve Channelrhodopsin stimülasyon karşılaştırma
Summary
Sinaptik vezikül (SV) Bisiklete binme nöronal sinapslarda, hücreler arası iletişim çekirdek mekanizması vardır. FM boya alımı ve yayın kantitatif SV endo – ve ekzositozu raporlaması birincil yoludur. Burada, biz FM1-43 Drosophila nöromüsküler kavşak (NMJ) modeli sinaps Bisiklet sürmeyi tüm uyarım yöntemleri karşılaştırın.
Abstract
FM boyalar sinaptik vezikül (SV) döngüsü incelemek için kullanılır. Bu amfipatik probları hidrofilik baş ve hidrofobik kuyruk, onları geri dönülebilir olarak girin ve membran lipid bilayers çıkmak için yeteneği ile suda çözünebilir hale var. Bu styryl boya nispeten olmayan sulu ortamda floresan, ancak plazma zarı dış broşür içine ekleme neden bir > 40 X artırmak floresans içinde. Nöronal sinapslarda içinde FM boyalar sırasında SV endositoz, neurotransmission presynaptic aşamaları görselleştirmek için güçlü bir araç sağlayarak hem içinde hem de SV havuzları arasında ticareti ve ile yayımlanan SV ekzositozu içselleştirilmiş. Bir birincil genetik glutamatergic sinaps geliştirme ve işlev nöromüsküler kavşak (NMJ), nerede FM boya görüntüleme yoğun SV dynamics mutant koşulları geniş bir alanda ölçmek için kullanılan Drosophila modeldir. Büyük sinaptik boutons için görüntüleme uygulamalarında ideal güzel bir dizi NMJ sinaptik terminal kolayca ulaşılabilir. Burada, biz karşılaştırın ve kontrast Drosophila NMJ etkinlik bağımlı FM1-43 boya alımı/release sürücü teşvik için üç yol: 1) banyo uygulama yüksek [K+nöromüsküler doku depolarize, 2) elektrot motor sinir emme için] presynaptic sinir terminal ve 3 depolarize stimülasyon) depolarizasyon ışık uyarılmış, mekansal kontrolü için channelrhodopsin versiyonlarının transgenik ifade hedef. Bu yöntemlerin her birinin yararlarını ve sakıncalarını SV döngüsü üzerinde genetik mutasyon etkileri incelenmesi için Drosophila NMJ var. Biz bu avantajları ve dezavantajları her strateji için belirli metodolojisi ile birlikte stimülasyon yaklaşım yelpazesi yardımcı olmak için görüşecek. Floresan görüntüleme ek olarak FM boyalar-ebilmek var olmak photoconverted elektron yoğun sinyalleri SV döngüsü mekanizmaları ultrastructural bir düzeyde çalışmaya transmisyon elektron mikroskobu (TEM) kullanarak görüntülenir. Biz confocal karşılaştırmalar sağlamak ve elektron mikroskobu Drosophila NMJ stimülasyon, rehber yardımcı olmak için farklı yöntemler gelecekteki deneysel paradigmalar yelpazesi görüntüleme.
Introduction
Synapse oluşumu ve genetik tedirginlikler1geniş bir yelpazede işleviyle çalışmaya Drosophila larva nöromüsküler kavşak (NMJ) glutamatergic güzel karakterize synapse modeli kullanılmıştır. Motor nöron terminal birden çok axon dalları, her biri pek çok genişlemiş sinaptik boutons oluşur. Bu geniş varicosities (ilâ 5 mikron çapında) tek tip glutamatergic sinaptik veziküller dahil olmak üzere neurotransmission makine içeren (SVs; ~ 40 nm çapında) sitozolik rezerv ve kolayca derledi havuzları2. Bu veziküller nerede ekzositozu aracılık eder glutamat nörotransmitter serbest bırakılması için transpresynaptic plazma zarı fusion site aktif bölgelerde (AZs), dock-sinaptik iletişim. Daha sonra SVs tekrarlanan exo/endositoz devredir plazma zarı öpücük tarafından işletilen geri dönüşüm veya clathrin-aracılı endositoz (CME) üzerinden alınır. Drosophila NMJ kolayca erişilebilir ve yalıtma ve SV döngüsü mutantlar karakterize için oldukça uygundur. İleri genetik ekranları kullanarak, yeni genlerin SV döngüsü3için kritik kimliği roman mutasyonlar açmıştır. Ayrıca, zaten bilinen genler ile başlayarak geriye doğru genetik yaklaşımlar yeni SV döngüsü mekanizmalar aracılığıyla fenotipleri4Bisiklete binme mutant dikkatli açıklaması aydınlatma yol açmıştır. Drosophila NMJ neredeyse SV endositoz ve ekzositozu mekanizmaları yöntemleri için optik neurotransmission sırasında Bisiklete binme parça vezikül ile dissekan için deneysel bir sinaptik hazırlık olarak idealdir.
