Evaluación de la función renal en modelos de ratón de la enfermedad Glomerular

Todos los experimentos se llevaron a cabo según la legislación del Reino Unido y aprobación del Comité de ética local. Estudios en animales fueron aprobados por la Universidad de Bristol Comité de ética de investigación. 1. urinario albúmina creatinina Ratio (uACR) Nota: La uACR se utiliza para evaluar la permeabilidad de lo GFB a la albúmina. La presencia de albúmina en la orina indica aumento de la permeabilidad a través de GFB, que se normaliza a creatinina para controlar las variaciones en el flujo de orina. Albuminuria es un marcador común de la enfermedad renal crónica. Recoger la orina en la línea de base experimental y a intervalos regulares (una vez por semana a una vez mensual) hasta el extremo experimental. Establecer jaulas metabólicas ratón con agua y enriquecimiento de la dieta. Lugar de ratones (machos, de 6-8 semanas) en jaulas individuales durante 6 h en una habitación tranquila. Ratones retorno regular de la vivienda y recoger orina de jaulas vacías. Se requiere un mínimo de 50 μl.Nota: Si el ratón no produce orina en el tiempo dado, repita en el otro día en una habitación caliente. Centrifugar la orina a 500 x g durante 10 minutos recoge la orina y retener sedimentos para evaluar la pérdida del Podocito. Almacenar la orina a-20 ° C a corto plazo en este momento. Diluir la orina en el 1% de albúmina sérica bovina (BSA) en 1 x Tris tamponada con solución salina (pH 7.5 de TBS) en un 1: 500 a 1:10000 dilución, dependiendo de la severidad de la albuminuria.Nota: El volumen final debe ser > 400 μl. punto de optimizar para determinar la dilución adecuada en cada momento. Cuantificar la concentración de albúmina en orina utilizando un ratón albúmina enzimas vinculadas análisis del inmunosorbente (ELISA) por las instrucciones del fabricante. Brevemente, recubrir la placa de ELISA, que está optimizada para la Unión a proteínas, con 100 μl del anticuerpo primario de anti-ratón albúmina (10 μg/mL en 0,5 M, pH carbonato-bicarbonato 9,6) por 1 h a temperatura ambiente. Lavado exceso de anticuerpo desde los pocillos 5 veces con 1 x TBS más 0.05% Tween (pH 8.0) y añadir 200 μL de solución (1 x TBS con pH de BSA 1% 8.0) durante la noche en la temperatura de bloqueo. Lave la placa cinco veces y añadir 100 μl de los estándares (dilución seriada: 2000 μg/mL a 15.63 μg/mL en 1 x TBS con 1% BSA, pH 8.0), el espacio en blanco y las muestras por triplicado. Dejar por 1 h a temperatura ambiente y luego lavar la placa 5 veces. Añada 100 μl del anticuerpo de la detección de HRP en cada pocillo (10 ng/mL en 1xTBS con 1% BSA, pH 8.0) e incubar a temperatura ambiente durante 1 h. Lavar la placa 5 veces y añadir 100 μl de solución de sustrato enzimático a cada pocillo. Dejar la placa en la oscuridad para desarrollar durante 15 min y detener la reacción añadiendo 100 μl de ácido sulfúrico de 0,18 M (H2SO4).PRECAUCIÓN: H2por4 es corrosivo. Determinar la concentración de albúmina de cada muestra mediante la lectura de la placa a una absorbancia de 450 nm. Utilice la curva estándar para cuantificar la albúmina presente en cada muestra. Si la técnica se repite tiene un valor CV mayor que 5%, repetir el ensayo para las muestras. Por otra parte, evaluar la concentración de albúmina en orina mediante electroforesis. Añadir 5 μl de 4 x de tampón de carga de proteína a 15 μl de orina. Calentar las muestras a 95 ° C por 10 min y luego cargar en un gel Tris prefabricados de 4-12%. Correr el gel a 100 V y mancha toda la noche en azul de Coomassie según el