Rejenerasyon Stentor içinde çalışma yöntemleri

1. kültür Stentor ve tek hücre veya hücre parçaları Stentor kültürler oluşturma Chlamydomonas reinhardtii kültür Stentorgıda olarak kullanılmak üzere hazırlayın. Chlamydomonas reinhardtii hücreleri ticari bir tedarikçiden (Tablo reçetesi) edinin. Chlamydomonas reinhardtii 500 mL sıvı kültürünün steril tekniği13kullanarak ticari olarak mevcut musluk medyada kurmak. Chlamydomonas kültür altında bir lamba Doygunluk (at doz yaklaşık 1) yakınındaki bir konsantrasyon haftada iki kez dokunun medya ile sulandrarak tutun.Not: Chlamydomonas kültür bir shaker üzerinde yetiştirilen olabilir. Düzenli olarak Chlamydomonas kültür kültür bir damla bir slayt üzerinde bir coverslip ile kapsayan koyup 40 X büyütme, mikroskop altında kontrol sağlıklı olup olmadığını denetleyin.Not: kültür bakteri ile kontamine yoksa Chlamydomonas hücreleri kümeler halinde toplanan Stentor beslenmesi için kullanmayın. Bu sorunların her iki durumda da yeni bir Chlamydomonas kültür başlatın. Stentor coeruleus hücreleri ticari bir tedarikçiden (Tablo reçetesi) edinin. Stentor hücreleri onların doğal habitat gerekiyorsa, gölet, göl veya nehir11koleksiyon yapıyorum. Gölet, göl veya nehir Stentor toplamak için suyun nispeten sakin, gölgeli ve açık olduğu bir alan bazı bitki örtüsü ile bulmak.Not: Burada duckweed büyür adreslerde Stentor bulma daha yüksek bir olasılık vardır. En az 2 lt su pour kolaydır bir kap içinde toplamak. Döküntü ve partiküler madde kabın altına yerleşmiş sonra yavaşça Stentorbirkaç saniye sonra her koleksiyonu büyük konteyner yerleşmek döküntü için bekleyen için incelemek için birkaç küçük kaplar doldurun. Örnekleri topluluğu bir konumda tamamlandıktan sonra en az 10 metre uzaklıktadır yeni bir konuma geçin ve orada örnekleri topluluğu.Not: birden fazla gölet tatmak zorunda kalabilirsiniz Stentor Vaha’da her gölet bulunmaktadır. Örnekleri ile laboratuvara dönmek ve su kaplarından bireysel Petri yemekler aktarın. Her kabında Stentor için bir stereomicroscope 5 X büyütme, eğik ışık altında arayın. Piyasada bulunan pastörize kaynak suyu (PSW) en az 100 µL içeren bir cam spot levha bir kuyunun içine 1 mL pipet kullanarak tek tek Stentor hücreler aktarın.Not: bir substrat (Şekil 1) bağlandığında bir trompet gibi şekil Stentor hücreleri var. Yüzme Stentor bir substrat (Video 1) bağlı hücreler daha az genişletilmiş hücrelerdir. Stentor PSW en az 3 yıkama x. Kuyuda Stentor hücreleri tutarak kuyudan su yaklaşık yüzde 90’ını kaldırarak yıkar gerçekleştirmek PSW 500 µL kuyunun içine ekleyerek izledi.Not: pipetler pipet ipuçları 10 µL veya daha küçük ile kullanarak Stentor tutmadan önce yaklaşık 0,5 mm pipet ucu hücreleri aracılığıyla büyük hücreli akar gibi oluşturulan kesme kuvvetleri nedeniyle yaralama önlemek için makas ile sonu kapalı kesmek çok küçük bir ipucu op ening. Chlamydomonas her Stentorbesleme önce hazırlayın. Chlamydomonas kültür 1.5 mL microcentrifuge tüp içine adım 1.1 olduğu gibi hazırlanan 1 mL aktarın. 