Flüoresan işaretler bir dizi dynamics Bisiklete binme sırasında veziküller görsel izlenmesine izin, ancak ilk Mao, F., ve arktarafından sentezlenir FM boya analogları en çok yönlü vardır. 5. yapısal olarak, FM boyalar hidrofilik bir baş ve bir aromatik halka aracılığıyla spektral özellikleri veriyor bir merkez bölge ile bağlı bir lipofilik kuyruğu içerir. Bu styryl boyalar ters bölme içinde membranlar, ‘membran broşürler arasında flip-flop değil’ de hiç öyle sitozol ücretsiz ve su5‘ ten membranlar içinde çok daha floresan. Lipid bilayer içine ters çevrilebilir ekleme floresans6‘ 40-fold bir artış neden olur. Nöronal sinapslarda Klasik FM boya etiketleme deneyler sinaptik hazırlık stimülasyon depolarize sırasında boya boya SV endositoz ile yüklemek için banyo oluşur. Dış boya sonra yıkanıp ve SV döngüsü yüklü sinapslarda7görüntüye bir kalsiyum ücretsiz zil çözümünde tutuklandı. Stimülasyon boya ücretsiz banyo içindeki ikinci turunda FM yayın ekzositozu, floresan yoğunluğu azalma ölçerek takip edilebilir bir süreç aracılığıyla tetikler. Tek bir vezikül SV gruplarından veziküller yüzlerce içeren havuzlarına kantitatif izlenen6,7olabilir. İşlevsel olarak farklı SV havuzları etkinlik bağımlı seferberlik teşrih ve öpücük ve çalıştırma8,9Bisiklete binme CME vs karşılaştırmak için FM boyalar kullanılmaktadır. Yöntem uyarılmış, ayrı ayrı tahlil için spontan ve minyatür sinaptik döngüsü faaliyetleri (ile çok küçük floresan değişiklikleri algılamak ve photobleaching azaltmak için son derece hassas ekipman)10değiştirildi. Transmisyon Elektron mikroskobu11,12,13,14 elektron yoğun bir etiket içine photoconverting floresan FM sinyal tarafından ultrastructural seviyeye uzatılabilir deneyleri .