protocolo del fabricante. Después de la proyección de imagen del gel, usar densitometría ósea para evaluar veces cambio la concentración de la albúmina en relación con el control.Nota: Si no hay bandas son observadas para la albúmina cuando se espera evaluar la concentración de proteína de la orina y ajustar el volumen de orina añadido el gel. Diluir la muestra cruda en la dH2O 1:1, 1:5 y 1:10.Nota: El volumen final debe ser > 70 μl. optimizar para determinar la dilución correcta de cada muestra. Cuantificar la concentración de creatinina urinaria usando un análisis químico según las instrucciones del kit. Brevemente, carga 20 μl de creatinina estándares, en blanco, o diluido orina en una placa bien 96 por triplicado. Determinar la concentración de creatinina de cada muestra mediante la lectura de la placa a una absorbancia de 490 nm, antes y después de la adición de la solución ácida (precaución, corrosivo; evitar el contacto con la piel).Nota: La diferencia entre los valores de absorbancia es directamente proporcional a la concentración de creatinina en cada muestra. Una curva estándar es la generación de las normas. Si la técnica se repite tiene un valor CV mayor que 5%, repetir el ensayo para las muestras. Generar la uACR (μg/mg). Normalizar los datos para el valor basal de cada ratón para representación gráfica. 2. tejido y recolección de sangre Nota: Pueden utilizarse para evaluar marcadores de expresión estructural, las proteínas y ARNm de la enfermedad renal el riñón y el tejido glomerular. La sangre puede utilizarse para evaluar los marcadores de función renal, como la creatinina, que puede ser para arriba-regulados en la enfermedad renal, indicando una reducción en la capacidad de filtración de los glomérulos. Preparar las siguientes soluciones: glutaraldehído fresco de 2.5% en cacodilato de sodio de 0.1 M (pH 7.3), paraformaldehído al 4% en el 1 x de tampón fosfato salino (PBS), solución de Ringer mamíferos (115 mM cloruro de sodio (NaCl), acetato de sodio 10 mM (CH3COONa), 1.2 mM fosfato de sodio (Na2HPO4), 25 MM bicarbonato de sodio (NaHCO3), 1,2 mM sulfato de magnesio (MgSO4), 1 mM cloruro de calcio (CaCl2), D (+) glucosa de 5.5 mM, pH 7,4) con 1% BSA y 1 x PBS.Atención: glutaraldehído al 2.5%: toxic, sensibilizador, irritante; uso en un armario del humo. 0.1 cacodilato de sodio M: tóxicos, uso en un armario del humo. 4% PFA: fijador, uso en armario de humo Preparar los siguientes materiales: Isoflurano, ácido pequeño etilendiaminotetracético (EDTA)-cubierto de tubos de sangre, agujas de 23-25G, jeringas de 5 mL EDTA revestido, frascos de vidrio de 10 mL, frascos de plástico de 10 mL, tubos de plástico de 0.5 mL, moldes de tejido desechable, hielo seco, líquido N 2, herramientas quirúrgicas de ratón y el corte óptimo medio (OCT). Coloque el ratón bajo anestesia profunda, la cual es verificada por el ratón que no responden a un pinchazo de aguja en la almohadilla del pie, utilizando una cámara de isoflurano o vías equivalente de anestesia terminal como agentes anestésicos inyectables (pentobarbital, 50 mg/kg intraperitoneal [IP]; «««Avertin, 240 mg/kg IP), o dióxido de carbono (CO2) exposición (75% CO225% O2). Sacrificar el ratón mediante punción cardiaca en el ventrículo izquierdo y recoger tanta sangre como sea posible. Transferir al tubo de sangre EDTA cubierto para hasta 4 h. Si se prefiere, ratones pueden sacrificados por dislocación cervical con cuidado de no a la ruptura de la vena yugular. Diseccionar a los riñones a través del abdomen y lavado en PBS 1 x frío de hielo. Examinar los glomérulos