2,095 x g 3 dk de santrifüj kapasitesi. Süpernatant kaldırmak ve Pelet PSW 1 mL resuspended. 2,095 x g 3 dk. Kaldır süpernatant de santrifüj kapasitesi ve Pelet PSW 500 µL içinde resuspend.Not: Böylece, yıkanmış ve konsantre Chlamydomonas “Chlamydomonashazırlanan” aşağıdaki adımlarda sevk edilecek. DOKUNUN medya önce Stentor besleme önemlidir böylece Chlamydomonas yıkama Stentoriçin zararlı olduğunu. Klonal Stentor kültür gerekirse kültür tek bir Stentor hücre veya bir hücre parçası başlatın. Bu yana tek Stentor hücreleri de PSW büyümek değil, klimalı ortam medya bir varolan, sağlıklı Stentor kültüründen 500 µL sterilize filtre hazırlayın. Klimalı ortam 500 µL bir cam spot levha kuyu birine aktarın. Bir Stentor şartına ortamı içeren cam spot kalıbının kuyuya aktarın. Transfer yapmak için mümkün olduğunca küçük orta olarak kullanın. Hazırlanan Chlamydomonas her Stentor 5 µL her 48 h besleme. Stentor böldüğünüzde, iyi hücreleri saymak ve hazırlanan Chlamydomonas hücre başına 5 µL ekleyin. Hücrelerin ışıkta (örneğin, şeffaf plastik kutular kağıt havlu ile kaplı) duyarlı olduğundan Stentor gölgeli bir yerde saklayın. Taze şartına orta her 96 h ile iyi Stentor ortam değişimi. Adım 1.5.1 olduğu gibi temiz klimalı ortam hazırlamak. Tüm Stentor hücreler sıvı yukarı ve aşağı kuyuda pipetting hafifçe tarafından kuyunun dibinden bağlantısını kesin olun. Dikkatle de kullanarak tüm hücreleri kuyuda kalır emin bir 1 mL pipet sıvı Aspire edin. Taze şartına medya 500 µL kuyuya ekleyin. İyi hücre sayısı 20 aşarsa, hücreler daha büyük konteyner için örneğin, bir geniş ağız cam kavanoz geçiş yapar. Bir autoclaved geniş ağız cam kavanoza PSW 20 mL ekleyin.Not: Cam Stentor için ısıyla dikkatli yıkama ve durulama ile değiştirilebilir. Dikkatli bir şekilde medya yukarı ve aşağı kuyunun tüm hücrelerden ayırmak için iyi pipette. 1 mL pipet ucu kullanarak tüm Stentor hücreleri toplamak ve hafifçe cam sürahi aktarmak. Kültürlerle yeterli hava erişmesine izin vermek için Stentor , kavanoz kapakları sıkın değil. PSW kavanoz her 48 h Stentor yoğunluğu yaklaşık 20 hücre/mL tutmak için ekleyin. Hücre yoğunluğu göz tarafından tahmin ediyoruz.Not: Alternatif olarak, 1 mL pipet kabarcık hava için kavanoza duvarlarından pipet kültür, 1 mL kadar bağlantısını kesin ve Pipet Ucu hücreleri saymak hücreleri olun Her 48 h, yem Chlamydomonas Stentor kültürler (bkz. Adım 1.4) kavanoz hazır. Kültür ile hazırlanan Chlamydomonas200 µL besleme ile başlayın. Kültür hacmi arttıkça, yavaş yavaş hazır Chlamydomonas ilâ 1 mL beslemek için kullanılan miktarını artırın. Kültür birimi jar’ın kapasitesi yaklaşık yüzde 90’ını ulaştığında kültür daha büyük bir kaba aktarın. Kültür kavanoz içinde yukarı ve aşağı, camdan Stentor ayırmak için 1 mL pipet ile pipette. Kavanoz tüm içeriğini 2 bardak cam kap içine dökün. Yaklaşık 25 mL PSW kalan Stentortoplamak için 2 su bardağı cam kaba olan durulayın. 