Tarihsel olarak, banyo sinaptik hazırlıkları (bundan sonra “yüksek [K+]” anılacaktır) potasyum yüksek bir konsantrasyon içinde Bisiklete binme SV ikna etmek için stimülasyon depolarize için seçtiğiniz yöntemi olmuştur; kurbağa kolinerjik NMJ5, değişen kemirgen beyin hipokampal nöronlar15, Drosophila glutamatergic NMJ modeli16,17kültürlü. Bu yüksek [K+] yaklaşımı basittir, hiçbir özel ekipman gerektirir ve bu nedenle çoğu Labs’e erişilemez ama uygulama ve veri yorumu için sınırlamalar vardır. Sinir4,5,12emme elektrot elektriksel stimülasyon kullanın fizyolojik açıdan çok daha uygun bir yöntemdir. Bu yaklaşım doğrudan presynaptic sinir uyarılması için Aksiyon potansiyeli yayılma terminal sürücüler ve sonuçları doğrudan neurotransmission işlevi13,14elektrofizyolojik deneyleri için karşılaştırılabilir, 15, ama özel ekipman gerektirir ve teknik olarak çok daha zordur. Optogenetics gelişiyle channelrhodopsin nöronal stimülasyon kullanımı kanal ifade kullanarak ikili Gal4/UAS sistem20sıkı kronolojik zamanmekansal kontrolü de dahil olmak üzere ek avantajlar vardır. Bu yaklaşım teknik olarak emme elektrot stimülasyon çok daha kolay ve çok ucuz bir LED ışık kaynağı başka bir şey gerektirir. Burada, çalışan sayımız görüntüleme FM1-hem karşılaştırmak ve bu üç farklı stimülasyon yöntemi Drosophila NMJ, kontrast için 43 (N-(3-triethylammoniumpropyl)-4-(4-(dibutylamino)styryl) pyridinium dibromide): basit yüksek [K+ ], elektrik ve yeni channelrhodopsin yaklaşımlar zorlu.
Protocol
Representative Results
Discussion
Yüksek [K+] serum fizyolojik uyarılma depolarize tarafından çok aktivite bağımlı FM boya Bisiklete binme ama büyük olasılıkla az fizyolojik29için üç seçenek en kolay yoldur. Bu basit yöntem tüm hayvan erişilebilir her hücrede depolarizes ve bu yüzden yönlendirilmiş çalışmalar izin vermez. Yerel olarak bir micropipette yüksek [K+] serum uygulamak mümkün olabilir, ama bu hala pre/postsinaptik hücre ve büyük olasılıkla synapse ilişkili glia<sup …
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Broadie laboratuvar Üyeler bu makalede katkılarından dolayı teşekkür ediyoruz. Bu eser NIH R01s MH096832 ve MH084989 b. için tarafından desteklenen ve NIH HGUGM dostluk F31 MH111144 D.L.K. için
Materials
| SylGard 184 Silicone Elastomer Kit | Fisher Scientific | NC9644388 | To put on cover glass for dissections |
| Microscope Cover Glass 22×22-1 | Fisherbrand | 12-542-B | To put SylGard on for dissections |
| Aluminum Top Hot Plate Type 2200 | Thermolyne | HPA2235M | To cure the SylGard |
| Plexi glass dissection chamber | N/A | N/A | Handmade |
| Borosilicate Glass Capillaries | WPI | 1B100F-4 | To make suction and glue micropipettes |
| Laser-Based Micropipette Puller | Sutter Instrument | P-2000 | To make suction and glue micropipettes |
| Tygon E-3603 Laboratory Tubing | Component Supply Co. | TET-031A | For mouth and suction pipette |
| P2 pipette tip | USA Scientific | 1111-3700 | For mouth pipette |
| 0.6-mL Eppendorf tube cap | Fisher Scientific | 05-408-120 | Used to put glue in for dissection |
| Vetbond 3M | WPI | vetbond | Glue used for dissections |
| Potassium Chloride | Fisher Scientific | P-217 | Forsaline |
| Sodium Chloride | Millipore Sigma | S5886 | For saline |
| Magnesium Chloride | Fisher Scientific | M35-500 | For saline |
| Calcium Chloride Dihydrate | Millipore Sigma | C7902 | For saline |
| Sucrose | Fisher Scientific | S5-3 | For saline |
| HEPES | Millipore Sigma | H3375 | For saline |
| HRP:Alexa Fluor 647 | Jackson ImmunoResearch | 123-605-021 | To label neuronal membranes |
| Paintbrush | Winsor & Newton | 94376864793 | To manipulate the larvae |