corticales, eliminar un polo de la corteza renal y corte en trozos de 1 mm3 . Para examinar los glomérulos profundos juxta-medular, repetir la misma técnica con el tejido de la médula. Colocar en 5 mL de solución de glutaraldehído al 2,5% en un frasco de vidrio EM. Almacenar a 4 ° C.PRECAUCIÓN: solución de glutaraldehído al 2.5%: toxic, sensibilizador, irritante; uso en un armario del humoNota: el proceso dentro de un mes para obtener los mejores resultados. Para histología, quitar el tercio superior de un riñón, para glomérulos corticales y medulares juxta estará presentes y fijar en 5 mL de paraformaldehído al 4% a 4 ° C por 24 h. traslado a 5 mL de 70% EtOH durante 24 horas antes de la inclusión en parafina.PRECAUCIÓN: 4% PFA: fijador, uso en armario de humo Para inmunofluorescencia, coloque un tercio de los riñones, para glomérulos corticales y medulares estará presentes, en el molde de tejido y la capa en octubre lugar en hielo seco para congelar y almacenar a-80 ° C. De proteínas y ARN, lugar 3 x 2 mm3 piezas de la corteza renal en tubos de plástico de 0.5 mL y complemento congelación en líquido N2. Tienda a-80 ° C. Para almacenamiento a largo plazo del tejido para el ARN, coloque el tejido en 5 volúmenes de la solución de estabilización de RNA y almacenar a-80 ° C. Para aislamiento de glomérulos, el tejido de riñón restante y coloque 5 ml de solución de Ringer mamíferos con 1% de BSA en el hielo. Preparar al tamiz glomérulos inmediatamente. 3. plasma creatinina Nota: Creatinina plasmática puede ser regulada hasta en la enfermedad renal, indicando una reducción en la capacidad de filtración de los glomérulos. Los niveles en sangre urea nitrógeno (BUN) también pueden ser evaluados, aunque el Protocolo no se describe aquí. Centrifugar la muestra de sangre a 500 x g durante 15 min a 4 ° C. Recoja el plasma, que puede ser almacenado a-20 ° C a corto plazo en este momento. Cuantificar la concentración de creatinina plasmática usando un análisis de creatinina químicos según las instrucciones arriba de creatinina urinaria en protocolo 1.11. Determinar la concentración de creatinina de cada muestra mediante la lectura de la placa a una absorbancia de 490 nm, antes y después de la adición de la solución ácida.Nota: La diferencia entre estos valores de absorbancia es directamente proporcional a la concentración de creatinina en cada muestra. Una curva estándar es la generación de las normas. Si la técnica se repite tiene un valor CV mayor que 5%, repetir el ensayo para las muestras. 4. aislamiento de glomérulos Nota: Glomérulos pueden aislarse para evaluar la permeabilidad de los glomérulos ex vivo, así como la expresión de proteínas específicas y marcadores de mRNA de enfermedad glomerular. Tomar tejido renal en solución de Ringer mamíferos con 1% BSA y diseccionar los glomérulos utilizando un estándar de tamizado técnica13. Brevemente, la pila el 70 μm (abajo), 100 μm, 125 μm, 175 μm, 250 μm y 425 μm tamices (de arriba) en un vaso de vidrio. Triturar el riñón, con un émbolo de la jeringa, en el 425 μm tamiz e introducir hielo frío mamífero solución de Ringer con 1% de BSA. Como los trozos de riñón son empujados a través de, eliminar el tamiz superior y proceder a hacer lo mismo en el siguiente. Repita hasta que sólo los 100 μm y 70 μm tamices permanecen. Transferir la cosecha glomerular conservada por 100 μm y 70 μm tamices a 10 mL de solución de Ringer mamíferos fresca con 1% BSA, en hielo.Nota: Si el número de glomérulos por solución de mL Ringer es pocos, reducir el volumen de solución de Ringer para recoger los glomérulos de los últimos dos tamices. Extraiga 5 mL de la solución que contiene los glomérulos en dos tubos separados (2,5 mL) y centrifugar a 1.000 x g durante 10 min a 4 ° C. Quite el sobrenadante y snap congelar los glomérulos en el líquido N2 antes de guardarlo a-80 ° C para la proteína y la extracción de RNA en una fecha posterior. Coloque la solución restante, que contiene glomérulos en un baño de agua a 37 ° C para la medición de la glomerular LpA / Vex vivo. Completa dentro de 3 h de la extracción del riñón. 