2 bardak Cam kaplarda sağlıklı kültürleri korumak. Stentor kültürler hazırlanan Chlamydomonas Kültür 100 mL başına 2 mL her 4-5 günde besle. PSW Stentor yoğunluğu yaklaşık 20 hücre/mL tutmak için her 4-5 gün cam kaba ekleyin.Not: 450 mL 2-cup kapsayıcı tutan en fazla birimdir. Haftada bir kez, kültürler diseksiyon mikroskop Wrotek, mantar ve diğer büyüme için X 5 altında inceleyin. Sağlık Kültür uzatmak için bulaşıcı mikroorganizmalar ile birlikte anormal şekilli ve renksiz Stentor hücreleri 1 mL pipet kullanarak kaldırın. Cam kap dolu olduğunda, kültür bölün. PSW 25 mL Cam kaba ekleyin. 25 mL pipet pipet yukarı ve aşağı Stentor camı ayırmak için kullanın. Yeni bir 2 bardak cam kap içine taşımak hakkında -kültür. Her iki kültürler için 25 mL PSW ekleyin ve iki kültür iletişim kuralının bu bölümde açıklandığı gibi korumaya devam etmeyi planlıyor.Not: Stentor hücreleri yüksek sıcaklığa duyarlı olduğundan, kültürler saklandığı Oda sıcaklığı 25 ° C veya daha düşük korumak. Alternatif olarak, kültürlerin bir kuluçka makinesine tutulabilir. Stentor kültür sorun giderme için Tablo 1 ‘ e bakın. 2. inducing rejenerasyon kesme Stentor hücreleri tarafından Kılcal tüpler gibi program kullanarak üzerinden birkaç iğne yapmak için bir iğne çektirmenin kullanın: ısı – 735, çekme – 100, hız – 110, zaman – 150, basınç – 400. PSW 50 mL % 4 methylcellulose çözeltilerine hazırlayın. Methylcellulose 1 g ekleyin (viskozite: 1500 cP) PSW 50 ml. Methylcellulose dağılması kolaylaştırmak en az 8 h için 4 ° C’de kuluçkaya. %4 methylcellulose çözüm oda sıcaklığında tutmak. Bir cam spot levha kesim gerçekleştirdikten sonra hücre parçaları saklamak için hazırlayın. Filtre sterilize sağlıklı bir kültür, 500 mL Cam spot levha de gerekli başına ortamdan. 500 mL steril ortam her gerekli Wells aktarın. (Tanımlanmış trompet şekli, canlı mavi-yeşil renk ve hiçbir büyük boşluklara sahip) bir sağlıklı Stentor 2 µL damlacık içinde toplamak ve bir coverslip veya slayt üzerinde yerleştirin. 2 µL % 4 methylcellulose (Şekil 2) ekleyin. Stentor (Video 2) kesmeden önce sakin ol bırak. Cam iğne iğne kırılma önlemek mümkün olduğunca kesme yüzeyine paralel olarak tutun. Bir stereo diseksiyon mikroskop kullanarak, cam iğne ucu bulun ve taşımak daha yakın hücreye (Şekil 3A). Stentor sözleşme temas üzerine iğne (Şekil 3B ve C) ile gözlemlemek.Not: ön sonunda zor posterior ucundan ayıran yapar bir yönde hücreyse çok yavaşça iğneyi tarafıyla döndürün. Cam iğne yan ile sözleşmeli Stentor üzerinde iki hücreyi kesmek için hafifçe bastırın(şekil 3D ve E, Video 3). İki parça parça füzyon önlemek için aralarında sitoplazmik hiçbir bağlantı sağlamak ayrı hareket (Şekil 3F). Her iki parçaları en az bir macronuclear her parçaları eğik aydınlatma diseksiyon mikroskop altında incelenerek donanıma sahip olup olmadığını kontrol edin.Not: en az bir macronuclear düğüm olan hücre hayatta kalmak için gereklidir. Hücre mavi-yeşil pigment ile birlikte onun film tabakası (şeffaf kabuk) sırasında veya sonrasında kesme dökmek. Çoğu durumda, bu hücrenin uzun