| Dumont Dumostar Tweezers #5 | WPI | 500233 | Used during dissection |
| 7 cm McPherson-Vannas Microscissors (blades 3 mm) | WPI | 14177 | Used during dissection |
| FM1-43 | Fisher Scientific | T35356 | Fluorescent styryl dye |
| Digital Timer | VWR | 62344-641 | For timing FM dye load/unload |
| LSM 510 META laser-scanning confocal microscope | Zeiss | For imaging the fluorescent markers | |
| Zen 2009 SP2 version 6.0 | Zeiss | Software for imaging on confocal | |
| HeNe 633nm laser | Lasos | To excite HRP:647 during imaging | |
| Argon 488nm laser | Lasos | To excite the FM dye during imaging | |
| Micro-Forge | WPI | MF200 | To fire polish glass micropipettes |
| 20mL Syringe Slip Tip | BD | 301625 | To suck up the axon for electrical stimulation. |
| Micro Manipulator (magnetic base) | Narishige | MMN-9 | To control the suction electrode for electrical stimulation |
| Stimulator | Grass | S48 | To control the LED and electrical stimulation |
| Zeiss Axioskop Microscope | Zeiss | Used during electrical stimulation. | |
| 40X Achroplan Water Immersion Objective | Zeiss | Used during electrical stimulation and confocal imaging | |
| All-trans Retinal | Millipore Sigma | R2500 | Essential co-factor for ChR2 |
| Zeiss Stemi Microscope with camera port | Zeiss | 2000-C | Used during channelrhodopsin stimulation |
| LED 470nm | ThorLabs | M470L2 | Used for ChR activation |
| T-Cube LED Driver | ThorLabs | LEDD1B | To control the LED |
| LED Power Supply | Cincon Electronics Co. | TR15RA150 | To power the LED |
| Optical Power and Energy Meter | ThorLabs | PM100D | To measure LED intensity |
References
- Menon, K. P., Carrillo, R. A., Zinn, K. Development and plasticity of the Drosophila larval neuromuscular junction. Wiley Interdiscip Rev Dev Biol. 2 (5), 647-670 (2013).
- Rizzoli, S. O., Betz, W. J. Synaptic vesicle pools. Nat Rev Neurosci. 6 (1), 57-69 (2005).
- Long, A. A., et al. Presynaptic calcium channel localization and calcium-dependent synaptic vesicle exocytosis regulated by the Fuseless protein. J Neurosci. 28 (14), 3668-3682 (2008).
- Kopke, D. L., Lima, S. C., Alexandre, C., Broadie, K. Notum coordinates synapse development via extracellular regulation of Wingless trans-synaptic signaling. Development. 144 (19), 3499-3510 (2017).
- Betz, W. J., Mao, F., Bewick, G. S. Activity-dependent fluorescent staining and destaining of living vertebrate motor nerve terminals. J Neurosci. 12 (2), 363-375 (1992).
- Richards, D. A., Bai, J., Chapman, E. R. Two modes of exocytosis at hippocampal synapses revealed by rate of FM1-43 efflux from individual vesicles. J Cell Biol. 168 (6), 929-939 (2005).
- Verstreken, P., Ohyama, T., Bellen, H. J. FM 1-43 labeling of synaptic vesicle pools at the drosophila neuromuscular junction. Methods Mol Biol. 440, 349-369 (2008).
- Dickman, D. K., Horne, J. A., Meinertzhagen, I. A., Schwarz, T. L. A Slowed Classical Pathway Rather Than Kiss-and-Run Mediates Endocytosis at Synapses Lacking Synaptojanin and Endophilin. Cell. 123 (3), 521-533 (2005).
- Verstreken, P., et al. Endophilin Mutations Block Clathrin-Mediated Endocytosis but Not Neurotransmitter Release. Cell. 109 (1), 101-112 (2002).
- Iwabuchi, S., Kakazu, Y., Koh, J. -. Y., Goodman, K. M., Harata, N. C. Examination of synaptic vesicle recycling using FM dyes during evoked, spontaneous, and miniature synaptic activities. J Vis Exp. (85), (2014).
- Sandell, J. H., Masland, R. H. Photoconversion of some fluorescent markers to a diaminobenzidine product. J Histochem Cytochem. 36 (5), 555-559 (1988).
- Opazo, F., Rizzoli, S. O. Studying Synaptic Vesicle Pools using Photoconversion of Styryl Dyes. J Vis Exp. (36), e1790 (2010).