5. permeabilidad glomerular (LpA / Vi) Nota: La glomerular LpA ensayo de V permite la medida ex vivo de la permeabilidad de los glomérulos en un ayuno de una manera reproducible. Un aumento en la glomerular LpA V indica la interrupción de lo GFB, que es sugestiva de la enfermedad renal. Configurar el glomerular LpA / V la plataforma como se describe en salmón et al10. Consulte la figura 1 para un diagrama detallado de la puesta en marcha. Preparar las siguientes soluciones: solución de Ringer mamíferos con 1% BSA (pH 7.4) y solución de Ringer mamíferos con 8% BSA (pH 7.4). Calentar a 37 ° C. Tire de Micropipetas de tubos capilares de vidrio (densidad óptica: 1,2 mm). Generar una propina de 5-8 μm abertura cortando la micropipeta bajo un microscopio. Utilizar el glomerular LpA / V la plataforma para coger intactas glomérulos individuales que están libres de la cápsula de Bowman y tubulares fragmentos en la micropipeta utilizando aspiración. Un resumen detallado de la prueba de oncometric se encuentra en el salmón y otros10. En Resumen, una vez un glomérulo es capturado y asegurado en la micropipeta succión, comenzar a grabar el video de los glomérulos en el microscopio. En primer lugar, equilibrar el glomérulo en solución de Ringer 1% de BSA durante 30 s antes de cambiar el perifusate a la solución de concentración 8% BSA Ringer para 10 s. Luego cambiar la perifusate hacia la solución de 1% BSA Ringer y detener la grabación. Lavar el glomérulo y repita el proceso para 10-15 glomérulos por ratón. Asegurar los caudales perifusate son idénticos y no rápido (10 mL/min) para no distorsionar la estructura glomerular. Medir la velocidad inicial de contracción glomerular para calcular la permeabilidad glomerular (LpA) normalizada para el volumen glomerular (V). Información detallada sobre el análisis puede encontrarse en el salmón y otros10. 6. ácido periódico de Schiff (PAS) Nota: La tinción de PAS destaca las membranas del sótano de lazos capilares glomerulares y el epitelio tubular. Permite la visualización detallada de las células glomerulares, expansión potencial y matriz mesangial y cambios potenciales de GBM (es decir, engrosamiento e irregularidades). Sección de la corteza renal parafina-encajado, PFA-fijo usando un micrótomo a 5 μm de grosor en diapositivas revestidas de poli-l-lisina. Seco a 37 ° C por 1 h. Asegúrese de la sección no contiene pliegues ni agujeros, que pueden distorsionar la morfología al microscopio. Desparafinizar correderas por incubar dos veces en xileno (precaución, irritante; uso en gabinete de humo) por 3 minutos, dos veces en 100% EtOH por 3 min y luego en el 95%, 70% y 50% EtOH durante 3 minutos cada uno, todos a temperatura ambiente. Re-hidratar las diapositivas en dH2O. Incubar los portaobjetos en solución de ácido peryódico (precaución, irritante; uso en gabinete de humo) (1 g/dL) para 5 minutos y luego enjuague los portaobjetos en varios cambios de dH2O. usan un recipiente con 100 mL dH2O a temperatura ambiente.PRECAUCIÓN: solución de ácido peryódico: irritante; uso