vadeli canlılığı etkilemez. Parçaları adım 2.3 hazırlanan bir cam spot levha kuyu içine taşıyın. Kesme hücreleri bir kısmını değil yenileyecek çünkü birden çok hücre kesmek. Bir oturumda birden çok kesim yapmak Eğer cam iğne yerine ağır Stentor kalıntı veya ucu kırık ne zaman ile kaplı olur. Alternatif olarak, iğne silikon spacer bir parçasına nazikçe silerek temizleyin.Not: Cam iğneler birden çok hücre kesme oturum için kullanılabilir. Hücre parçaları ile cam spot levha nem odasında tutun. Bölüm 4 görüntüleme hakkında ayrıntılı bilgi için iletişim kuralı ve Stentor rejenerasyon sonuçları yorumlanması için devam edin. 3. Membranellar grubu ve sukroz veya üre tedavisi Oral aparatı rejenerasyon inducing Sükroz kullanarak Membranellar band ve oral aparatı kaldırma Sükroz PSW içinde % 25 çözeltisi hazırlamak. % 25 sukroz 500 µL ek kapaklı bir microcentrifuge tüp içinde PSW ekleyin. 3 microcentrifuge tüpler PSW 1 mL her tüp ile ek kapaklar ile hücreleri sükroz tedavi sonrası yıkama için hazırlayın. 30-60 Stentor hücreler kültür ortamlarına 1 ml 1 mL pipet (Şekil 4, ok A) kullanarak bir ayrı microcentrifuge tüp içine toplamak. Tüm hücreleri 200 µL pipet tek beraberlikle kullanarak 125 µL son hacim tüpte toplamak. Onları (3.1.2 adımda hazırlanan) % 25 sukroz 500 µL ile tüp 625 µL % 20 sükroz çözüm (Şekil 4, ok B) elde etmek için transfer. Bir kronometre başlatın. Bu % 20 sükroz çözüm ve fiske-spin raf için 1 dk microcentrifuge tüpte Stentor kuluçkaya. Tek bir beraberlik tüm hücrelerde toplamak (daha kolay koleksiyonu için 200 µL maksimum kapasite için pipet ayarlayın). Kronometre sükroz tedavi 2 dk gösterir kadar hücreleri pipet ucu tut. Bir adımda 3.1.3 (Şekil 4, ok C) hazırlanan microcentrifuge tüpler içine Stentor çıkarma. Fiske-spin tüp raf. İki kez daha, bir kez her microcentrifuge tüpler PSW içeren kalan iki adım 3.1.3 (Şekil 4, okları D ve E) hazırlanan hücreleri yıkayın.Not: Tek beraberlik hücre toplama tekniği yıkar arasında önemli değildir. Bölüm 4 görüntüleme hakkında ayrıntılı bilgi için iletişim kuralı ve yorumu Stentor rejenerasyon dinamiklerinin (Şekil 4, okları F ve G) için devam edin. Üre kullanarak Membranellar band ve oral aparatı kaldırma PSW %4 üre çözeltisi hazırlamak. 300 µL % 4 üre ek kapaklı bir microcentrifuge tüp içinde PSW ekleyin. 3 microcentrifuge tüpler PSW 1 mL hücreleri üre tedaviden sonra yıkamak için her tüp içeren ek kapaklar ile hazır olun. 30-60 Stentor hücreler kültür ortamlarına 1 ml 1 mL pipet (Şekil 4, ok A) kullanarak bir ayrı microcentrifuge tüp içine toplamak. Tüp içinde 300 µL son Hacim 1 mL pipet tek beraberlikle kullanarak tüm hücreleri toplamak. Onları 300 µL % 4 üre (3.2.2. adımda hazırlanan) ile tüp 600 µL % 2 üre çözüm (Şekil 4, ok B) elde etmek için transfer. Bir kronometre başlatın. Bu % 2 üre çözüm ve fiske-spin raf için 1 dk microcentrifuge tüpte Stentor kuluçkaya. Tek bir beraberlik tüm hücrelerde toplamak. Kronometre üre tedavi 2 dk gösterir kadar hücreleri pipet ucu tut. Bir