- Sabeva, N. S., Bykhovskaia, M. FM1-43 Photoconversion and Electron Microscopy Analysis at the Drosophila Neuromuscular Junction. Bio-protocol. 7 (17), (2017).
- Sabeva, N., Cho, R. W., Vasin, A., Gonzalez, A., Littleton, J. T., Bykhovskaia, M. Complexin Mutants Reveal Partial Segregation between Recycling Pathways That Drive Evoked and Spontaneous Neurotransmission. J Neurosci. 37 (2), 383-396 (2017).
- Ryan, T. A., Reuter, H., Wendland, B., Schweizer, F. E., Tsien, R. W., Smith, S. J. The kinetics of synaptic vesicle recycling measured at single presynaptic boutons. Neuron. 11 (4), 713-724 (1993).
- Ramaswami, M., Krishnan, K. S., Kelly, R. B. Intermediates in synaptic vesicle recycling revealed by optical imaging of Drosophila neuromuscular junctions. Neuron. 13 (2), 363-375 (1994).
- Trotta, N., Rodesch, C. K., Fergestad, T., Broadie, K. Cellular bases of activity-dependent paralysis in Drosophila stress-sensitive mutants. J Neurobiol. 60 (3), 328-347 (2004).
- Long, A. A., et al. The nonsense-mediated decay pathway maintains synapse architecture and synaptic vesicle cycle efficacy. J Cell Sci. 123 (Pt 19), 3303-3315 (2010).
- Parkinson, W., Dear, M. L., Rushton, E., Broadie, K. N-glycosylation requirements in neuromuscular synaptogenesis. Development. 140 (24), 4970-4981 (2013).
- Brand, A. H., Perrimon, N. Targeted gene expression as a means of altering cell fates and generating dominant phenotypes. Development. 118 (2), (1993).
- Jan, L. Y., Jan, Y. N. Antibodies to horseradish peroxidase as specific neuronal markers in Drosophila and in grasshopper embryos. Proc Natl Acad Sci. 79 (8), (1982).
- Paschinger, K., Rendić, D., Wilson, I. B. H. Revealing the anti-HRP epitope in Drosophila and Caenorhabditis. Glycoconj J. 26 (3), 385-395 (2009).
- Ramachandran, P., Budnik, V. Fm1-43 labeling of Drosophila larval neuromuscular junctions. Cold Spring Harb Protoc. 2010 (8), (2010).
- Yawo, H., Kandori, H., Koizumi, A. . Optogenetics: light-sensing proteins and their applications. , (2015).
- Pulver, S. R., Pashkovski, S. L., Hornstein, N. J., Garrity, P. A., Griffith, L. C. Temporal dynamics of neuronal activation by Channelrhodopsin-2 and TRPA1 determine behavioral output in Drosophila larvae. J Neurophysiol. 101 (6), 3075-3088 (2009).
- Hornstein, N. J., Pulver, S. R., Griffith, L. C. Channelrhodopsin2 Mediated Stimulation of Synaptic Potentials at Drosophila Neuromuscular Junctions. J Vis Exp. (25), e1133 (2009).
- Britt, J. P., McDevitt, R. A., Bonci, A. Use of channelrhodopsin for activation of CNS neurons. Curr Protoc Neurosci. , (2012).
- Lin, J. Y. A user’s guide to channelrhodopsin variants: features, limitations and future developments. Exp Physiol. 96 (1), 19-25 (2011).
- Vijayakrishnan, N., Woodruff, E. A., Broadie, K. Rolling blackout is required for bulk endocytosis in non-neuronal cells and neuronal synapses. J Cell Sci. 122, 114-125 (2009).
- Honjo, K., Hwang, R. Y., Tracey, W. D. Optogenetic manipulation of neural circuits and behavior in Drosophila larvae. Nat Protoc. 7 (8), 1470-1478 (2012).