en gabinete de humo Incube los portaobjetos en reactivo de Schiff (Parasoaniline HCl 6 g/L y sodio metabisulfito 4% en HCl 0,25 mol/L) durante 15 min a temperatura ambiente. Lave los portaobjetos en agua corriente durante 5 minutos. Contratinción con hematoxilina durante 3 s antes de enjuagar bien los portaobjetos en agua corriente durante 15 minutos.Nota: Puede requerirse alguna optimización para determinar el momento óptimo para la tinción de hematoxilina. Deshidratar el portaobjetos utilizando el reverso del Protocolo de parafina en el paso 6.2. Acabado con xileno. Aire seco diapositivas y montaje con medios de montaje con xileno. Imagen en un microscopio óptico a 400 aumentos para evaluar las estructuras glomerulares. Evaluar lo siguiente: engrosamiento e irregularidades de lo GBM, colapso de tejido fibrótico, lazos capilares, proliferación celular, esclerosis (endotelial, Podocito y mesangial y células inflamatorias que infiltran el penacho).Nota: Para una evaluación completa de la patofisiología glomerular, lesiones en el riñón deben ser evaluado, como en los túbulos. 7. transmisión microscopía electrónica (TEM) Nota: TEM permite el examen de alteraciones ultra estructurales en el riñón, como el GBM, procesos de pies del Podocito y fenestraciones endoteliales, que no son visibles con microscopía de luz. Esto es importante en los modelos donde daño renal no es tan pronunciado (es decir, sin albuminuria y anormalidades estructurales importantes). Tomar 2,5% gluteraldehdye – fijo en dados riñón y después fijar en tetraóxido de osmio 1% por 1 h. lavado en 50 mL de buffer de cacodilato 0.1m (pH 7.3) y luego 50 mL de dH2O (cambios de 3 x 15 min).Atención: glutaraldehído al 2.5%: toxic, sensibilizador, irritante; uso en un armario del humo. 0.1 cacodilato de sodio M: tóxicos, uso en un armario del humo Deshidratar con EtOH y embed en resina de Araldite. Corte las secciones de espesor de 50-100 nm y tinción con acetato de uranilo (acuoso) de 3% y la solución de citrato de plomo de Reynolds. Tome fotografías digitales sobre varias áreas de los glomérulos en 940 X, 1250 X y 6200 X para asegurarse los podocytes GEnCs, GBM y mesangio pueden identificarse. Utilizar ImageJ para analizar los glomérulos cegados. Establecer la escala para cada micrografía de 6200 X dibujando una línea entre dos puntos de distancia conocida, por ejemplo una regla. Vaya a analizar y luego ajuste escala, donde se mostrará la longitud de la línea en píxeles. Tipo en las unidades de medida y distancia conocida. Utilizar los protocolos que se indican a continuación para la medición de cada parámetro.Nota: Este análisis requiere alrededor de 1 día por ratón. Para poder estadístico adecuado, uso de las mediciones promedio de 3 glomérulos de los 3 ratones. Para GBM, inserte una rejilla fija digital (10 x 10) sobre el micrográfo de 6200 X y medir el grosor del GBM en el punto donde cruzan las líneas de rejilla del GBM. Medida de la membrana basal de la célula endotelial de la membrana de la célula del proceso de basal Podocito pie en una tangente perpendicular a la membrana celular endotelial utilizando la herramienta de línea recta. Determinar la medida media de cada glomérulo de 10 mediciones individuales. Para el número de endotelio fenestrado, medir la longitud de lo GBM en la micrografía de 6200 X y contar el número de fenestraciones endoteliales por unidad de longitud de GBM. Tomar un promedio de al menos 4 micrografías por glomérulo. Para el Podocito pie ancho proceso, inserte una rejilla fija digital (10 x 10) sobre la 6200 X micrografía. Medir