adımda 3.2.3 (Şekil 4, ok C) hazırlanan microcentrifuge tüpler içine Stentor çıkarma. Fiske-spin tüp raf. İki kez daha, bir kez her microcentrifuge tüpler PSW içeren kalan iki adım 3.2.3 (Şekil 4, okları D ve E) hazırlanan hücreleri yıkayın.Not: Tek beraberlik hücre toplama tekniği yıkar arasında önemli değildir. Bölüm 4 görüntüleme hakkında ayrıntılı bilgi için iletişim kuralı ve yorumu Stentor rejenerasyon dinamiklerinin (Şekil 4, okları F ve G) için devam edin. 4. görüntüleme ve hücre yenilenmesini analiz İdam dik bir mikroskop kullanarak kullanıyorsanız görüntü yeniden oluşturulmasını tek tek hücreler için damlacık yöntemi. PSW 100 µL cam spot kalıbının kuyuya koymak. Kültür ortamının (içinde bulundukları ortam) 4 µL 1 Stentor hücrede izole, 10 ya da 20 µL kullanarak pipet. 22 x 22 mm2 coverslip (Şekil 5) ortasında damlacık Kasası.Not: hücreleri bu 1) sağlıksız olup olmadığını (anormal şekilli veya ağır vacuolated) ya da 2) hala membranellar bant veya oral için aygıtlar (kimyasal tedavi deneyleri için) varsa, görüntüleme için kullanmayın. Stentor 4 daha fazla damlacıkları önceki damlacık çevresinde kültür medyada damlacıklar arasında yeterli boşluk bırakarak düzenleyin. Coverslip damlacıkları ile ters çevir ve hafifçe PSW adım 4.1 içinde eklendiği cam spot levha kuyusu üzerine getirin. Not: PSW iyi (Şekil 5) damlacıkları buharlaşma en aza indirmek olacaktır. Kalan hücreleri adımları 4.1.1 – 4.1.4 izleyerek görüntüleme için hazır olun. İstediğiniz zaman çözünürlüğü ile mikroskop altında Yenileyici hücreleri görüntü. Alternatif olarak, bir diseksiyon stereo mikroskop kullanarak rejenerasyon gözlemlemek.Not: Hücre kesme veya sukroz veya üre ile tedavi hemen sonra yeniden oluşturma işlemi başlar. Ancak, görünür yeni ağız yapıları yeniden oluşturma işlemi başlangıç sonra yaklaşık 3 h oluşturacak. Her zaman noktası için yeniden oluşturma işlemi etapları birini her hücreye atayın. Bunu yapmak için her hücreye aşamaları (Şekil 4 ve Şekil 6) gösteren temsili resim karşılaştırın. Aşama 1 bir membranellar Grup henüz (Şekil 6A) var mı hücrelere atayın. Stage 2 membranellar grubu ile hücrelere atayın.Not: Bir membranellar Grup 3-6 h (Şekil 4, Şekil 6B) tedaviden sonra görünür. Sadece bir oral primordium görüntülenmeden önce bu sahne çok sonunda membranellar grubun posterior sonuna ek bir eğimi görünür. Stage 3 bir oral primordium hücrelerle atayın.Not: Bir oral primordium 6-8 h membranellar grubu (Şekil 4, Şekil 6C ve 6 D) posterior sonundaki tedaviden sonra görünen bir invagination var. Hücreleri ön bitiş ve karakteristik trompet hücre şekil (Şekil 4, Şekil 6E) adlı bir membranellar orkestra varken yeniden oluşturma işlemi tamamlandı. En Stentor hücreler tamamen yenilenme başlangıcından bu yana içinde 8-9 h yeniden oluşturulur. Her birine bir yığın kutu arsa (Şekil 7) şeklinde her zaman için yeniden oluşturma işlemi aşamaları yüzdesi arsa.Not: Bu tür bir arsa Vaha’da hücreleri rejenerasyon dinamiklerinin görselleştirme sağlar.