- Dear, M. L., Shilts, J., Broadie, K. Neuronal activity drives FMRP- and HSPG-dependent matrix metalloproteinase function required for rapid synaptogenesis. Sci Signal. 10 (504), (2017).
- Baldwin, M. L., Rostas, J. A. P., Sim, A. T. R. Two modes of exocytosis from synaptosomes are differentially regulated by protein phosphatase types 2A and 2B. J Neurochem. 85 (5), 1190-1199 (2003).
- Nagel, G., et al. Channelrhodopsin-2, a directly light-gated cation-selective membrane channel. Proc Natl Acad Sci U S A. 100 (24), 13940-13945 (2003).
- Pfeiffer, B. D., et al. Tools for neuroanatomy and neurogenetics in Drosophila. Proc Natl Acad Sci U S A. 105 (28), 9715-9720 (2008).
- Nagel, G., Brauner, M., Liewald, J. F., Adeishvili, N., Bamberg, E., Gottschalk, A. Light Activation of Channelrhodopsin-2 in Excitable Cells of Caenorhabditis elegans Triggers Rapid Behavioral Responses. Curr Biol. 15 (24), 2279-2284 (2005).
- Lin, J. Y. A user’s guide to channelrhodopsin variants: features, limitations and future developments. Exp Physiol. 96 (1), 19-25 (2011).
- Sullivan, K. M., Scott, K., Zuker, C. S., Rubin, G. M. The ryanodine receptor is essential for larval development in Drosophila melanogaster. Proc Natl Acad Sci U S A. 97 (11), 5942-5947 (2000).
- Narahashi, T., Moore, J. W., Scott, W. R. Tetrodotoxin Blockage of Sodium Conductance Increase in Lobster Giant Axons. J Gen Physiol. 47 (5), 965-974 (1964).
- Narahashi, T. Chemicals as tools in the study of excitable membranes. Physiol Rev. 54 (4), 813-889 (1974).
- Kuromi, H., Yoshihara, M., Kidokoro, Y. An inhibitory role of calcineurin in endocytosis of synaptic vesicles at nerve terminals of Drosophila larvae. Neurosci Res. 27 (2), 101-113 (1997).
- Seamon, K. B., Daly, J. W. Forskolin, cyclic AMP and cellular physiology. Trends Pharmacol Sci. 4, 120-123 (1983).
- Zhang, D., Kuromi, H., Kidokoro, Y. Synaptic Transmission at the Drosophila Neuromuscular Junction: Effects of Metabotropic Glutamate Receptor Activation. Slow Synaptic Responses Modul. , 260-265 (2000).
- Kuromi, H., Kidokoro, Y. The optically determined size of exo/endo cycling vesicle pool correlates with the quantal content at the neuromuscular junction of Drosophila larvae. J Neurosci. 19 (5), 1557-1565 (1999).
- Kuromi, H., Kidokoro, Y. Selective Replenishment of Two Vesicle Pools Depends on the Source of Ca2+ at the Drosophila Synapse. Neuron. 35 (2), 333-343 (2002).
- Kay, A. R., et al. Imaging Synaptic Activity in Intact Brain and Slices with FM1-43 in C. elegans, Lamprey, and Rat. Neuron. 24 (4), 809-817 (1999).
- Pyle, J. L., Kavalali, E. T., Choi, S., Tsien, R. W. Visualization of Synaptic Activity in Hippocampal Slices with FM1-43 Enabled by Fluorescence Quenching. Neuron. 24 (4), 803-808 (1999).
- Denker, A., Rizzoli, S. O. Synaptic vesicle pools: an update. Front Synaptic Neurosci. 2, 135 (2010).
- Denker, A., Kröhnert, K., Rizzoli, S. O. Revisiting synaptic vesicle pool localization in the Drosophila neuromuscular junction. J Physiol. 587 (12), 2919-2926 (2009).
- Wucherpfennig, T., Wilsch-Bräuninger, M., Gonz ález-Gait án, M. Role of Drosophila Rab5 during endosomal trafficking at the synapse and evoked neurotransmitter release. J Cell Biol. 161 (3), 609-624 (2003).