el ancho de los procesos de pie Podocito que cruzan las líneas de cuadrícula. Mida el ancho en la parte más ancha del pie proceso donde cumple el GBM; Asegúrese de que la línea es perpendicular a la tangente de la membrana basal Podocito. Determinar la medida media de cada glomérulo de 10 mediciones individuales. Para Podocito anchura de la raja, inserte una rejilla fija digital (10 x 10) sobre la 6200 X micrografía. Medir el ancho de los diafragmas de abertura del Podocito que cruzan las líneas de cuadrícula. Este es el punto donde los procesos de pie son más cercanos juntos, en la parte más ancha de cada proceso de pie del Podocito membrana a membrana. Asegúrese de que la medida es perpendicular a la tangente de la membrana basal Podocito. Determinar la medida media de cada glomérulo de 10 mediciones individuales. Para el número del Podocito pie procesos, medir la longitud de lo GBM en la micrografía de 6200 X y contar el número de procesos de pies del Podocito por unidad de longitud de GBM. Tomar un promedio de al menos 4 micrografías por glomérulo. Para la cobertura de espacio sub-Podocito, vea el método detallado en Neal et al. 14. Usando las micrografías X 940, examinar glomérulos de la presencia de estructura anormal, depósitos e infiltrados por el ojo. 8. inmunofluorescencia Podocito y marcadores endoteliales Nota: Inmunotinción permite la visualización de los patrones de expresión de la proteína, como bucles capilares endoteliales, que pueden colapsar en enfermedad glomerular. Coloque el molde de OCT con riñones congelados a-20 ° C por 2 h antes del seccionamiento. Asegúrese de que la superficie del corte del riñón se coloca cuidadosamente sobre el fondo del molde de OCT para permitir que las secciones de tejido bien orientada. Con un criostato, tejido de sección en un grueso de 5 μm a poly-L-lisina había revestido diapositivas.Nota: Asegúrese de que no hay pliegues ni agujeros en la sección de tejido, que puede distorsionar la morfología. Sobre retiro de criostato, arreglar diapositivas en el 4% PFA 10 min lavado desliza 3 veces, 5 minutos en un recipiente con 100 mL de dH2O.PRECAUCIÓN: 4% PFA: fijador, uso en armario de humo Para minimizar la cantidad de anticuerpo utilizado, dibujar en secciones con un lápiz hidrofóbico. No deje que las secciones en seco. Incubar en el bloqueo de solución (BSA 3% y 5% de suero normal de 1 x PBS) durante 1 h a temperatura ambiente. Retire la solución de bloqueo con un aspirador e Incube secciones con anticuerpo primario (Nephrin, podocin o PECAM-1) diluido 1: 250 (3% de BSA en PBS 1 x). Coloque los portaobjetos en una cámara humidificada a 4 ° C durante la noche. Si no hay una cámara húmeda, ligeramente Coloque una pequeña tira de parafilm sobre el portaobjetos recubiertos de anticuerpos. Tenga cuidado al quitar el día siguiente en cuanto a no interrumpir la sección. Lavar portaobjetos 3 veces, 5 minutos en PBS 1 x. Incubar con el anticuerpo secundario fluorescente apropiada dilución 1: 1000 (3% de BSA en PBS 1 x) por 2 h a temperatura ambiente en la oscuridad. Lavar portaobjetos 3 veces, 5 minutos en PBS 1 x. Montaje con montaje de medios que contienen DAPI fluorescente. Diapositivas de imagen con un microscopio de fluorescencia con 400 aumentos para ver los glomérulos. Asegurar que esto es ciego para evitar sesgos. Uso ImageJ para analizar la intensidad de la tinción, normalizada a la zona glomerular y el patrón de coloración, es decir, el número de lazos capilares normalizada a la zona glomerular, de una manera ciega. 9. proteína extracción y Western Blotting Nota: Western Blot nos permite valorar las proteínas expresión sabidas que altera en la enfermedad renal. Por ejemplo, una reducción en la expresión podocin y nephrin indica pérdida del Podocito. Extracto de proteína de la corteza renal y glomérulos tamizados; el protocolo es el mismo para cada uno y el volumen de tampón de lisis se regula por la cantidad de tejido. Riñón/glomérulos de deshielo en hielo antes de agregar NP-40 lisis tampón que contiene inhibidores de proteasa y fosfatasa (150 mM NaCl, 1% NP-40, 50 mM Tris pH 8). Homogeneizar la muestra durante 30 s. Incubar las muestras homogeneizadas en hielo durante 30 minutos, Vortex a intervalos regulares. Centrifugar las muestras a 10.000 x g durante 15 min a 4 ° C. Quite el sobrenadante a un tubo fresco en hielo.Nota: esperar recuperar aproximadamente 1 mg de proteína por muestra. Desnaturalizar las proteínas usando el buffer estándar de x Laemmli 4. Hervir la mezcla a 95-100 ° C durante 5 minutos. Evaluar la expresión de proteínas marcadoras de células glomerulares (Nephrin Podocin, PECAM-1, etcetera.) y la fosforilación y la expresión de proteínas conocido/la hipótesis de modificarse en el riñón/glomérulos del modelo de enfermedad mediante Western blot) método estándar; Mahmood y Yang15).Nota: El protocolo varía dependiendo del tamaño y abundancia de la proteína de interés. 10. ARN extracción y reacción en cadena de polimerasa (PCR) Nota: Análisis de la expresión de mRNA nos permiten determinar cómo genes están regulados en la enfermedad renal, tales como cambios en la expresión génica y splicing alternativo. Mientras que la corteza del riñón todavía está congelada, moler completamente en 3 mL de reactivo de fenol utilizando un mortero y Maja. Si utiliza extractos glomerulares, añadir 1 mL de reactivo de fenol y homogeneizar la muestra durante 30 s.PRECAUCIÓN: Reactivo de TRIzol: irritante; uso en gabinete de humo Realizar una extracción de RNA usando el método descrito por Chomczynski y Sacchi16.Nota: Los kits de extracción de RNA comerciales están disponibles como una alternativa a este método. Evaluar la cantidad y calidad del ARN obtenido mediante uno de los varios métodos disponibles. ARN es alícuotas y almacenados a-80 ° C en este punto. Evitar repetición congelación descongelación.Nota: Si a este método, Compruebe la calidad del ARN antes de proceder al siguiente paso ejecutando el RNA en un gel de agarosa para garantizar una banda ribosomal 18S y 28S claro. Espera recuperar entre 2 a 5 μg de ARN utilizando este método. DNasa tratar 1 μg de ARN (volumen de hacer hasta 10 μl con agua libre de ARNasa y 1 μl de DNasa y 1 μl de tampón de DNasa) por 1 h a 37 ° C. Detener la reacción con 1 μl de solución ADNasa a 65 ° C durante 10 minutos. Añadir 0,5 μl de oligo (dT) y las cartillas al azar. Incubar a 70 ° C durante 10 minutos. Apagar inmediatamente en hielo durante 5 minutos. Agregar lo siguiente; Enzima de la transcriptasa inversa MMLV (400 U; reemplazar con DEPC H2O en el RT – muestra de control), tampón MMLV (1 x), dNTP mix (0.5 mM) y ribonucleasa inhibidor (40 U); hacer hasta 50 μl de agua DEPC. Incubar la mezcla de reacción a 37 ° C durante 1 h seguida de 95 ° C durante 5 minutos desactivar la enzima.Nota: Para generar un rendimiento superior de cDNA, incubar a 37 ° C durante 3 h. Evaluar la cantidad y calidad del cDNA usando los varios métodos disponibles. La hipótesis de uso PCR para evaluar los patrones de expresión y empalme del mRNA de genes que existen en el modelo de enfermedad glomerular. El protocolo varía dependiendo del gen de interés.